СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ЛАККАЗЫ Российский патент 2009 года по МПК C12N9/02 C12N1/14 

Настоящее изобретение относится к новым способам получения ферментного препарата лакказы.

Наиболее эффективно изобретение может быть использовано при производстве ферментных препаратов для текстильной, пищевой, косметической, деревообрабатывающей промышленности и органического синтеза.

Лакказа (КФ 1.10.3.2 п-дифенол: кислород оксидоредуктаза) относится к классу оксидаз, восстанавливающих молекулярный кислород непосредственно до воды без образования каких-либо кислородных интермедиатов.

Известно использование лакказы для обработки целлюлозно-бумажной пульпы (патент РФ №2001125920, С08В 11/145, 2004; патент США №6610172, D21H 021/20, 2003; патент США №20010047852); в текстильной промышленности для обработки льна, обесцвечивания и окрашивания хлопковых тканей (патент РФ №96103261, D01С 1/04, 1998; патент РФ №94008821, D06L 1/14, D06M 16/00, 1995; патент США №6805718, D06P 001/32, D06M 016/00, 2004; патент РФ №2000119782, C12S 11/00, 2002; патент РФ №2148111, C12S 3/06, D01С 1/02, 2000; патент РФ №96107218, C12S 3/00, D21C 3/00, 1998).

Известно использование лакказы в органическом синтезе (патент РФ №2001125922, С12Р 1/00, С12Р 19/00, С12Р 13/00, С12Р 7/24, С07С 45/29-39, С07Н 3/00, С07Н 5/04, 2005; патент США №6190891, С12Р 013/00, 2001); в косметической промышленности в качестве агента для окрашивания волос (патент Франции №2112549, А61К 7/13, 2002; патент РФ №2203028, А61К 7/13, 2003; патент РФ №200112877, А61К 7/13, 2003; патент РФ №224501, А61К 7/13, 2004; патент РФ №2193392, А61К 7/13, 2002; патент РФ №22005339, А61К 7/13, 2003; патент РФ №2000121095, А61К 7/13, 2002), в производстве моющих средств (патент США №6815410, С11D 017/00, 2004); для биодеградации ксенобиотиков (патент США №6395534, C12N 001/18, 2002); для создания антимикробных композиций (патент США №20010025018, А61К 038/44, 2001; патент США №6592867, C12N 009/02-08, 2003); для очистки сточных вод (патент РФ №2001128771, А61К 7/13, 2003); в биосенсорах (например, для анализа фенольных соединений, включая лигнины, в сточных водах промышленных предприятий; для определения антиоксидантного статуса вин) (патент РФ №2001128771, А61К 7/13, 2003).

Известны способы получения лакказы в составе других лигнолитических ферментов (патент РФ №2021371, С12N 9/00-9/99, 1994; патент РФ № 92016316, C12N 9/08, 1996; патент Германии №10043944 А2, С12N 9/08, 2003; патент США №5403723, C12N 009/08, С12Р 039/00, 1995). Однако ни один из них не эффективен для получения препарата с высокой активностью лакказы.

Известен способ получения лакказы из растений (патент РФ №103031, С12N 15/00-15/82, 1998; патент ЕР №1119633 А2, С12N 15/82, 2002), однако известно, что окислительно-восстановительный потенциал растительных лакказ ниже, чем у грибных, что не позволяет эффективно использовать их в промышленности.

Таким образом, ни один известный способ получения лакказы, в том числе в составе лигнолитического комплекса грибов, не дает возможности его промышленного применения для получения ферментного препарата лакказы.

Наиболее близким к предложенному способу является способ получения лакказы с использованием штаммов Coriolus hirsutus (Wulf ex Fr.) Quel., изложенный в патенте РФ №2035512, заключающийся в том, что штамм-продуцент выращивают в колбах Эрленмейера на глюкозо-пептонной питательной среде при температуре 24-26°С на качалке при 120-140 об/мин в течение 3-5 суток. Однако этот способ имеет низкую продуктивность по выходу фермента.

Поставленная задача решается тем, что найден новый способ получения ферментного препарата лакказы с более высокой продуктивностью, что является определяющим для получения промышленного фермента.

Новый способ характеризуется совокупностью технологических приемов и компонентов среды, приводящих к получению высокоактивной ферментативной жидкости за более короткий срок, и отличается тем, что параметры культивирования штамма-продуцента (температура и величина рН) поддерживают в зависимости от концентрации растворенного кислорода, в том числе с начала культивирования до снижения концентрации растворенного кислорода до 50% от насыщения поддерживают температуру

+(25-27)°С и рН в пределах 3,0-7,0; при дальнейшем снижении концентрации растворенного кислорода до 5% повышают температуру до +(27-29)°С и сужают некорректируемый диапазон рН до 4,0-5,0; при снижении концентрации растворенного кислорода до минимального уровня и ее дальнейшем повышении поддерживают температуру +(30-33)°С и рН 4,0-6,0.

Способ прост и легко реализуем в условиях промышленного производства. Процесс культивирования составляет от 48 до 100 ч.

Культуральную жидкость с высоким содержанием лакказы получают биотехнологическим способом путем глубинного культивирования штаммов базидиального гриба белой гнили Coriolus hirsutus (Wulf ex Fr.) Quel., в жидкой стерильной питательной среде, включающей углеводы, аммонийные и фосфорсодержащие соли, и источник микроэлементов и ростовых веществ.

Посевной материал вносят в широких пределах - от 2 до 50% от объема среды. Инокулирование проводят агаровыми блоками, измельченными кусочками среды с мицелием, гомогенизированным мицелием, выращенным поверхностно на жидкой среде, или крупными частями колоний без их измельчения. Инокулированные колбы помещают на качалку. Процесс культивирования составляет 96-120 часов. Полученную таким образом глубинную культуру используют в качестве посевной (с гомогенизированием или без него) при дальнейших пересевах в процессе лабораторной подготовки посевного материала для производства.

После завершения процесса культивирования биомассу отделяют фильтрованием, фильтрат подвергают ультрафильтрации. Активность получаемого препарата составляет не менее 40 МЕ/мл.

Изобретение поясняется примерами.

Пример 1.

Культуру штамма Coriolus hirsutus (Wulf ex Fr.) Quel. ЛЕ 0935 хранят в пробирках на скошенном агаризованном пивном сусле при температуре +(4-6)°С.

Засев жидкой питательной среды первоначально проводят путем переноса в нее культуры вместе с кусочком агаризованной среды (первый пассаж), а затем с жидкой среды на жидкую из расчета 10-20 об. % посевного материала (второй, третий и последующие пассажи).

Выращивание посевного материала проводят при температуре +(26-28)°С и частоте вращения качалки 180 об·мин^-1 на среде следующего состава, мас.%: глюкоза - 2,0; аммоний сернокислый - 0,3; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,12; кукурузный экстракт - 1,0; пеногаситель (пропинол) - 0,05; вода водопроводная - остальное. Длительность выращивания посевного материала: первый пассаж - 96 ч, второй и последующие - 72 ч.

Глубинную культуру используют для засева ферментационного аппарата объемом 30 л с рабочим объемом 20 л стерильной питательной среды вышеуказанного состава. Количество вносимого посевного материала составляет 2 л. Культивирование ведут при перемешивании (150-450) об.мин^-1, аэрации 1 л·л^-1·мин^-1, избыточном давлении в аппарате 0,2-0,4 ати. При снижении концентрации растворенного кислорода от начальных 100% от насыщения до 50% культивирование ведут при температуре +(25-27)°С без регулирования рН в пределах 3,0-7,0. При дальнейшем снижении концентрации растворенного кислорода до 5% культивирование ведут при температуре +(27-29)°С и рН 4,0-5,0. При снижении концентрации растворенного кислорода от 5 до 0% и ее дальнейшем повышении поддерживают температуру +(30-33)°С и рН 4,0-6,0. Продолжительность ферментации составляет 68 часов.

Активность лакказы в культуральной среде определяют спектрофотометрически при 410 нм с использованием пирокатехина в качестве субстрата. Полученная культуральная жидкость имеет оксидазную активность 6,8 ME.

После завершения процесса культивирования биомассу отделяют фильтрованием на нутч-фильтре, полученный фильтрат подвергают ультрафильтрации на мембране с порогом задерживания 15 кДа. Активность получаемого препарата составляет 47,6 ME.

Пример 2.

Выращивание посевного материала в колбах осуществляют аналогично изложенному в примере 1.

Посевной материал передают для засева ферментера той же емкости со стерильной питательной средой следующего состава, мас.%: мука - 2,0; аммоний сернокислый - 0,3; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,12; кукурузный экстракт - 1,0; пеногаситель (пропинол) - 0,05; вода водопроводная - остальное.

Культивирование ведут при перемешивании (150-450) об·мин^-1, аэрации 1 л·л^-1·мин^-1, избыточном давлении в аппарате 0,2-0,4 ати. При снижении концентрации растворенного кислорода до 50% от насыщения культивирование ведут при температуре +(25-27)°С и без регулирования рН в пределах 3,0-7,0. При дальнейшем снижении концентрации растворенного кислорода до 5% культивирование ведут при температуре +(27-29)°С и рН 4,0-5,0. При снижении концентрации растворенного кислорода до минимума (2%) и ее дальнейшем повышении поддерживают температуру +(30-33)°С и рН 4,0-6,0. Продолжительность ферментации составляет 70 часов. Полученная культуральная жидкость имеет активность 7,8 ME.

Переработку культуральной жидкости и получение готового продукта осуществляют аналогично изложенному в примере 1. Активность получаемого препарата составляет 54,6 ME.

Пример 3.

Культуру штамма Coriolus hirsutus (Wulf ex Fr.) Quel. 86-43 хранят в пробирках на скошенном агаризованном пивном сусле при температуре +(4-6)°С.

Выращивание посевного материала в колбах осуществляют аналогично изложенному в примере 1.

Выросший посевной материал передают для засева ферментера той же емкости со стерильной питательной средой, аналогичной примеру 1.

Культивирование ведут при перемешивании (150-450) об.мин^-1, аэрации 1 л·л^-1·мин^-1, избыточном давлении в аппарате 0,2-0,4 ати. При снижении концентрации растворенного кислорода до 50% от насыщения культивирование ведут при температуре +(25-27)°С и без регулирования рН в пределах 3,0-7,0. При дальнейшем снижении концентрации растворенного кислорода до 5% культивирование ведут при температуре +(27-29)°С и рН 4,0-5,0. При дальнейшем снижении концентрации растворенного кислорода до минимума и ее дальнейшем повышении поддерживают температуру +(30-33)°С и рН 4,0-6,0. Продолжительность ферментации составляет 72 часа. Полученная культуральная жидкость имеет активность 4,8 ME.

Переработку культуральной жидкости и получение готового продукта осуществляют аналогично изложенному в примере 1. Активность получаемого препарата составляет 41,6 ME.

Приведенные примеры подтверждают преимущество заявляемого способа перед прототипом, а именно его более высокую лакказную активность, достигаемую за более короткое время на более дешевом сырье.

Таблица. Сравнение продуктивности нового способа и способа-прототипа

ШтаммыСпособВремя культивирования, чАктивность КЖ, МЕ/млПродуктивность, МЕ·ч^-1/млCoriolus hirsutus (Wulf ex Fr.) Quel. ЛЕ 0935Новый способ68-706,8-7,80,10-0,11Способ-прототип961,30,01Coriolus hirsutus (Wulf ex Fr.) Quel. 86-43Новый способ724,80,07Способ-прототип1000,60,006

Практическое использование лакказы в настоящее время минимально из-за отсутствия способа получения высокоактивной культуральной жидкости, содержащей лакказу. Как уже указывалось, одной из главных особенностей способа является получение высокоактивной культуральной жидкости, содержащей лакказу, которая является одним из наиболее перспективных промышленных ферментов. Голубые лакказы из базидиальных грибов являются высокопотенциальными ферментами (редокспотенциалы этих лакказ находятся в области 750-800 мВ) и обладают широкой субстратной специфичностью по отношению к различным органическим и неорганическим соединениям, что делает возможным их использование совместно с медиаторами во многих областях промышленности. Предлагаемый способ может быть использован для производства этого фермента.

Способ получения ферментного препарата лакказы предусматривает поддержание параметров культивирования в зависимости от концентрации в среде растворенного кислорода. С начала культивирования до снижения концентрации растворенного кислорода до 50% от насыщения поддерживают температуру 25-27°С и рН в пределах 3,0-7,0. При дальнейшем снижении концентрации растворенного кислорода до 5% повышают температуру до 27-29°С и сужают некорректируемый диапазон рН до 4,0-5,0. При снижении концентрации растворенного кислорода до минимального уровня и ее дальнейшем повышении температуру поддерживают 30-33°С и рН 4,0-6,0. Изобретение обеспечивает повышение активности культуральной жидкости, содержащей лакказу. 1 табл.

Способ получения ферментного препарата лакказы, предусматривающий глубинное аэробное культивирование клеток базидиального гриба Coriolus hirsutus (Wulf ex Fr) Quel, на жидкой питательной среде, содержащей углеводы, аммонийные и фосфорсодержащие соли, источники микроэлементов, отделение биомассы и концентрирование, отличающийся тем, что параметры культивирования поддерживают в зависимости от концентрации в среде растворенного кислорода, в том числе с начала культивирования до снижения концентрации растворенного кислорода до 50% от насыщения поддерживают температуру 25-27°С и рН в пределах 3,0-7,0, при дальнейшем снижении концентрации растворенного кислорода до 5% повышают температуру до 27-29°С и сужают некорректируемый диапазон рН до 4,0-5,0, при снижении концентрации растворенного кислорода до минимального уровня и ее дальнейшем повышении поддерживают температуру 30-33°С и рН 4,0-6,0.