ШТАММ БАЗИДИАЛЬНОГО ГРИБА Trametes hirsuta (Wulfen) Pilát- ПРОДУЦЕНТ ГОЛУБОЙ ЛАККАЗЫ Российский патент 2009 года по МПК C12N9/58 C12N1/14 C12R1/645 

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма-продуцента внеклеточной лакказы.

Наиболее эффективно настоящее изобретение может быть использовано при производстве ферментных препаратов лакказы для текстильной, пищевой, косметической, деревообрабатывающей промышленностей и органического синтеза.

Предшествующий уровень техники

Лакказа (КФ 1.10.3.2 п-дифенол: кислород оксидоредуктаза) относится к классу оксидаз, восстанавливающих молекулярный кислород непосредственно до воды без образования каких-либо кислородных интермедиатов.

Известно использование лакказы для обработки целлюлозно-бумажной пульпы (Патент РФ №2001125920, 2004.02.20, С08В 11/145; патент США 6,610,172, August 26, 2003). Известно использование лакказы в текстильной промышленности для обработки льна, обесцвечивания и окрашивания хлопковых тканей (Патент РФ №96103261, 1998.05.10, D01C 1/04; патент РФ №94008821, 1995.10.27, D06L 1/14, D06M 16/00; патент США №6,805,718, October 19, 2004, D06P 001/32, D06M 016/00; патент РФ №2000119782, 2002.09.27, C12S 11/00; патент РФ №2148111, 2000.04.27, C12S 3/06, D01C 1/02; патент РФ №96107218, 1998.06.10, C12S 3/00, D21C 3/00).

Известно использование лакказы в органическом синтезе (Патент РФ №2001125922, 2005.03.10, С12Р 1/00, С12Р 19/00, С12Р 13/00, С12Р 7/24, С07С 45/29-39, С07Н 3/00, С07Н 5/04; патент США №6,190,891, 2001. 02.20, С12Р 013/00; в косметической промышленности в качестве агента для окрашивания волос (Патент Франции №2112549, 2002, А61К 7/13; патент РФ №2203028, 2003.04.27, А61К 7/13; патент РФ №200112877, 2003.07.10, А61К 7/13; патент №224501, 2004.02.27, А61К 7/13; патент РФ №2193392, 2002; патент РФ №22005339, 2003; патент РФ №2203028, 2003.04.27, А61К 7/13; патент РФ №2000121095, 2002.07.20, А61К 7/13)); для производства отбеливающей зубной пасты, производства моющих средств (Патент США №6,815,410, November 9, 2004, C11D 017/00); для биодеградации ксенобиотиков (Патент США №6,395,534, May 28, 2002, C12N 001/18); для создания антимикробных композиций (Патент США №20010025018; патент США №6,592,867, July 15, 2003, A61K 038/44, C12N 009/02-08); для очистки сточных вод (Патент РФ №2001128771, 2003.07.10, А61К 7/13); в биосенсорных технологиях (например, анализ фенольных соединений, включая лигнины, в сточных водах промышленных предприятий, определение антиоксидантного статуса вин) (Патент РФ №2001128771, 2003.07.10, А61К 7/130).

Главным звеном в создании промышленной технологии производства лакказы является поиск высокопродуктивного природного штамма, способного к синтезу оксидазного ферментативного комплекса с высоким содержанием лакказы и низким содержанием сопутствующих оксидаз.

Известен штамм гриба Coriolus hirsutus (Wulf. ex Fr.) Quel. - продуцент внеклеточной лакказы (AC №1510347, 1987, C12N 1/14, 9/02. Штамм гриба Coriolus hirsutus (Wulf. ex Fr.) Quel. - продуцент внеклеточной лакказы). Описываемый штамм ЛЕ №072 обладает способностью синтезировать внеклеточную лакказу с высокой каталитической активностью (457, 257, 462) при использовании в качестве субстратов железосинеродистого калия, гидрохинона и пирокатехина и может быть использован в аналитических целях, а также для очистки сточных вод.

Наиболее близким к предложенному штамму является штамм-продуцент лакказы, описанный в патенте РФ №2035512 (Штамм базидиального гриба Coriolus hirsutus (Wulf. ex Fr.) Quel. - продуцента лакказы; 1995, C12N 9/08, C12R 1/645). Штамм синтезирует внеклеточную лакказу с высокой каталитической активностью (550 К_кат,с^-1 по пирокатехину и 320 К_кат,с^-1 по гидрохинону). Однако оксидазная активность штамма недостаточно высока для использования его в промышленном производстве лакказы.

Таким образом, в настоящее время не известен природный высокопродуктивный штамм-продуцент лакказы для промышленного производства ферментного препарата лакказы.

Раскрытие изобретения

Новый штамм высшего базидиального гриба Trametes hirsuta CF-28 (Wulfen.) Pilát (сем. Poliporaceae) характеризуется высокой скоростью роста и активным синтезом экстрацеллюлярной лакказы в условиях жидкофазного глубинного культивирования.

Штамм Trametes hirsuta B-003 выделен в процессе многократных пассажей глубинной культуры с получением культуральной жидкости с высокой оксидазной активностью штамма ЦНИИМОД 56. Источник выделения: моноглобулярные изоляты глубинной культуры с высокой оксидазной активностью исходного штамма - тканевые изоляты плодовых тел. Штамм депонирован в коллекции ООО ПКФ «БИГОР» под номером CF-28.

Штамм имеет морфологические признаки, позволяющие идентификацию в процессе производства до класса и в лабораторных условиях до вида.

На агаризованной среде

Макроскопические признаки:

На агаризованном сусле штамм образует колонии с хорошо развитым шерстисто-войлочным воздушным мицелием. Периферическая часть колонии менее плотная. На 3-и сутки выращивания при температуре 28°С диаметр колонии достигает 5 см. Воздушный мицелий белого цвета. Наблюдается нечетко выраженная зональность. Гифы в колонии радиально ориентированы. Край колонии гладкий, прижатый. Капли экссудата отсутствуют. Реверзум неизмененный, затем побелевший. Чашки Петри с сусло-агаром при температуре 28°С полностью зарастают на 5-ые сутки роста.

При старении колонии с желтоватым или кремоватым оттенком образуют зачатки плодовых тел в виде бугорков 3-10 мм в диаметре или плодовые тела в виде дисков с приподнятыми краями, часто сливающимися, с неясной зональностью, белых, со временем желтеющих. Запах приятный грибной. Пигментов, окрашивающих среду, не выделяет.

Микроскопические признаки:

Гифы воздушного мицелия трех типов:

Прямые ровные гифы с диаметром 2-3 мкм, слабо септированные. Пряжек мало или отсутствуют. Встречаются псевдопряжки - выпячивания на гифе без перегородок.

Неровные узловатые темноокрашенные гифы с большим количеством пряжек. Диаметр гиф 1-2 мкм. Пряжки большие, преимущественно одиночные, округлой формы, без зазора, реже медальонные (иногда парные или множественные).

Толстые гифы, 4-5 мкм в диаметре с большим количеством перегородок и одиночными пряжками.

При глубинном культивировании

Макроскопические признаки:

В глубинной культуре образует мицелиальные агломераты сферической или неправильной формы, 1-3 мм в диаметре (пеллеты), также присутствуют отдельные гифы. В зависимости от условий глобулы могут быть гладкие или опушенные, светло-желтого цвета.

Микроскопические признаки:

В центральной части глобул гифы утолщены, искривлены, в крупных глобулах на срезе наблюдается зональность, иногда полости. В глубинной и поверхностной культуре образует кристаллы кубической, призматической или игольчатой формы. Не образует хламидоспоры, артроспоры и оидии. Гифы разветвляются под прямым углом, иногда образуют вздутия и утолщения на концах. В глубинной культуре гифы преимущественно двух типов: тонкие (1-2 мкм) и толстые (2,5-5 мкм). Пряжки одиночные, большие, крутоизогнутые, чаще без просвета.

Культура гриба активно развивается в диапазоне температур от 24 до 36°С. Оптимум радиального роста колоний - 32°С. Аэроб. Оптимальное значение для синтеза лакказы - рН 4,0.

Растет и активно синтезирует лакказу на питательных средах с сахарозой, глюкозой, фруктозой, мальтозой. Утилизирует в качестве источника азота аммонийные соли, органическую форму азота. Растет на средах с мелассой, мукой, крахмалом, пивным суслом. В глубинной культуре представляет собой густую светло-соломенно-желтую взвесь глобул от 1 до 8 мм в диаметре.

Продуктивность штамма в условиях глубинного культивирования составляет 20-26 МЕ/мл по пирокатехину за 64-68 часов роста или 0,3-0,4 МЕ·ч^-1/мл.

Таблица 1Сравнение продуктивности штаммов Trametes hirsuta (Wulfen) Pilát CF-28 и штамма-прототипаЛакказаВремя культивирования, чАктивность КЖ,МЕ/млПродуктивность, МЕ·ч^-1/млCoriolus hirsutus (Wul. fex Fr.)Quel. ЛЕ 093572-9610,0-13,50,1-0,2Trametes hirsuta (Wulfen) Pilát CF-2864-6820-260,3-0,4

Таблица 2Характеристики лакказы, синтезируемой Trametes hirsuta (Wulfen) Pilát CF-28Молекулярная масса, кДаАктивность по пирокатехину, ед./мгpIрН-оптимумОкислительно-восстановительный
потенциал центра Т1, мВЭффективность катализа,(к_кат/К_м)·10^-6М^-1с^-1пирокатехингидро-хинон70±23504,2±0,14,5780±202,757,38

Штамм стабилен в культуре и технологичен в условиях промышленного производства.

Применимость штамма доказывается следующими примерами.

Пример 1

Культуру штамма Trametes hirsuta (Wulfen) Pilát CF-28 хранили в пробирках на скошенном агаризованном пивном сусле при температуре +(4-6)°С.

Засев жидкой питательной среды первоначально проводили путем переноса в нее культуры вместе с кусочком агаризованной среды (первый пассаж), а затем с жидкой среды на жидкую из расчета 20 об.% посевного материала (второй, третий и последующие пассажи).

Выращивание посевного материала проводили в термостатированной комнате при температуре 28°С и частоте вращения качалки 200 об/мин на среде следующего состава, г/л: глюкоза - 20,0; NH₄NO₃ - 2,8; мочевина - 0,7; КН₂PO₄ - 0,6; К₂HPO₄ - 0,6; MgSO₄·7H₂O - 0,5; ZnSO₄ - 50 мг; CuSO₄·5Н₂O - 40 мг; кукурузный экстракт - 10,0; вода водопроводная. Длительность выращивания посевного материала: первый пассаж - 120 ч, второй пассаж и последующие - 72 ч.

Глубинную культуру использовали для засева ферментационного аппарата объемом 30 л с рабочим объемом 20 л стерильной питательной среды вышеуказанного состава. Количество вносимого посевного материала составляло 2 л. Культивирование проводили при температуре 32°С, перемешивании 250 об/мин, аэрации 1 л/л/мин, избыточном давлении в аппарате 0,2 ати, рН - 4,0. Продолжительность ферментации до максимума оксидазной активности составила 64 часа.

Активность лакказы в культуральной среде определяли спектрофотометрически при 410 нм с использованием пирокатехина в качестве субстрата и при 247 нм с использованием гидрохинона.

Полученная культуральная жидкость имела активность 26 МЕ/мл по пирокатехину, продуктивность штамма составила 0,41 МЕ·ч^-1/мл. Продуктивность штамма-прототипа в аналогичных условиях составила 0,15 МЕ·ч^-1/мл.

Пример 2

Выращивание посевного материала в колбах осуществляли аналогично изложенному в примере 1.

Выросший посевной материал передавали для засева ферментера той же емкости со стерильной питательной среды следующего состава, г/л: мука - 2,0; аммоний сернокислый - 0,3; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,12; вода водопроводная - остальное.

Глубинную культуру использовали для засева ферментационного аппарата объемом 30 л с рабочим объемом 20 л стерильной питательной среды вышеуказанного состава. Количество вносимого посевного материала составляло 2 л. Культивирование проводили при 32°С, перемешивании 250 об/мин, аэрации 1 л/л/мин, избыточном давлении в аппарате 0,2 ати, рН не регулировался. Продолжительность ферментации составила 68 часов. Полученная культуральная жидкость имела активность 20 МЕ/мл по пирокатехину, продуктивность штамма составила 0,29 МЕ·ч^-1/мл. Продуктивность штамма-прототипа в аналогичных условиях составила 0,104 МЕ·ч^-1/мл.

Приведенные примеры подтверждают преимущество штамма перед штаммом-прототипом, а именно его более высокую лакказную активность, достигаемую за более короткое время на более дешевом сырье.

Промышленная полезность

Как уже указывалось, одной из главных особенностей штамма является способность к высокопродуктивному синтезу оксидазного ферментативного комплекса с высоким содержанием лакказы и низким содержанием сопутствующих оксидаз.

Лакказа (КФ 1.10.3.2 п-дифенол: кислород оксидоредуктаза) является одним из наиболее перспективных промышленных ферментов, относящаяся к классу оксидаз, восстанавливающих молекулярный кислород непосредственно до воды без образования в качестве промежуточного продукта перекиси водорода или каких-либо других кислородных интермедиатов. Голубые лакказы из базидиальных грибов являются высокопотенциальными ферментами (редокс потенциалы этих лакказ находятся в области 750-800 мВ) и обладают широкой субстратной специфичностью по отношению к различным органическим и неорганическим соединениям, что делает возможным их использование совместно с медиаторами, являющимися одновременно их первичными субстратами, во многих областях промышленности: целлюлозно-бумажной (делигнификации бумажной пульпы); текстильной промышленности (экологически чистое отбеливание тканей); производстве современных экологически чистых древесно-волокнистых плит (в качестве биосвязующего агента); тонком органическом синтезе (например, синтез электропроводящих полимеров); пищевой промышленности (удаление следов кислорода в продуктах питания для увеличения срока хранения); косметической промышленности (краска для волос, отбеливающая зубная паста); производстве моющих средств (отбеливающий агент); для биодеградации ксенобиотиков, в том числе отравляющих веществ; энергетике (кислородный электрод биотопливного элемента); синтезе лекарственных препаратов (например, антибиотиков); в биосенсорах (например, анализ фенольных соединений, включая лигнины, в сточных водах промышленных предприятий, определение антиоксидантного статуса вин); иммуноферментном анализе (в качестве фермента-маркера).

Практическое использование лакказы в настоящее время ограничено из-за отсутствия высокопродуктивного штамма.

Предлагаемый штамм может быть использован для производства лакказы в промышленности.

В опытно-промышленных условиях с использованием предложенного штамма проведена ферментация в ферментере объемом 1,5 м³ в промышленных условиях (рабочий объем 1,0 м³).

Штамм выращивали методом глубинного культивирования в колбах Эрленмейера объемом 750 мл с объемом среды 150 мл на круговой качалке при скорости вращения 200 об/мин, температуре 28°С и исходном рН среды 5.8-6.0 в течение 5 суток с последующим пересевом на колбы и повторным культивированием в тех же условиях в течение 3 суток.

Посевной материал выращивали в инокуляторе общим объемом 250 л (рабочий объем 100 л) на среде в течение 65 часов. Далее инокулят переносили в посевной аппарат общим объемом 1,5 м³ (рабочий объем 1 м³), время роста культуры составило - 65 ч. Оксидазная активность составила 25 МЕ/мл. Продуктивность штамма составила 0,39 МЕ·ч^-1/мл.

Штамм базидиального гриба Trametes hirsuta (Wulfen) Pilát, депонированный в коллекции ООО ПКФ «БИГОР» под номером CF-28, выделен путем многократных пассажей из моноглобулярных изолятов глубинной культуры штамма ЦНИИМОД 56. Штамм характеризуется активным синтезом экстрацеллюлярной лакказы. Активность лакказы составляет 20-26 МЕ/мл. 2 табл.

Штамм базидиального гриба Trametes hirsuta (Wulfen) Pilát CF-28, депонированный в коллекции ООО ПКФ «БИГОР», - продуцент голубой лакказы.