Штамм Fomes fomentarius ВКПМ F-1531 - продуцент фенолоксидазных ферментов Российский патент 2022 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к штамму базидиомицета Fomes fomentarius ВКПМ F-1531, который при культивировании поверхностно-жидкофазным методом синтезирует внеклеточные фенолоксидазы, обнаруживаемые по окислению или пирокатехина (10 мМ) или 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиозолин-6-сульфокислоты)диаммониевой соли (ABTS, 4 мМ) в 0,1 М ацетатном буфере при выявленных оптимальных условиях: рН 5,4 и температуре 54-56°C. При этом ферментативная активность термолабильных/термостабильных оксидаз составляет 14-20 МЕ/мл (по пирокатехину) и 720-830 МЕ/мл (по ABTS). Время полу инактивации ферментов составляет 70 мин при температуре 65-67°C.

Известно, что практическое значение имеют как очищенные препараты фенолоксидаз (лакказ, пероксидаз и др.), так и комплексные препараты оксидазных ферментов с мажорным лакказным ферментом у базидиальных грибов. Поэтому препарат фенолоксидазных ферментов, полученный культивированием гриба F.fomentarius ВКПМ F-1531, может быть использован в технологиях делигнификации или детоксикации отходов деревообрабатывающей, целлюлозо-бумажной, текстильной, фармацевтической, пищевой и косметической промышленностей, содержащих лигнины, фенолы и полифенолы.

Известны примеры использования препаратов фенолоксидаз, в т.ч. лакказы различных базидиальных грибов в следующих отраслях:

- пищевой промышленности при получении подкисленного молочного напитка с использованием фермента, обладающего фенолоксидазной активностью (патент США 2010/0266724 А1 от 21.10.2010 г.); при получении напитков на основе водных экстрактов разнообразных грибов, в т.ч. Forties fomentarius (патент WO 2005/029977 А1 от 07.04.2005 г.);

- целлюлозо-бумажной промышленности при обработке бумажной пульпы (патент США 6610172 В1 от 26.08.2003 г.; патент США 6207009 В1 от 27.03.2001 г.; патент США 2328125А1 от 28.10.1999 г.; патент ЕР 0429422 А1 от 29.05.1991 г.; патент США 2017058459 А1 от 02.03.2017 г.; патент WO 9509946 А1 от 13.04.1995 г.);

- текстильной промышленности для отбеливания (патент РФ №96103261 С1 от 10.05.1998 г.) и расшлифовки тканей (патент РФ 2070243 С1 от 10.12.1996 г.);

- химической промышленности для получения полимеров на основе лигнинов и органических соединений (пат. РФ 2165978 от 20.04.2001 г.); для синтеза высокомолекулярных фенольных соединений посредством обработки различных ксенобиотиков препаратами фенолоксидаз (ЕР 0919628 А1 от 02.06.1999 г.);

- приборостроении для создания биосенсоров или биочипов детектирования, например, бета-1,3-глюкана (патент США 2002/0197662 А1 от 26.12.2002 г.).

Штаммы базидиомицета Fomes fomentarius известны для получения разнообразных препаратов:

- хитинсодержащего композита из гименофора плодового тела гриба (патент РФ 2404996 от 13.07.2009 г.);

- препарата с противоопухолевой активностью (патент CN 104055803 A1 от 24.09.2014 г.);

- фильтрующего материала, полученного при обработке целлюлозы лакказами грибов, в том числе Fomes fomentarius (патент KR 101300076 B1 от 30.08.2013 г.);

- композитного материала на основе мицелия и синтезируемых им ферментов (патент US 2012225471 A1 от 06.09.2012 г.);

- препаратов полисахаридов для защиты растений (патент JPH 0621122 В2 от 21.11.1989 г.) и с высокой антиоксидантной активностью (патент CN 109912726 A от 21.06.2019 г.);

- противовирусных препаратов для пчел на основе экстракта мицелия (патент DK 3110260 T3 от 05.11.2018) и этанольных экстрактов мицелия (патент США 2016/0000754 А1 от 07.01.2016 г.);

- препаратов БАВ для медицины: с расслабляющим (патент KR 102035281 В1 от 30.10.2019 г.) и сосудорасширяющим (патент KR102035281B1 от 30.10.2019 г.) действием на кровеносные сосуды; а также для профилактики и лечения черепно-мозговых нервов (патент US 20180289758 A1 от 11.10.2018 г.);

- косметического препарата для отбеливания кожи на основе лакказ гриба (патент KR 101551243 В1 от 09.09.2015 г.).

В то же время штаммы гриба Fomes fomentarius упоминаются как продуценты ферментов:

- протеолитических (коллагенолитических) ферментов (заявка на изобретение РФ 2018100380 от 09.01.2018 г.);

- эндо-глюконаз (патент ЕР 2563910А1 от 03.06.2013 г.).

Таким образом, не существует аналогов использования F.fomentarius в качестве источника термостабильных высокоактивных фенолоксидазных ферментов, которые обладают активностью 14-20 МЕ/мл (по пирокатехину) или 720-830 МЕ/мл (по ABTS).

Прототипом могут служить штаммы грибов Coriolus hirsutus (WulfexFr.) Quel. ле0935, который обладал активностью 4,8-7,8 ME в глубинной культуре (патент РФ 2349 644 С2 от 20.03.2009) и Panus tigrinus 8/18, синтезирующий комплекс лигнолитических ферментов с фенолоксидазной активностью 7-11 ед/мл на 10-12 сут роста (патент РФ 2021371 от 15.10.1994 г.).

Предлагаемый штамм F. fomentarius ВКПМ F-1531 расширяет набор штаммов микроорганизмов, осуществляющих синтез фенолоксидазных ферментов, способных к окислению ряда фенолсодержащих соединений - пирокатехина, 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиозолин-6-сульфокислоты) диаммониевой соли (АВТС); 2,6-диметоксифенола, пирогаллола, гидрохинона, фенола, лигносульфоната натрия, а также некоторых ароматических гетероциклических синтетических красителей (метилового зеленый, метиловый оранжевый, метиловый красный, кислотный хром темно-синий, конго красный, бромтимоловый синий, метилтимоловый синий, бриллиантовый зеленый, ремазол, пиразоновый желтый, ксиленовый оранжевый).

Штамм Fomes fomentarius ВКПМ F-1531 продуцирует внеклеточные фенолоксидазные ферменты при росте на поверхности жидких сред (модифицированные Чапека или глюкозо-пептонной) в течение 12-14 сут с оксидазной активностью (по пирокатехину) в культуральной жидкости на уровне 14-20 МЕ/мл.

Штамм гриба F.fomentarius BKnMF-1537выделен из плодового тела F. fomentarius (трутовик настоящий), который был обнаружен на валеже лиственного дерева и выделен в чистую культуру. Его принадлежность к представителям Fomes fomentarius определена на основе идентификации штамма по последовательности области ITS - D1/D2 рДНК.

При секвенировании участка ДНК, кодирующего область ITS - D1/D2 рДНК исследуемого штамма, получена следующая последовательность:

Анализ сходства нуклеотидной последовательности гена, кодирующего область ITS - D1/D2 рДНК, изучаемого штамма был проведен с помощью сервера BLAST [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast]. Первичный скрининг по базе данных GenBank показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующей систематической группе: Eukaryota; Fungi; Dikarya; Basidiomycota; Agaricomycotina; Agaricomycetes; Polyporales; Polyporaceae; Fomes.

Штаммы, принимающие участие в анализе, и уровень сходства последовательности области ITS - D1/D2pJTHK изучаемого штамма представлены в таблице:

Анализ филогенетического родства, построенный с использованием штаммов близкородственных микроорганизмов, показал, что наиболее близким к исследуемому штамму является вид Fomes fomentarius.

Культурально-морфологические особенности грибного штамма Fomes fomentarius ВКПМ F-1531 на среде сусло-агар (4°Б):

Гриб образует ватообразный, воздушный мицелий белого цвета, который на 10-12 сут полностью колонизирует агаризованную питательную среду на ч. Петри (90 мм). Цвет реверзума - бесцветный, цвет обратной стороны колонии белый или светло-бежевый.

Колония округлая, концентрически зональная, пушится вокруг инокулюма. Край колонии менее плотный. Высота мицелия в период роста на 5-8 сут в среднем составляет 3-5 мм, и в период 14-17-суточного роста составляет 7-10 мм.

Мицелий гриба имеет окраску белого цвета в течение 15-25 сут на различных средах (Чапека, глюкозо-пептонная, сусло-агар), однако при более длительном культивировании (более 30 сут) приобретает светло-кремовую окраску. Мицелий оседает и уплотняется на поверхности среды, приобретая войлочный вид, плохо разделяемый даже с помощью скальпеля.

Образует на поверхности пленки экссудаты в виде жидкости светло-коричневого цвета, которые могут появляться после 25 сут роста.

Морфологические признаки:

Для штамма F. fomentarius F-1531 в условиях поверхностно-жидкофазного роста характерно наличие гифов простого ветвления. Между гифами наблюдается формирование единичных анастомозов, которые у высших базидиомицетов обеспечивают эффективный обмен и передвижение питательных веществ и ядер в мицелии. Вегетативный мицелий состоит из тонкостенных, септированных и ветвящихся гифов размером 5-7,5 мкм (на 4-5 сут) и 10-15 мкм со множественными пряжками в период роста на 12-17 сут. Также отмечается образование немногочисленных мицелиальных тяжей.

Условия хранения

Штамм F. fomentarius ВКПМ F-1531 хранится на агаризованной среде (Чапека-Докса, ГПС, сусло-агар) при температуре +4°C без пересевов в течение 10-12 мес.

Наличие генетической модификации

Штамм F. fomentarius ВКПМ F-1531 не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов; перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием генно-технических методик.

Культуральные признаки

Твердофазное культивирование штамма F. fomentarius ВКПМ F-1531 осуществляется на увлажненных лигноцеллюлозных субстратах (опилки, овсяный хлопья, шелуха подсолнечник, измельченная солома и др.) при ряде выявленных оптимальных условий: отсутствии освещения, влажности 65-70%,рН 6.0 среды; начальной температуре 28-30°C в течение 3-4 сути 24±2°C в дальнейшем.

Поверхностно-жидкофазный рост гриба F. fomentarius ВКПМ F-1531 осуществляется на питательных средах (модифицированных Чапека или глюкозо-пептонной) при условии: отсутствии освещения; начальном рН 6.0 среды; начальной температуре 28-30°C в течение 3 сут и 24±2°C в течение 12-14 сут.

В результате образуется ферментный раствор (культуральная жидкость) с активностью фенолоксидазных ферментов (по пирокатехину) 7-20 МЕ/мл в оптимальных условиях: рН 5,4 и температуре 55-56°C.

Для выделения фенолоксидазных ферментов используется метод преципитации, который при 70-80% насыщении раствором сульфата аммония высаливается до 79-82% фенолоксидазных ферментов с конечной активностью (по пирокатехину) 184-190 МЕ/мл в оптимальных условиях: рН 5,4 и температуре 55-56°C.

Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Поверхностно-жидкофазное культивирование

Для получения ферментного препарата на основе гриба F. fomentarius ВКПМ F-1531 в условиях поверхностно-жидкофазного культивирования гриб выращивают на жидкой среде Королевой-Скоробогатько (КС) состава (г/л): глюкоза - 20 г/л; KH₂PO₄*2H₂O - 0,6 г/л; K₂HPO₄*3H₂O - 0,4 г/л; MgSO₄*7H₂O - 0,5 г/л; пептон - 3 г/л; CuSO₄*5H₂O - 0,25 г/л; CaCl₂ - 0,5 г/л; ZnSO₄*7H₂O - 0,001 г/л; FeSO₄*7H₂O - 0,0005 г/л). Начальный рН среды составляет 6,0. Рост гриба осуществляют в термостате при температуре 28-30°C в течение 3 сут, затем температуру понижают до 22-24°C и далее выращивают до 12-14 сут.

Посевной материал вносят в виде 7-9-суточных агаровых блочков (10*10 мм). Выращивание посевного материала производят в термостате на среде сусло-агар (4°Б) при температуре 28-30°C.

Фенолоксидазную активность оценивают по скорости окисления пирокатехина (10 мМ) или ABTS (5 мМ) в 0,1М ацетатном буфере при рН 5,4 и температуре 55-56°C.

Фенолоксидазная активность 14-ти суточной культуральной жидкости составляет 17-20 МЕ/мл или 720-830 МЕ/мл (по АВТ8).Концентрация внеклеточного белка, определенная по методу Бредфорда составляет 120-140 мг/л.

Пример 2. Поверхностно-жидкофазное культивирование с добавлением стимуляторов

Штамм продуцента культивируют поверхностно-жидкофазным способом в конических колбах объемом 500-750 мл, содержащих 100-250 мл модифицированной глюкозо-пептонной среды и лигносульфонат, в качестве стимулятора синтеза ферментов, в концентрации 0,05 г/л.

Начальный рН среды составляет 6,0. Культивирование проводят при 28-30°C, в темноте. Продолжительность жидкофазного культивирования составляет 12 сут.

Посевной материал вносят в виде 9-ти суточных агаровых блочков размером 1*1 см. Выращивание посевного материала производили на плотной среде сусло-агар (4°Б) при температуре 28-30°C.

Фенолоксидазную активность оценивают по скорости окисления пирокатехина (10 мМ) или ABTS (5 мМ) в 0,1М ацетатном буфере при рН 5,4 и температуре 55-56°C.

Полученная культуральная жидкость имеет оксидазную активность 19,4-23,5 МЕ/мл.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм базидиомицета Fomes fomentarius F-1531 обладает способностью синтезировать комплекс внеклеточных фенолоксидазных ферментов. Он задепонирован в коллекции ВКПМ РФ как Fomes fomentarius ВКПМ F-1531. Изобретение обеспечивает продукцию синтезируемых грибом Fomes fomentarius F-1531 фенолоксидазных ферментов в условиях поверхностно-жидкофазного роста с фенолоксидазной активностью 14-20 МЕ/мл (по пирокатехину) в течение 12-14 сут. 2 пр.

Штамм базидиомицета Fomes fomentarius ВКПМ F-1531 – продуцент фенолоксидазных ферментов в условиях твердофазного и жидкофазного культивирования.