СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК КОЖИ Российский патент 2009 года по МПК A61K35/36 C12N5/08 

Изобретение относится к медицине, точнее к клеточным технологиям, и к способам культивирования клеток человека и животных, используемых в косметологии, пластической хирургии и научных исследованиях.

Известен метод получения культуры клеток кожи, использующий обработку кожного эксплантата протеолитическими ферментами (см. Akira Takashima, Establishment of Fibroblast Cultures, Current Protocols in Cell Biology, 1998, 2.1.1-2.1.12.; патент РФ № 281776, опубл. 20.08.2006). Недостаток этого метода в агрессивном воздействии протеолитических ферментов на клетки, негативно отражающемся на их жизнеспособности.

Описан метод получения культур клеток кожи (см. патент США № 660850), при осуществлении которого фрагменты эксплантата помещаются на культуральную поверхность без применения каких-либо способов их фиксации на поверхности. Отсутствие фиксации неизбежно приводит к подвижности фрагментов, что негативно сказывается на процессе выхода клеток на культуральную поверхность. Скорость миграции клеток из эксплантата на поверхность чашки Петри или культурального матраса составляет менее 1 мм в сутки, и для эффективного перемещения клеток на поверхность фрагменты эксплантата должны сохранять неподвижность в течение, по меньшей мере, 2-3 суток. При периодической смене культуральной среды (что является необходимым для выращивания клеток), а также при неизбежном перемещении чашки Петри или матраса для микроскопирования либо для других целей происходит неизбежное смещение фрагментов эксплантата относительно культуральной поверхности. Подобные смещения сдерживают выход клеток на культуральную поверхность в большом количестве. Если фрагмент эксплантата перестает соприкасаться с поверхностью и начинает свободно плавать в среде, клетки в этом фрагменте оказываются полностью лишены возможности выхода на культуральную поверхность.

Описанный метод выращивания клеток кожи является малоэффективным в связи с отсутствием фиксации эксплантата или его фрагментов, так как выход клеток на поверхность происходит лишь из некоторых фрагментов эксплантата, а количество вышедших клеток является небольшим.

Для решения проблемы фиксации существует способ прижатия фрагментов эксплантата к поверхности чашки Петри тонким покровным стеклом (см. Akira Takashima, Establishment of Fibroblast Cultures, из кн. Current Protocols in Cell Biology, 1998, 2.1.1-2.1.12.). При этом покровное стекло несколько ограничивает подвижность фрагментов эксплантата. Однако, поскольку само стекло не закреплено, а прижатие фрагментов эксплантата обеспечивается его массой, фрагменты эксплантата и стекло в водной среде сохраняют подвижность. Проблема фиксации фрагментов эксплантата относительно культуральной поверхности остается нерешенной.

Известен метод закрепления тонкого покровного стекла, прижимающего фрагменты эксплантата к поверхности, с помощью силиконового клея. Стекло приклеивается к поверхности чашки несколькими каплями силиконового клея после того, как на поверхности размещаются фрагменты эксплантата. Культуральная среда заливается после высыхания клея (см. Calvin В. Harley, Aging of cultured human skin fibroblasts, из кн. Animal cell culture - гл. 3 с.25-32; Volker Meske, Frank Albert, Thomas G. Ohm, Cell Cultures of Autopsy-Derived Fibroblasts, из кн. Human Cell Culture Protocols - гл. 7, с.111-123). Этот способ позволяет добиться надежной фиксации прижимающего стекла, вследствие чего выход клеток на поверхность существенно улучшается. Однако этот метод требует существенных затрат времени, необходимого для нанесения и высыхания силиконового клея (20-30 минут). Во время высыхания клея фрагменты эксплантата не находятся в жидкой среде и подвергаются воздействию высушивания, что снижает жизнеспособность клеток вследствие отсутствия трофики и нарушения осмотического баланса. В связи с этим их помещение в культуральную среду должно быть произведено как можно быстрее.

Поскольку данный метод предполагает заливание культуральной среды только после высыхания клея, затраты времени достаточно велики для того, чтобы негативно сказаться на жизнеспособности клеток. При этом силиконовый клей, контактируя с культуральной средой, изменяет ее состав, что также негативно сказывается на последующем культивировании клеток кожи. Силиконовый клей трудно поддается стерилизации без ухудшения его потребительских свойств, что существенно повышает риск занесения инфекции внутрь чашки Петри. Поскольку во время культивирования фрагменты эксплантата контактируют не только с поверхностью чашки, но и с поверхностью стекла, клетки кожи заселяют обе поверхности одновременно. При извлечении из чашки прижимающего стекла, закрепленного с помощью клея, оно, как правило, ломается, что делает затруднительным снятие и использование клеток, заселивших поверхность стекла, и затрудняет работу сотрудников лаборатории.

Задачей изобретения является создание способа повышения эффективности и ускорения культивирования клеток кожи при использовании чашек Петри с прижимающим стеклом, позволяющим быстро фиксировать в чашке эксплантат без применения клея и создавать увеличенную площадь для заселения клетками.

Задача решается изготовлением и использованием специальной стеклянной пластинки, которая точно соответствует внутренним размерам чашки Петри и способна, упираясь в бортики чашки Петри в точках фиксации, плотно закрепляться параллельно культуральной поверхности чашки Петри и прижимать эксплантат к ее дну. Количество точек фиксации (углов пластинки) составляет не менее трех. Точки фиксации (углы пластинки) закругляются для того, чтобы предотвратить скалывание углов при вставлении пластинки в чашку Петри. Прижимающая стеклянная пластинка имеет площадь 40-70% от площади дна чашки Петри, это сохраняет полноценный газообмен между газовой и жидкой фазами. Толщина пластинки составляет не менее 0,5 мм, это обеспечивает достаточную прочность стекла для того, чтобы не сломать при извлечении из чашки. Благодаря этому можно снимать и использовать те клетки, которые в процессе культивирования выползли на поверхность стеклянной пластинки. Поскольку клетки, как правило, выходят на поверхность чашки и на поверхность пластинки в равных количествах, возможность снимать клетки со стеклянной пластинки позволяет увеличить количество получаемых клеток не менее чем в 2 раза. Благодаря этому количество времени, которое затрачивается на получение необходимого объема клеточной массы, существенно сокращается.

Основные параметры прижимающей стеклянной пластины: толщина - 0,5-3 мм; радиус закругления углов - 0,2-4 мм; допуск фиксирующих размеров - 0,1-0,15 мм; площадь пластины - 40-70% от площади чашки Петри. Размеры определены опытным путем и являются оптимальными для выращивания первичной культуры клеток кожи.

Прижимающая пластина, враспор вставленная внутрь чашки Петри, способна фиксировать фрагменты эксплантата на культуральной поверхности, лишив их какой-либо подвижности. При этом вставление пластинки в чашку, также как и ее демонтаж, требуют минимальных затрат времени, что позволяет сохранить клетки максимально жизнеспособными. Предложенное изобретение позволяет уменьшить время и трудозатраты, необходимые для помещения кожного эксплантата на культуральную поверхность. Благодаря этому могут быть снижены требования к квалификации персонала, выполняющего эту работу.

Способ обеспечивает надежную фиксацию фрагментов эксплантата без применения клея, что позволяет сохранить неизменным состав культуральной среды.

Поскольку предложенная стеклянная пластинка не повреждается при использовании, она может быть отмыта, простерилизована и использована повторно, что повышает экономичность способа. Поскольку все компоненты системы фиксации легко поддаются стерилизации, отсутствует опасность занесения инфекции в чашку Петри, что также повышает эффективность способа и снижает возможные затраты.

Стеклянная пластинка для осуществления способа может быть изготовлена без существенных затрат времени и усилий. Наиболее удобно изготовить стекло треугольной формы, обработав его таким образом, чтобы углы пластинки, вставленной в чашку Петри, плотно упирались в ее боковые стенки, фиксируя стекло на чашке (см. чертеж).

На чертеже представлена чашка Петри (позиция 1), закрытая крышкой (позиция 2), с фрагментами эксплантата (позиция 3), прижимающей пластинкой треугольной формы (позиция 4) и культуральной средой (позиция 5).

Предложенный способ выращивания первичной культуры осуществляется следующим образом

У пациента производят иссечение кожного эксплантата. Область кожи, выбранная для иссечения, должна быть как можно менее подвержена процессам старения благодаря защищенности от воздействия ультрафиолета. Одним из наиболее удобных мест для иссечения является ягодичная область. Иссечение производят скальпелем на всю глубину кожи. Площадь эксплантата - 8-15 мм². На рану накладывают косметический шов или специальный лейкопластырь, предназначенный для бесшовного сведения краев раны. Иссеченный эксплантат помещают в пробирку с солевым буферным раствором, содержащим антибиотики в концентрации, двукратно превышающей культуральную: пенициллин - 200 ЕД/мл, стрептомицин - 200 мкг/мл, тилозин - 20 мкг/мл, амфотерицин-В - 5 мкг/мл.

Эксплантат разделяют на отдельные фрагменты, которые помещаются на поверхность чашки Петри. Предварительно простерилизованное (например, с помощью автоклавирования) прижимающее стекло вставляют в чашку таким образом, что оно прижимает фрагменты эксплантата к поверхности чашки, при этом плотно фиксируясь за счет упора своими углами во внутренние борта чашки (см. фиг.1). Незамедлительно заливают культуральную среду, содержащую все необходимые для культивирования компоненты. Культивирование производят при 37°С, 5% CO₂ в составе газовой фазы среды и 95%-ной влажности. Культуральную среду меняют через каждые 2-3 дня. Производится регулярный визуальный контроль клеточной популяции.

После того как фибробласты вышли на внутренние поверхности чашки и стекла в необходимом количестве, стекло вынимают из чашки и помещают на другую чистую чашку Петри, перевернув вверх той стороной, на которой находятся клетки. Не допуская высыхания стекла, его заливают солевым буферным раствором либо культуральной средой. Поверхности чашки и стекла многократно промывают солевым буферным раствором, после чего обрабатывают раствором трипсина в соответствии с общепринятыми методами (см. Akira Takashima, Establishment of Fibroblast Cultures, Current Protocols in Cell Biology, 1998, 2.1.1-2.1.12; Volker Meske, Frank Albert, Thomas G. Ohm, Cell Cultures of Autopsy-Derived Fibroblasts, Human Cell Culture Protocols - гл.7, с 111-123; патент США № 5660850; патент РФ № 2281776). После трипсинизации клетки отделяются от культуральной поверхности, остатки трипсина ингибируют с помощью сыворотки либо с помощью специального ингибитора трипсина.

Снятые клетки могут быть перенесены для дальнейшего культивирования, использованы в исследовательских или терапевтических целях.

Неочевидным эффектом предложенного способа выращивания первичной культуры клеток кожи является то, что за счет применения прижимающей стеклянной пластинки заданных параметров, изготовленной под серию чашек Петри, удается существенно (в 2 и более раза) увеличить выход первичной культуры клеток кожи при снижении трудозатрат и времени на культивирование.

Способ отличается простотой и удобством, а также возможностью многократного использования прижимающего стекла, предусмотренного в способе, благодаря чему способ может найти применение в широкой практике.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Применяли прижимающие стеклянные пластины из стекла Pirex треугольной формы, толщиной стекла 1,5 мм и радиусом закругления углов 1 мм, количество пластинок - 6 штук. Размер пластин точно соответствовал внутреннему размеру стерильных пластиковых чашек Петри диаметром 40 мм и позволял стеклянным пластинам плотно вставляться враспор внутрь культуральной чашки. Прижимающие стеклянные пластинки стерилизовали с помощью автоклавирования.

Кожный эксплантат иссекали под местной анестезией с ягодичной области у двух добровольцев женского пола возрастом 45 и 52 года. Площадь эксплантата в обоих случаях составляла 12 мм². Иссеченные эксплантаты помещались в пробирку с солевым буферным раствором PBS и антибиотиками. Каждый полученный эксплантат разделяли на 9 фрагментов, после чего фрагменты возвращали в пробирку с солевым буферным раствором PBS. Все манипуляции с эксплантатами и клетками производились в ламинарном боксе 2-го класса биологической защиты.

Фрагменты помещали на дно сухих стерильных пластиковых чашек Петри в количестве 3 фрагмента на чашку, после чего в каждую чашку вставляли стеклянную пластину, добиваясь прижатия фрагментов эксплантата ко дну чашки. Заливали культуральную среду DIMEM, содержащую 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10% фетальной телячьей сыворотки. Время, прошедшее между извлечением фрагментов кожи из солевого буферного раствора и помещением их в культуральную среду, составляло не более 1 мин.

Чашки с фрагментами кожи помещали в CO₂-инкубатор, содержащий 5% CO₂ в составе газовой фазы среды. Инкубировали в течение 9 суток, сменяя среду на чашках через каждые 3 суток.

По прошествии 9 суток из всех чашек извлекали прижимающие стеклянные пластины и помещали на чистые чашки Петри в перевернутом виде. Поверхности всех 6 чашек, на которых производилось культивирование, и поверхности всех 6 стекол промывали от остатков среды с помощью солевого буферного раствора PBS. Затем поверхности обрабатывали с помощью 0,25%-ного раствора трипсина в течение 5 минут для снятия клеток, после чего в чашки добавляли культуральную среду, содержащую 10% фетальной телячьей сыворотки. Среду, содержащую остатки трипсина и клетки кожи, отделившиеся от культуральных поверхностей, помещали в стерильные пробирки и центрифугировали при 150 g в течение 10 минут.

Полученный при центрифугировании осадок клеток ресуспендировали в 100 мкл солевого буферного раствора PBS. Полученную взвесь клеток помещали в камеру Гаряева и подсчитывали их количество общепринятым способом.

В результате общее количество клеток кожи, полученное из эксплантата добровольца 45 лет за 9 суток, составило 360000 клеток, а из эксплантата добровольца 52 лет - 325000 клеток. Описанный пример демонстрирует надежность и эффективность разработанного способа.

Изобретение относится к медицине, точнее к клеточным технологиям, а именно к способам культивирования клеток человека и животных, используемых в косметологии, пластической хирургии и научных исследованиях. Способ получения культуры клеток кожи включает взятие кожного эксплантата, помещение фрагментов эксплантата в чашку Петри, заливку культуральной средой, последующее выращивание и снятие полученной культуры. При этом куски эксплантата фиксируют, прижимая к поверхности чашки Петри стеклянной пластиной, вставляемой враспор в чашку Петри; площадь прижимающей пластины составляет 40-70% от площади чашки Петри, а количество точек фиксации (углов пластины) составляет не менее трех при толщине пластины не менее 0,5 мм. Выращенную клеточную культуру собирают не только с поверхности чашки Петри, но и с поверхности прижимающей пластины. Изобретение позволяет получить культуру клеток кожи в большом объеме за короткий период. Изобретение обеспечивает надежную фиксацию фрагментов эксплантата, повышение эффективности и ускорения культивирования клеток кожи. 1 ил.

Способ получения культуры клеток кожи, включающий взятие кожного эксплантата, помещение фрагментов эксплантата в чашку Петри, заливку культуральной средой, последующее выращивание и снятие полученной культуры, отличающийся тем, что куски эксплантата фиксируют, прижимая к поверхности чашки Петри стеклянной пластиной, вставляемой враспор в чашку Петри, при этом площадь прижимающей пластины составляет 40-70% от площади чашки Петри, количество точек фиксации (углов пластины) составляет не менее трех, толщина пластины составляет не менее 0,5 мм, а выращенную клеточную культуру собирают не только с поверхности чашки Петри, но и с поверхности прижимающей пластины.