СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕХНИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ЛАККАЗЫ Российский патент 2009 года по МПК C12N9/02 C12N9/58 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к новым способам получения ферментного препарата лакказы.

Наиболее эффективно настоящее изобретение может быть использовано в промышленном производстве жидкой формы технического препарата лакказы для использования в текстильной, деревообрабатывающей и других областях промышленности, где применяются технические формы фермента.

Лакказа (КФ 1.10.3.2 п-дифенол: кислород оксидоредуктаза), относится к классу оксидаз, восстанавливающих молекулярный кислород непосредственно до воды без образования каких-либо кислородных интермедиатов.

Применение технических форм ферментного препарата лакказы возможно в ряде областей промышленности. Например, известно использование лакказы для обработки целлюлозно-бумажной пульпы (Патент РФ №2001125920, С08В 11/145, 2004; патент США №6610172, D21H 021/20, 2003; Патент США №20010047852). Известно использование лакказы в текстильной промышленности для обработки льна, обесцвечивания и окрашивания хлопковых тканей (Патент РФ №96103261, D01C 1/04, 1998; патент РФ №94008821, D06L 1/14, D06M 16/00, 1995; патент США №6805718, D06P 001/32, D06M 016/00, 2004, патент РФ №2000119782, C12S 11/00, 2002; патент РФ №2148111, C12S 3/06, D01C 1/02, 2000; патент РФ №96107218, C12S 3/00, D21C 3/00, 1998), в косметической промышленности в качестве агента для окрашивания волос (Патент Франции №2112549, А61К 7/13, 2002; патент РФ №2203028, А61К 7/13, 2003; патент РФ №200112877, А61К 7/13, 2003; патент РФ №224501, А61К 7/13, 2004; патент РФ №2193392, А61К 7/13, 2002; патент РФ №22005339, А61К 7/13, 2003; патент РФ №2203028, А61К 7/13, 2003; патент РФ №2000121095, А61К 7/13, 2002), производстве моющих средств (Патент США №6815410, C11D 017/00, 2004); для биодеградации ксенобиотиков (Патент США №6395534, C12N 001/18, 2002); для создания антимикробных композиций (Патент США №20010025018, А61К 038/44, 2001; патент США №6592867, C12N 009/02-08, 2003), для очистки сточных вод (Патент РФ №2001128771, А61К 7/13, 2003).

Известны способы получения очищенных препаратов лакказы (Патент Германии №10043944 А2, C12N 9/08, 2003; патент США №5403723, C12N 009/08, С12Р 039/00, 1995), и в составе других ферментных препаратов (патент РФ №2021371, C12N 9/00-9/99, 1994; патент РФ №92016316, C12N 9/08, 1996). Однако они сложны, многоэтапны, так как включают в себя комбинацию разных методов очистки: высаливание, многоступенчатая хроматография на различных носителях и требуют для своего исполнения сложного и дорогостоящего аппаратурного и реактивного обеспечения.

Также известен способ получения лакказы из растений (патент ЕР №1119633 А2, C12N 15/82, 2002). Однако известно, что окислительно-восстановительный потенциал лакказ растений ниже, чем у грибов.

Таким образом, ни один известный способ получения лакказы, в том числе, в составе лигнолитического комплекса грибов, не дает возможности его промышленного применения для получения ферментного препарата лакказы.

Наиболее близким к предложенному способу является способ получения лакказы, изложенный в патенте РФ №2021371, C12N 9/00-9/99, 1994. В этом способе предусматривается культивирование штамма гриба белой гнили Panus tigrinus 8/18 в погруженных условиях на синтетической среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора, минеральные соли и микроэлементы, при этом в качестве источника углерода используют мальтозу и дополнительно вносят в среду твин-80 и марганец сернокислый. В процессе культивирования осуществляют температурный сдвиг. Максимальное содержание лигнолитических ферментов достигается к 10-12 сут культивирования и составляет 6-8 ед./мл. Ферменты выделяют из фильтрата культуральной жидкости путем концентрирования ультрафильтрацией или высаливанием. Однако этот способ имеет низкую продуктивность по выходу фермента.

Целью изобретения является упрощение и повышение производительности процесса получения жидкой формы технического ферментного препарата лакказы с высокой активностью и стабильностью в процессе хранения.

Способ получения технического ферментного препарата лакказы характеризуется тем, что в качестве штамма-продуцента лакказы используют штамм гриба Trametes hirsuta (Wulfen) Pilát, ООО ПКФ «БИГОР» CF-28, в составе питательной среды ростовые факторы (0,1-1,0 мас.% СВ) и пшеничную муку (2,0-4,0 мас.%) в качестве источника углерода, культивирование ведут при температуре 28-34°С, величине рН 4,0-4,5, концентрации растворенного кислорода не менее 1,5-2,0 мг·дм^-3 за счет регулирования частоты вращения мешалки и скорости подачи аэрирующего воздуха, а мембранное концентрирование проводят при размерах пор мембранного элемента 0,1-0,5 мкм, перепаде давления 1,0-4,0 МПа и температуре 20-40°С. Используемый штамм высшего базидиального гриба Trametes hirsuta (Wulfen.) Pilát (сем. Poliporaceae) депонирован в коллекции ООО ПКФ «БИГОР» под номером CF-28. Штамм характеризуется высокой скоростью роста и активным синтезом экстрацеллюлярной лакказы в условиях жидкофазного глубинного культивирования. На агаризованном сусле штамм образует колонии с хорошо развитым шерстисто-войлочным воздушным мицелием белого цвета. Гифы воздушного мицелия радиально ориентированы. Гифы трех типов: прямые ровные гифы (с диаметром 2-3 мкм), пряжек мало или отсутствуют; неровные узловатые темно-окрашенные гифы (диаметр гиф 1-2 мкм) с большим количеством пряжек; толстые гифы (диаметр 4-5 мкм) с большим количеством перегородок и одиночными пряжками. В глубинной культуре образует мицелиальные агломераты сферической или неправильной формы, 1-3 мм в диаметре (пеллеты), также присутствуют отдельные гифы, преимущественно двух типов: тонкие (1-2 мкм) и толстые (2,5-5 мкм). Культура гриба активно развивается в диапазоне температур от 24 до 36°С. Оптимум радиального роста колоний - 32°С. Аэроб. В глубинной культуре представляет собой густую светло-соломенно-желтую взвесь глобул от 1 до 8 мм в диаметре.

Изобретение обеспечивает возможность осуществления высокопродуктивного щадящего выделения и концентрирования препарата лакказы. Выбор метода и оптимальное соотношение параметров фильтрации позволяет сохранять его биологическую активность не только в процессе концентрирования, но и в течение длительного срока хранения. Стабильность ферментного препарата обеспечивается за счет стабилизирующих свойств структурных полимеров, концентрирующихся вместе с лакказой, и сохранением структуры и пространственной ориентации молекул лакказы при щадящей фильтрации через широкопористый фильтр, значительно превышающий по размеру пор диаметр глобулярной молекулы фермента.

Высокая продуктивность концентрирования лакказы обеспечивается использованием микрофильтрационных мембран (0,1-0,5 мкм) вместо используемых ранее ультрафильтрационных.

В результате получают жидкий технический ферментный препарат, обладающий лакказной активностью 140-200 ME и сроком хранения в течение не менее 2 месяцев при температуре в диапазоне 4-30°С с потерей активности не более 5%.

Изобретение поясняется примерами.

Пример 1.

Выращивание посевного материала проводили в термостатированной комнате при температуре 28°С и частоте вращения качалки 180 об·мин^-1 на среде следующего состава, мас.%: глюкоза - 2,0; аммоний сернокислый - 0,3; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,12; кукурузный экстракт - 1,0; пеногаситель пропинол - 0,05; вода водопроводная - остальное. Длительность выращивания посевного материала: первый пассаж - 144 ч, второй пассаж - 96 ч, третий и последующие - 48 ч.

Глубинную культуру используют для засева ферментационного аппарата объемом 30 л с рабочим объемом 20 л стерильной питательной средой следующего состава, мас.%: мука пшеничная - 2,0; нитрат аммония - 0,4; фосфат калия однозамещенный - 0,06; кукурузный экстракт - 1,0; вода водопроводная - остальное. Количество вносимого посевного материала составляет 2 л. Культивирование ведут при температуре 28°С, перемешивании 250 об·мин^-1, аэрации 1,0 л·л^-1·мин^-1, избыточном давлении в аппарате 0,2 ати, рН 4,0. Продолжительность ферментации - 68 ч.

Активность лакказы в культуральной среде определяли спектрофотометрически при 410 нм с использованием пирокатехина в качестве субстрата.

Полученная культуральная жидкость имеет активность 16 ME.

После завершения процесса культивирования биомассу отделяют на барабанном вакуум-фильтре со скоростью W - 2,5-2,9 л·м²·мин^-1 и разрежением 0,05-0,07 МПа. Далее фильтрат подвергают микрофильтрации на установке с трубчатыми керамическими элементами на мембранах с размером пор 0,14 мкм при среднем давлении 2,0-3,0 МПа. Коэффициент сжатия составляет К=10. Активность полученного препарата - 145 ME. Общие потери на стадии концентрирования составляют не более 10%. Через 2 месяца хранения активность препарата составляет 95% от исходной - 138 ME.

Пример 2.

Культивирование штамма-продуцента осуществляют аналогично изложенному в примере 1.

После завершения процесса культивирования биомассу отделяют на фильтр-прессе с перепадом давления на фильтрующей перегородке не более 0,05 МПа и размере пор тканевого фильтрующего материала в пределах 10 мкм. Активность полученного культурального фильтрата - 20 ME. Далее фильтрат подвергают микрофильтрации на установке с трубчатыми керамическими элементами на мембранах с размером пор 0,2 мкм при среднем давлении 3,0-4,0 МПа. Полученный жидкий препарат имеет активность 174 ME. Кратность концентрирования - 10. Общие потери на стадии концентрирования составляют не более 13%. Полученный жидкий концентрат хранится при условиях, аналогичных примеру 1. Через 2 месяца хранения активность препарата составляет 97% от исходной - 169 ME.

Таким образом, использование данного способа дает возможность получать жидкий концентрированный ферментный препарат лакказы с высокой производительностью и не требует при выделении продукта использовать какие-либо дополнительные химические вещества синтетического или природного происхождения.

Предлагаемый способ по сравнению с наиболее близким аналогом позволяет упростить и повысить производительность процесса получения жидкой формы технического ферментного препарата лакказы с высокой активностью и стабильностью в процессе хранения.

Способ может быть использован для производства этого фермента в промышленности.

Способ включает глубинное культивирование штамма гриба Trametes hirsuta (Wulfen) Pilát, ООО ПКФ «БИГОР» CF-28, на питательной среде, отделение биомассы гриба, мембранное концентрирование фильтрата. В составе питательной среды используют ростовые факторы в концентрации 0,1-1,02 мас.% и в качестве источника углерода пшеничную муку в концентрации 2,0-4,0 мас.%. Культивирование ведут при температуре 28-34°С, рН 4,0-4,5, концентрации растворенного кислорода не менее 1,5-2,0 мг·дм^-3. Мембранное концентрирование осуществляют при размерах пор мембранного элемента 0,1-0,5 мкм, перепаде давления 1,0-4,0 МПа и температуре 20-40°С. Активность лакказы составляет 140-200 ME. Способ позволяет получить технический ферментный препарат лакказы, обладающий высокой активностью.

Способ получения технического препарата лакказы, предусматривающий культивирование штамма гриба белой гнили на питательной среде, содержащей источники азота, углерода, минеральных солей, отделение биомассы гриба, мембранное концентрирование полученного фильтрата, отличающийся тем, что в качестве продуцента лакказы используют штамм гриба Trametes hirsuta (Wulfen) Pilat, ООО ПКФ «БИГОР» CF-28, в составе питательной среды используют ростовые факторы 0,1-1,0 мас.% СВ и пшеничную муку 2,0-4,0 мас.% в качестве источника углерода, культивирование ведут при температуре 28-34°С, величине рН 4,0-4,5, концентрации растворенного кислорода не менее 1,5-2,0 мг·дм³ за счет регулирования частоты вращения мешалки и скорости подачи аэрирующего воздуха, а мембранное концентрирование проводят при размерах пор мембранного элемента 0,1-0,5 мкм, перепаде давления 1,0-4,0 МПа и температуре 20-40°С.