ВЕЩЕСТВА И СПОСОБЫ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ОПОСРЕДОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМАМИ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ НАРУШЕНИЙ Российский патент 2009 года по МПК A61K31/765 A61P31/00 A61F6/04 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к веществам и способам для профилактики или лечения опосредованных микроорганизмами эпителиальных нарушений, таких как энтерогенный сепсис.

ПРЕДПОСЫЛКИ

Опосредованные микроорганизмами эпителиальные нарушения или патологические состояния представляют собой значительную опасность для здоровья человека и животных, налагая нагрузку на системы здравоохранения во всем мире. Один из примеров таких нарушений, энтерогенный сепсис, представляет собой основную причину смертности среди таких организмов, как люди, страдающие любым из множества заболеваний, нарушений или физических недостатков, таких как ожоговые поражения, энтероколиты новорожденных, тяжелая нейтропения, воспалительное заболевание кишечника и отторжение органов после трансплантации. Давно признано, что пространство кишечного тракта является потенциально летальным очагом опосредованного бактериями сепсиса, например, у тяжело больных, госпитализированных пациентов. Способность болезнетворных микроорганизмов, таких как псевдомонады (например, Pseudomonas aeruginosa), нарушать регуляторную функцию кишечного эпителиального барьера может являться определяющей характеристикой условно-патогенных микроорганизмов, способных вызывать энтерогенный сепсис. Во многих случаях данных инфекций в качестве патогенного микроорганизма идентифицировали Pseudomonas aeruginosa. Существенно то, что показано, что кишечный тракт является первичным очагом колонизации условно-патогенными микроорганизмами, такими как P.aeruginosa.

Традиционные терапевтические подходы для профилактики или лечения опосредованных микроорганизмами эпителиальных нарушений, таких как энтерогенный сепсис, не достигают полного успеха. Основанные на антибиотиках способы опасны из-за сложности подбора для кишечных патогенных микроорганизмов антибиотиков в том смысле, чтобы не воздействовать на оставшуюся флору. Кроме того, часто многие кишечные патогенные микроорганизмы, типичным представителем которых является P.aeruginosa, приобретают устойчивость к воздействиям антибиотиков, что приводит к дорогостоящему, длительному и не полностью успешному способу профилактики или лечения. Также затруднения вызывают иммунотерапевтические способы. В частности, многие кишечные микроорганизмы, такие как P.aeruginosa, уклоняются от иммунной системы, делая такие способы минимально эффективными.

Другой способ профилактики или лечения заболеваний, таких как энтерогенный сепсис, представляет собой промывание кишечника. В последние несколько лет предпринимались попытки промывания кишечника с применением растворов полиэтиленгликоля (PEG) при том, что имеется несколько отдельных сообщений, позволяющих предположить, что PEG может в перспективе использоваться для лечения энтерогенного сепсиса при множестве клинических и экспериментальных обстоятельств. Средняя молекулярная масса PEG в данных растворах составляет 3500 дальтон, а растворы доступны коммерчески (например, Golytely). Механизмы, посредством которых данные растворы с относительно низкой молекулярной массой (LMW) PEG оказывают терапевтическое действие при лечении или профилактике энтерогенного сепсиса, не известны. Обычно данные растворы применяют для отмывания или промывания кишечного тракта организмов с риском развития энтерогенного сепсиса или страдающих от него. В результате введения данных растворов PEG LMW в кишечный тракт, в зависимости от способа концентрирования и молекулярной массы применяемых соединений в составе флоры обрабатываемого кишечника происходят непостоянные изменения. Например, растворы с концентрацией PEG более чем приблизительно 20% могут вызывать микробицидное действие, приводя к удалению потенциально защитных микроорганизмов в кишечном тракте подвергнутого стрессу хозяина. Также растворы PEG низкой молекулярной массы, несмотря на их консервацию, могут терять эффективность в ослаблении вирулентной способности определенных микроорганизмов. Следовательно, в данной области существует потребность в растворе, ингибирующем проявление вирулентности микроорганизмами (вредные свойства микроорганизма) без уничтожения микроорганизма или находящихся рядом микроорганизмов, таким образом, обеспечивая эффект сохранения природной экосистемы микрофлоры кишечника. Например, сохранение природного состава флоры могло бы обеспечить конкуренцию с условно-патогенными микроорганизмами, которые в ином случае могут колонизировать кишечник.

Изменение состава флоры сопровождается изменением физиологии организма. Физиологические изменения можно контролировать посредством анализа любого числа характерных видов ферментативной активности, такие как уровни лактатдегидрогеназы. Следовательно, лечение кишечника PEG LMW приводит к значительным изменениям физиологии подвергаемых лечению организмов с непредсказуемыми и, таким образом, потенциально опасными, длительными последствиями для здоровья и хорошего самочувствия подвергаемого лечению организма. Кроме того, такие воздействия провоцируют физически сложные реакции в форме сильного опорожнения кишечника у организмов в критическом состоянии, таких как госпитализированные пациенты.

Таким образом, в данной области остается потребность в композиции, эффективной для профилактики или лечения опосредованного микроорганизмами нарушения (например, энтерогенного сепсиса) и/или симптомов, ассоциированных с таким нарушением, наряду со способами для достижения таких эффектов, без создания возможности для дополнительных осложнений вследствие значительного изменения физиологии подвергаемого лечению организма.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение отвечает указанной выше потребности в данной области посредством предоставления композиции полиэтиленгликоля высокой молекулярной массы (HMW), обеспечивающего эффективную защиту против патологического состояния, характеризующегося эпителиальной поверхностью с риском развития опосредованного микроорганизмами нарушения. Типичные патологические состояния включают в себя энтерогенный сепсис и другие, ассоциированные с кишечной флорой кишечные нарушения/заболевания, обусловленные кишечными патогенными микроорганизмами, включающими в себя в качестве неограничивающих примеров P.aeruginosa. PEG HMW ингибирует или предотвращает контакт таких патогенных микроорганизмов как P.aeruginosa с эпителиальной поверхностью кишечника. Кроме того, PEG высокой молекулярной массы ингибирует проявление вирулентности у данных патогенных микроорганизмов (например, P.aeruginosa), чувствительных к множеству сигналов, которое может включать в себя сети передачи сигнала распознавания кворума. Способность PEG HMW препятствовать инфекционному взаимодействию между кишечным патогенным микроорганизмом и кишечным эпителием обеспечивает альтернативный подход для профилактики или лечения энтерогенного сепсиса, например, после катаболического стресса. Существенно, что лечение PEG HMW могло бы являться рентабельным и относительно простым для осуществления у людей, а также у множества других организмов, таких как значимый с точки зрения сельского хозяйства скот (например, крупный рогатый скот, свиньи, овцы, козы, лошади, куры, индюки, утки, гуси и т.п.), домашние животные и животные в зоопарке.

В одном аспекте данное изобретение относится к способу уменьшения вероятности смертности животного с аномальным состоянием, включающим в себя патологическое состояние, включающее в себя эпителиальную поверхность с риском развития опосредованного микроорганизмами нарушения, выбранного из группы, состоящей из энтерогенного сепсиса, ожогового повреждения, некротизирующего энтероколита новорожденных, тяжелой нейтропении, токсического колита, воспалительного заболевания кишечника, энтеропатии, отторжения трансплантата, резервуарного илеита и вздутого живота, предусматривающий введение нуждающемуся в этом животному эффективной дозы полиэтиленгликоля (PEG), где средняя молекулярная масса PEG составляет, по меньшей мере, 5000 дальтон. Соответствующие животные включают в себя в качестве неограничивающих примеров собаку, кошку, овцу, козу, корову, свинью и человека. В указанном выше способе средняя молекулярная масса PEG предпочтительно составляет, по меньшей мере, 15000 дальтон, и предпочтительно представляет собой от 5000 до 20000 дальтон или от 15000 до 20000 дальтон. Также предпочтительным является PEG со средней молекулярной массой 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000 13000, 14000 и 25000 дальтон. Кроме того, PEG может находиться в водном растворе, содержащем 5-20% PEG, а предпочтительно - 10-20% PEG (например, 10% PEG). В одном осуществлении способа состояние связано с присутствием в кишечнике микроорганизма Pseudomonas aeruginosa и целостность клеточной мембраны такой P.aeruginosa заметно не изменена. В другом осуществлении способа заметно не изменен характер роста.

В другом аспекте настоящее изобретение представляет собой способ ингибирования энтерогенного сепсиса, включающий в себя контакт эпителия млекопитающего, такого как кишечник, с полиэтиленгликолем (PEG), где средняя молекулярная масса PEG составляет, по меньшей мере, 5000 дальтон, а предпочтительно, по меньшей мере, 15000 дальтон. В одном осуществлении данного способа кишечник млекопитающего контактирует с PEG в течение, по меньшей мере, 30 минут.

Дополнительные аспекты изобретения включают в себя способ ингибирования экспрессии лектина/адгезина PA-I у патогенного микроорганизма эпителия, например кишечного патогенного микроорганизма, где способ включает в себя введение нуждающемуся в этом животному эффективной дозы полиэтиленгликоля; способ ингибирования индуцируемой эпителием (например, индуцируемой кишечным эпителием) активации лектина/адгезина PA-I, включающий в себя введение нуждающемуся в этом животному эффективной дозы полиэтиленгликоля; способ ингибирования индуцированного C4-HSL морфологического изменения патогенного микроорганизма эпителия (например, кишечного патогенного микроорганизма), включающий в себя введение нуждающемуся в этом животному эффективной дозы полиэтиленгликоля; способ уменьшения проявления вирулентности у патогенного микроорганизма эпителия (например, кишечного патогенного микроорганизма), включающий в себя введение нуждающемуся в этом животному эффективной дозы полиэтиленгликоля; способ уменьшения или предотвращения взаимодействия эпителиальной поверхности с фактором вирулентности микроорганизма, включающий в себя введение нуждающемуся в этом животному эффективной дозы полиэтиленгликоля; способ улучшения патогенетического процесса в эпителии (например, кишечном), посредством предотвращения активации патогенного распознавания кворума, включающий в себя введение нуждающемуся в этом животному эффективной дозы полиэтиленгликоля; и способ ингибирования взаимодействия между эпителием (например, кишечным эпителием) позвоночного и бактерией, такой как псевдомонада (например, Pseudomonas aeruginosa), включающий в себя контакт эпителия с полиэтиленгликолем. Во всех данных аспектах изобретения средняя молекулярная масса PEG составляет, по меньшей мере, 5000 дальтон, а предпочтительно, по меньшей мере, 15000 дальтон.

Еще один дополнительный аспект изобретения представляет собой способ препятствия индуцированному Pseudomonas aeruginosa снижению трансэпителиального электрического сопротивления эпителиального слоя млекопитающих, такого как кишечный эпителиальный слой, где способ включает в себя контакт (кишечного) эпителиального слоя с полиэтиленгликолем, где средняя молекулярная масса PEG составляет, по меньшей мере, 5000 дальтон, а предпочтительно, по меньшей мере, 15000 дальтон. Предпочтительно средняя молекулярная масса PEG составляет от 15000 до 20000 дальтон. В предпочтительном осуществлении целостность мембраны микроорганизма (например, P.aeruginosa) заметно не изменена.

Еще один аспект изобретения представляет собой способ ингибирования прикрепления бактериальной клетки к эпителию млекопитающего, такому как кишечник млекопитающего, где способ включает в себя контакт кишечника с полиэтиленгликолем, где средняя молекулярная масса PEG составляет, по меньшей мере, 5000 дальтон, а предпочтительно, по меньшей мере, 15000 дальтон. В данном способе также предпочтительно, чтобы средняя молекулярная масса PEG составляла от 15000 до 20000 дальтон. PEG может находиться в водном растворе, содержащем 5-20% PEG, а предпочтительно - 5-10% PEG. Типичная бактериальная клетка, прикрепление которой рассматривают, как подлежащее ингибированию данным способом, представляет собой псевдомонаду, такую как P.aeruginosa.

Другой аспект изобретения представляет собой способ уменьшения экспрессии на бактериальной клетке лектина/адгезина PA-I, включающий в себя контакт бактериальной клетки с полиэтиленгликолем, где средняя молекулярная масса PEG составляет, по меньшей мере, 5000 дальтон, а предпочтительно - 15000 дальтон, и предпочтительно составляет от 15000 до 20000 дальтон. Кроме того, PEG может находиться в водном растворе, содержащем 5-20% PEG, а предпочтительно - 5-10% PEG.

В другом аспекте изобретение относится к способу уменьшения вероятности смертности животного с опосредованным микроорганизмами эпителиальным нарушением, выбранным из группы, состоящей из энтерогенного сепсиса, ожогового повреждения, некротизирующего энтероколита новорожденных (NEC), тяжелой нейтропении, токсического колита, воспалительного заболевания кишечника, энтеропатии (например, у тяжелобольных), отторжения трансплантата, резервуарного илеита и вздутого живота, где способ включает в себя введение эффективного количества соединения (например, PEG), прилипающего к клетке, выбранной из группы, состоящей из эпителиальной клетки кишечника млекопитающего и бактериальной клетки кишечника, где соединение прилипает к клетке топографически ассиметричным образом, таким образом, ингибируя взаимодействие эпителиальной клетки кишечника млекопитающего и бактериальной клетки. Предпочтительное соединение представляет собой поверхностно-активное вещество. В одном осуществлении данного способа соединение представляет собой PEG, с молекулярной массой, по меньшей мере, 15000 дальтон. В другом осуществлении данного способа ингибирование определяют посредством атомно-силовой микроскопии. В еще одном осуществлении данного способа бактериальная клетка представляет собой кишечный патогенный микроорганизм, и нет детектируемого изменения характеристик его роста. В связанных аспектах данный способ дополнительно включает в себя введение в кишечник животного эффективного количества декстрана и/или введение в кишечник животного эффективного количества L-глутамина, покрытого декстраном L-глутамина, покрытого декстраном инулина, покрытой декстраном масляной кислоты, одного или несколько фруктоолигосахаридов, N-ацетил-D-галактозамина, покрытой декстраном маннозы и галактозы, лактулозы и уравновешивающих буферов и стабилизирующих средств, известных в данной области. Когда введение проводят совместно в виде одной композиции, данное многокомпонентное введение в одном растворе очищает кишечный тракт и подготавливает к противостоянию нарушению кишечной флоры и барьерной функции кишечника, так как происходит после тяжелых стрессов катаболического, хирургического и травматического характера.

Другой аспект изобретения представляет собой способ улучшения симптомов, связанных с любым заболеванием или состоянием, возникающим вследствие аномального состояния эпителия или характеризующихся им, таким как энтерогенный сепсис, где способ включает в себя введение в кишечник полиэтиленгликоля, где средняя молекулярная масса PEG составляет, по меньшей мере, 5000 дальтон, предпочтительно - по меньшей мере, 15000 дальтон, и предпочтительно составляет от 15000 до 20000 дальтон. PEG может находиться в водном растворе, содержащем 5-20% PEG, а предпочтительно - 5-10% PEG. Изобретение относится к улучшению симптомов, связанных с любым описанным здесь заболеванием или состоянием.

Еще один аспект изобретения представляет собой способ профилактики потери способности к лактации у животного с патологическим состоянием в форме риска развития на эпителиальной поверхности молочной железы опосредованного микроорганизмами нарушения, влияющего на продукцию молока, где способ включает в себя нанесение, например, топически, эффективной дозы полиэтиленгликоля массой, по меньшей мере, 5000 дальтон, а предпочтительно - по меньшей мере, 15000 дальтон, на эпителиальную поверхность молочной железы. Типичные животные включают в себя млекопитающих, таких как овцы, козы, коровы, свиньи, лошади и люди. В связанном аспекте изобретение относится к способу лечения потери способности к лактации у животного, характеризующегося опосредованным микроорганизмами нарушением эпителиальной поверхности молочной железы, влияющим на продукцию молока, где способ включает в себя нанесение, например, топически, эффективной дозы полиэтиленгликоля массой, по меньшей мере, 5000 дальтон, а предпочтительно, по меньшей мере, 15000 дальтон, на молочную железу. В другом связанном аспекте изобретение относится к способу профилактики развития опосредованного микроорганизмами эпителиального нарушения у животного в грудном возрасте, где способ включает в себя введение животному эффективной дозы полиэтиленгликоля массой, по меньшей мере, 5000 дальтон, а предпочтительно, по меньшей мере, 15000 дальтон. Подходящие животные включают в себя млекопитающих, таких как люди, сельскохозяйственный скот, домашние животные и животные в зоопарке. В одном из осуществлений PEG смешивают с любой смесью для питания младенцев, известной в данной области.

Связанный аспект изобретения представляет собой композицию, содержащую смесь для питания младенцев и полиэтиленгликоль (PEG), где средняя молекулярная масса PEG составляет, по меньшей мере, 5000 дальтон. Кроме того, можно применять любую смесь для питания младенцев, известную в данной области, включая сюда смеси, основанные на молоке животных, таком как коровье молоко, козье молоко и т.п., а также смеси, основанные на соевом молоке. Смесь также можно обогащать любым витамином и/или элементом, включая сюда добавление железа. Средняя молекулярная масса PEG составляет, по меньшей мере, 15000 дальтон, и он предпочтительно находится в диапазоне 5-20% после восстановления влагосодержания или гидратации смеси для питания младенцев или детей младшего возраста. Кроме того, изобретение относится к способу предоставления питания для животного, предпочтительно в грудном возрасте, где способ включает в себя введение животному эффективной дозы композиции, состоящей из смеси для питания младенцев и PEG.

Еще один аспект изобретения представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую полиэтиленгликоль со средней молекулярной массой, по меньшей мере, 5000 дальтон, а предпочтительно - 15000 дальтон, и пригодный адъювант, носитель или разбавитель. В связанном аспекте композиция дополнительно включает в себя соединение, выбранное из группы, состоящей из покрытого декстраном L-глютамина, покрытого декстраном инулина, покрытой декстраном масляной кислоты, одного или нескольких фруктоолигосахаридов, N-ацетил-D-галактозамина, покрытой декстраном маннозы и галактозы, лактулозы и уравновешивающих буферов и стабилизирующих средств, известных в данной области.

Дополнительный аспект изобретения представляет собой набор для терапевтического лечения или профилактики патологического состояния, характеризующегося эпителиальной поверхностью с риском развития опосредованного микроорганизмами нарушения, такого как энтерогенный сепсис, где набор содержит одну из описанных выше фармацевтических композиций и протокол, описывающий применение композиции для терапевтического лечения или профилактики патологического состояния. Пригодные для включения в набор протоколы описывают любой один из описанных здесь терапевтических или профилактических способов.

Другие аспекты изобретения относятся к способам профилактики патологического состояния, характеризующегося эпителиальной поверхностью с риском развития опосредованного микроорганизмами нарушения, включая сюда заболевания. Например, изобретение относится к способу профилактики заболевания или патологического состояния, где способ включает в себя введение животному композиции, содержащей эффективную дозу полиэтиленгликоля (PEG), где средняя молекулярная масса PEG составляет, по меньшей мере, 5000 дальтон. Подходящее заболевание или патологическое состояние, подлежащее воздействию профилактическими способами по изобретению, выбрано из группы, состоящей из "уха пловца", острого отита среднего уха, хронического отита среднего уха, ассоциированной с вентиляторами пневмонии, энтерогенного сепсиса, некротизирующего энтероколита, индуцированной антибиотиками диареи, псевдомембранозного колита, воспалительного заболевания кишечника, синдрома раздраженной кишки, нейтропенического энтероколита, панкреатита, синдрома хронической усталости, синдрома дисбиоза, микроскопического колита, хронической инфекции мочевыводящих путей, передающегося половым путем заболевания и инфекции. Животное, подходящее в качестве субъекта для таких профилактических способов, выбрано из группы, состоящей из собаки, кошки, овцы, козы, коровы, свиньи, курицы, лошади и человека. Предпочтительно средняя молекулярная масса PEG составляет, по меньшей мере, 15000 дальтон; также предпочтителен PEG со средней молекулярной массой от 15000 до 20000 дальтон. Кроме того, PEG может находиться в водном растворе, содержащем 10-20% PEG, а предпочтительно - 10% PEG. Композиция для введения также может дополнительно содержать носитель, выбранный из группы, состоящей из жидкого раствора, топического геля и раствора, пригодного для распыления. Кроме того, композиция может дополнительно содержать вещество, выбранное из группы, состоящей из покрытого декстраном L-глутамина, покрытого декстраном инулина, покрытой декстраном масляной кислоты, фруктоолигосахарида, N-ацетил-D-галактозамина, покрытой декстраном маннозы, галактозы и лактулозы. В одном из осуществлений композиция содержит PEG, покрытый декстраном L-глутамин, покрытый декстраном инулин, покрытую декстраном масляную кислоту, фруктоолигосахарид, N-ацетил-D-галактозамин, покрытую декстраном маннозу, галактозу и лактулозу.

Еще один аспект изобретения представляет собой способ профилактики кожной инфекции, включающий в себя стадию применения для животного композиции, содержащей эффективное количество полиэтиленгликоля (PEG), где средняя молекулярная масса PEG составляет, по меньшей мере, 5000 дальтон. Композиция дополнительно может содержать носитель, выбранный из группы, состоящей из мази, крема, геля или лосьона. В изобретении полагают, что возбудитель, вызывающий инфекцию, выбран из группы, состоящей из Bacillus anthracis, вируса оспы, энтеропатогенной E.coli (EPEC), энтерогеморрагической E.coli (EHEC), энтероагрегативной E.coli, (EAEC), Clostridium difficile, ротавируса, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Klebsiella oxytocia, Enterobacteria cloacae, Candida albicans и Candida globrata.

Другой аспект изобретения представляет собой способ профилактики респираторной инфекции, включающий в себя стадию введения животному эффективного количества полиэтиленгликоля (PEG), где средняя молекулярная масса PEG составляет, по меньшей мере, 5000 дальтон. Респираторная инфекция, подлежащая воздействию профилактическими способами по изобретению, может возникать вследствие контакта с возбудителем инфекции посредством известного в данной области маршрута, включая сюда пневмонии, ассоциированные с вентиляторами (например, ассоциированная с вентиляторами пневмония), переносимые по воздуху возбудители инфекции, возбудители инфекции рассеянные в распыленной жидкости, такой как чихание и т.п. В некоторых осуществлениях способ позволяет предотвращать респираторную инфекцию, вызванную возбудителями, выбранными из группы, состоящей из Bacillus anthracis и вируса оспы.

Еще один аспект изобретения представляет собой способ орошения, по меньшей мере, части мочевыводящих путей для профилактики хронической инфекции мочевыводящих путей, где способ включает в себя стадию введения в мочеиспускательный канал эффективного количества композиции, содержащей PEG, где средняя молекулярная масса PEG составляет, по меньшей мере, 5000 дальтон. В одном из осуществлений композицию вводят в часть мочеиспускательных путей, включающую, по меньшей мере, мочевой пузырь.

Другой аспект изобретения представляет собой способ профилактики передающегося половым путем заболевания, где способ включает в себя стадию нанесения полиэтиленгликоля на презерватив, где средняя молекулярная масса PEG составляет, по меньшей мере, 5000 дальтон. Связанный аспект изобретения представляет собой презерватив, содержащий, по меньшей мере, частичное покрытие PEG со средней молекулярной массой, по меньшей мере, 5000 дальтон. Еще один связанный аспект изобретения представляет собой набор, содержащий презерватив и полиэтиленгликоль (PEG) со средней молекулярной массой, по меньшей мере, 5000 дальтон.

Изобретение также относится к способу профилактики нарушения желудочно-кишечного тракта, где способ включает в себя введение нуждающемуся в этом животному эффективной дозы композиции, содержащей полиэтиленгликоль (PEG), где средняя молекулярная масса PEG составляет, по меньшей мере, 5000 дальтон. Типичные нарушения желудочно-кишечного тракта, подлежащие воздействию профилактическими способами по изобретению, можно выбрать из группы, состоящей из некротизирующего энтероколита новорожденных, индуцированной антибиотиками диареи, псевдомембранозного колита, воспалительного заболевания кишечника, синдрома раздраженной кишки, нейтропенического энтероколита, панкреатита, синдрома дисбиоза и микроскопического колита.

Другой аспект изобретения представляет собой способ мониторинга введения полиэтиленгликоля (PEG) нуждающемуся в этом животному, где способ включает в себя введение нуждающемуся в этом животному эффективного количества композиции, содержащей меченый PEG, где средняя молекулярная масса PEG составляет, по меньшей мере, 5000 дальтон, и детекцию меченого PEG, посредством чего количество и/или локализация меченого PEG (например, связанного с микроорганизмом) предоставляет информацию, пригодную для оценки эффективности введения. В одном осуществлении способа мониторинга метка представляет собой флуорофор (например, флуоресцеин, родамин, Cy3, Cy5). В другом осуществлении способа детекция меченого PEG включает в себя эндоскопическое обследование. В способе мониторинга также предусмотрено, что меченый PEG определяют в образце стула (т.е. комплексы меченого PEG с таким компонентом, как микроорганизм, источником которого является образец стула). Кроме того, способ мониторинга может дополнительно включать в себя введение второй метки, специфичной для микроорганизма и второй вторичной метки. Как применяют в данном контексте, "специфичная" означает, что метка заметно ассоциирует, по меньшей мере, с одним микроорганизмом.

Другой аспект изобретения представляет собой способ для мониторинга введения полиэтиленгликоля (PEG) нуждающемуся в этом животному, где способ включает в себя получения образца у животного, получавшего полиэтиленгликоль, где средняя молекулярная масса PEG составляет, по меньшей мере, 5000 дальтон, приведение образца в контакт с эпителиальной клеткой и измерение прикрепления микроорганизма в образце к эпителиальной клетки, посредством чего количество и/или локализация PEG предоставляет информацию, пригодную для оценки эффективности введения. Измерение можно сопровождать микроскопическим исследованием.

Другой способ мониторинга по изобретению представляет собой способ для мониторинга введения полиэтиленгликоля (PEG) нуждающемуся в этом животному, где способ включает в себя получения образца у животного, получавшего полиэтиленгликоль, где средняя молекулярная масса PEG составляет, по меньшей мере, 5000 дальтон, приведение слоя эпителиальных клеток в контакт с образцом и измерение трансэпителиального электрического сопротивления эпителиального слоя, посредством чего по уменьшенному снижению трансэпителиального электрического сопротивления по сравнению с контрольной величиной измеряют эффективность введения. Контрольная величина может являться внутренней (т.е. измерение TEER перед введением PEG) или внешней (т.е. полученная в других исследованиях величина, которую надежно применять для сравнения).

Еще один способ мониторинга по изобретению представляет собой способ мониторинга введения полиэтиленгликоля (PEG) нуждающемуся в этом животному, где способ включает в себя получение образца у животного, получавшего полиэтиленгликоль, где средняя молекулярная масса PEG составляет, по меньшей мере, 5000 дальтон, выделение из образца микроорганизма и измерения гидрофобности клеточной поверхности микроорганизма, посредством чего гидрофобность микроорганизма в образце предоставляет информацию, пригодную для оценки эффективности введения. Как применяют в данном контексте, "выделение" означает отделение от других компонентов образца (например, от твердого вещества) в степени, достаточной для обеспечения возможности измерения гидрофобности, как понимают в данной области.

Связанный аспект изобретения представляет собой набор для мониторинга введения полиэтиленгликоля, содержащий меченый PEG и протокол, описывающий применение меченого PEG для мониторинга его введения. Пригодные протоколы включают в себя любой из способов, описанных здесь или известных в области, относящейся к введению, доставке или нанесению PEG. В некоторых осуществлениях данного аспекта изобретения набор дополнительно содержит свободную метку.

Еще один способ мониторинга по изобретению представляет собой способ мониторинга введения полиэтиленгликоля (PEG) нуждающемуся в этом животному, где способ включает в себя получение образца у животного, получавшего полиэтиленгликоль, где средняя молекулярная масса PEG составляет, по меньшей мере, 5000 дальтон, и детекцию активности лектина/адгезина PA-I в образце, посредством чего активность лектина/адгезина PA-I предоставляет информацию, пригодную для оценки эффективности введения. В одном осуществлении данного способа лектин/адгезин PA-I детектируют посредством связывания с лектином/адгезином PA-I партнера по связыванию, такого, как любое из известных специфичных антител против лектина/адгезина PA-I или углевод, с которым лектин/адгезин специфически связывается. Связанный аспект изобретения представляет собой набор для мониторинга введения полиэтиленгликоля (PEG), содержащий партнер по связыванию с лектином/адгезином PA-I и протокол, описывающий применение партнера по связыванию для детекции лектина/адгезина PA-I в образце. Пригодные протоколы включают в себя любой из способов, описанных здесь или известных в области, относящейся к применению PEG.

Другие возможности и преимущества настоящего изобретения будут лучше понятны, исходя из следующего далее подробного описания, включающего в себя рисунки и примеры.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигуре 1 представлены коэффициенты смертности у мышей за 48 часов, подвергнутых или ложной лапаротомии, или хирургической резекции 30% печени с последующей прямой инъекцией PA27853 P.aeruginosa в слепую кишку. Мышей сразу подвергали 30% бескровной гепатэктомии левой доли с последующей прямой инъекцией в слепую кишку 1×10⁷ КОЕ/мл PA27853. Каждая группа включала в себя 7 мышей. Контрольных мышей подвергали ложной лапаротомии с последующей инъекцией равных количеств PA27853 в слепую кишку. Для мышей в группе с введением PEG до инъекции в слепую кишку 1×10⁷ КОЕ/мл PA27853 суспендировали или в PEG 3,35 (PEG LMW 3350) или в PEG 15-20 (PEG HMW от 15000 до 20000 дальтон). Кривые "доза-ответ" для PEG 15-20 представлены в части b. a. Статистически значимый защитный эффект PEG 15-20 определяли посредством точного критерия Фишера (p<0,001). b. Определили, что минимальная защитная концентрация PEG 15-20 составляла 5% (p<0,05). c. Количественные бактериальные культуры содержимого слепой кишки (фекалии), отмытой слизистой слепой кишки, печени и крови через 24 часа после хирургической резекции 30% печени и прямой инъекции в слепую кишку 1×10⁷ КОЕ/мл PA27853. Односторонний ANOVA показал статистически значимое увеличение числа бактерий в содержимом слепой кишки, слизистой, печени и крови у мышей после гепатэктомии (p<0,001). Для PEG 3350 наблюдали значимое уменьшение (p<0,05) количества бактерий в печени и крови, тогда как PEG 15-20 полностью предотвращал распространение PA27853 в печени и крови мышей.

На фигуре 2 представлен защитный эффект PEG 15-20 против индуцированной PA27853 дисфункции эпителиального барьера, как оценивалось посредством измерения трансэпителиального электрического сопротивления (TEER). a. Данные, представляющие средний ± SEM из культур, взятых в трех экземплярах (n=7), процент максимального падения TEER от исходного уровня, наблюдаемый в течение 8 часов воздействия 1×10⁷ КОЕ/мл PA27853 на апикальные поверхности. В клетках Caco-2, подвергнутых воздействию PA27853, показано статистически значимое уменьшение TEER (односторонний ANOVA (p<0,001)). Для PEG 15-20 показан статистически значимый защитный эффект в отношении падения TEER, индуцированного PA27853 (p<0,001). b. Изображение клеток Caco-2 в присутствии PEG 3,35 и воздействия PA27853 на апикальные поверхности. Изображения, полученные после 4 часов совместного культивирования, демонстрировали потерю целостности монослоя с клетками, плавающими на 30-40 микрон выше клеточных контуров, отображая прикрепление PA27853 к клеточным мембранам. c. У клеток Caco-2, подвергнутых воздействию на апикальные поверхности PA27853, после 4 часов в присутствии PEG 15-20 не выявили доказательств плавающих клеток в любой из исследуемых плоскостей.

На фигуре 3 представлено ингибирующее действие PEG на экспрессию PA-I в PA27853. a. Анализ "вестерн"-блот. Воздействие на PA27853 1 мМ сигнальной молекулы распознавания кворума C4-HSL приводило к статистически значимому увеличению (p<0,001, односторонний ANOVA) экспрессии белка PA-I, которое частично ингибировалось в присутствии 10% PEG 3,35 и намного более ингибировалось в присутствии 10% PEG 15-20. a'. Минимальная ингибирующая концентрация PEG 15-20 для индуцированной C4-HSL экспрессии PA-I составляла 5% (p<0,01). b. Электронная микроскопия отдельных бактериальных клеток, подвергнутых воздействию C4-HSL в присутствии и отсутствие PEG, показала, что C4-HSL вызывала морфологическое изменение в форме и экспрессии пилей у P.aeruginosa. Индуцированный C4-HSL морфологический эффект полностью устранялся в присутствии PEG 15-20, но не PEG 3,35. Вокруг PA27853, подвергнутых воздействию PEG 15-20, можно наблюдать ореолоподобный эффект. c. "Нозерн"-гибридизация. Воздействие на PA27853 0,1 мМ C4-HSL приводило к статистически значимому увеличению (p<0,001, односторонний ANOVA) экспрессии мРНК PA-I, сильно ингибируемому в присутствии 10% PEG 15-20. d. Увеличение мРНК PA-1, индуцированное посредством 4 часов контакта с клетками Caco-2, ингибировалось в присутствие PEG 15-20, но не PEG 3,35 (p<0,001, односторонний ANOVA).

На фигуре 4 показано действие растворов PEG на целостность бактериальной мембраны и характер роста PA27853. a. Действие двух растворов PEG на целостность бактериальной мембраны оценивали посредством способа, состоящего из SYTO 9 и иодида пропидия. Никакой из двух растворов PEG не оказывал какого-либо действия на проницаемость бактериальной мембраны. b. Профили роста PA27853 в двух растворах PEG по сравнению со средой TSB (контроль) без PEG выглядят одинаково.

На фигуре 5 представлены изображения атомно-силовой микроскопии (AFM) клеток Caco-2 и бактериальных клеток, подвергаемых действию PEG. a-c. Изображения AFM клеток Caco-2 в присутствии только среды (a), среды с PEG 3,35 (b) и среды с PEG 15-20. Видно, что PEG 3,35 на клетках Caco-2 формировал ровный ковер (b), тогда как PEG 15-20 формировал более топографически определенное покрытие (c). d-f. Изображения AFM PA27853 в PEG 3,35 и PEG 15-20. PEG 3,35 вокруг отдельной бактериальной клетки формировал гладкую оболочку (e), тогда как PEG 15-20 не только плотно охватывал отдельные клетки (f), но также увеличивал диаметр полимер/бактерия (g, h), таким образом отдаляя отдельные бактерии друг от друга.

На фигуре 6 показано действие раствора PEG на характер рассеивания/агрегации PA27853. Характер рассеивания бактериальных клеток в чашках с dTC3 наблюдали непосредственно с применением флуоресцентного инвертированного микроскопа Axiovert 100 TV с применением фильтров флуоресценции DIC и GFP, при увеличении объектива 63×. Температуру регулировали системой контроля температуры, термостатом Bioptechs. И для возбуждения DIC, и для возбуждения GFP применяли вольфрамовые лампы (100 В). Для изображения характера рассеивания бактериальных клеток в плоскости Z с применением фильтра GFP применяли программное обеспечение обработки 3D-изображений (Slidebook) из Intelligent Imaging Innovations. Без клеток Caco-2 на изображении с применением DIC (6a₁) и реконструированной плоскости Z (6a₂) наблюдали однородно рассеянные, пассивно плавающие клетки P.aeruginosa. В присутствии клеток Caco-2 выявляли расположение бактериальных клеток скоплениями (6b₁) и их видели прикрепленными к клеткам Caco-2 (6b₂). 10% PEG 3350 уменьшал подвижность бактерий и индуцировал немедленное формирование грибовидных бактериальных микроколоний (6c₁), прикрепленных ко дну лунки (6c₂). В присутствии клеток Caco-2 бактериальные микроколонии находились приблизительно на 8 микрон выше плоскости эпителиальных клеток (6d_1,2). 10% PEG 15-20 значительно сокращал подвижность клеток P.aeruginosa. Однако в течение первых 0,5-1 часа инкубации в содержащей PEG 15-20 среде бактериальные клетки формировали микроколонии в форме паука, которые располагались в непосредственной близости с дном лунки (6e_1,2). В течение нескольких часов микроколонии в форме ножек паука полностью занимали пространство/объем среды (не показано). В присутствии клеток Caco-2 клетки P.aeruginosa теряли подобное пауку очертание и их видели приподнятыми значительно выше плоскости эпителия (30-40 микрон) (6f_1,2).

Фигуры 7 и 8 также поясняют предлагаемое изобретение.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к продуктам и способам, совместно предоставляющим простые и экономичные подходы к лечению и/или профилактике ряда опосредованных микроорганизмами нарушений эпителия, т.е. патологических состояний и заболеваний, поражающих многих млекопитающих, включая людей. Посредством введения нуждающемуся в этом животному, включая сюда животных с риском, полярных полимеров с высокой молекулярной массой, таких как полиэтиленгликоль HMW, можно с минимальными затратами и минимальным обучением исполнителей лечить любое из ряда угрожающих здоровью или жизни патологических состояний, т.е. нарушений эпителия и заболеваний, включая сюда энтерогенный сепсис. Без желания быть связанным теорией, преимущества, обеспечиваемые данным изобретением, согласуются с принципом, что опосредованные микроорганизмами эпителиальные нарушения можно успешно предотвращать, облегчать или лечить способствованием среде, благоприятной для выживания таких микроорганизмов. Следующее ниже более подробное описание изобретения легче понять при предварительном установлении следующего понимания применяемых в данном описании терминов.

"Патологическое состояние" определено широко для включения заболеваний млекопитающих, нарушений у млекопитающих и любого аномального состояния здоровья млекопитающих, которое характеризуется эпителиальной поверхностью с риском развития опосредованного микроорганизмами нарушения. Патологические состояния, характеризующиеся эпителиальной поверхностью с риском развития опосредованного микроорганизмами нарушения, включают в себя состояния, при которых на эпителиальных поверхностях развивается опосредованное микроорганизмами нарушение. Типичные состояния включают в себя человеческие заболевания и нарушения у человека, требующие медицинского вмешательства или развивающиеся вследствие него, такие как ожоговое повреждение, энтероколит новорожденных, тяжелая нейтропения, воспалительное заболевание кишечника, энтеропатия (например, у тяжелобольных) и отторжение трансплантата (например, органа).

"Ожоговое повреждение" означает повреждение ткани млекопитающего, происходящее вследствие воздействия на ткань тепловой энергии, например в форме открытого огня, пара, горячей жидкости и горячей поверхности.

"Тяжелая нейтропения" определена в ее обычном и привычном значении, означающем заметное уменьшение количества циркулирующих нейтрофилов.

"Отторжение трансплантата" относится к любому развитию состояния трансплантированного материала (например, органа), определяемого как ассоциированное с окончательным отторжением данного материала организмом хозяина.

"Введение" определено в его обычном и привычном значении, означающем доставку любыми признанными в данной области способами. Типичные формы введения включают в себя пероральную доставку, анальную доставку, прямую пункцию или инъекцию, местное применение и аэрозоль (например, распыляемый аэрозоль), применение геля или жидкости для глаза, уха, носа, рта, анального прохода или мочеиспускательного канала.

"Эффективная доза" представляет собой такое количество вещества, которое обеспечивает благоприятный эффект на получающий дозу организм и может варьировать в зависимости от цели введения дозы, размера и состояния получающего дозу организма и других переменных, признанных в данной области как значимые для определения эффективной дозы. Процесс определения эффективной дозы включает в себя стандартные процедуры оптимизации, известные специалисту в данной области.

"Животное" определено в его традиционном значении, означающем отличное от растения и одноклеточного организма живое существо. Предпочтительное животное представляет собой млекопитающее, такое как человек.

В контексте данного описания "нуждающийся" представляет собой состояние организма, органа, ткани или клетки, которое можно улучшить введением в характеризующийся данным состоянием организм эффективной дозы. Например, человек с риском развития энтерогенного сепсиса, или проявляющий его симптомы, представляет собой организм, нуждающийся в эффективной дозе такого продукта, как фармацевтическая композиция по настоящему изобретению.

"Средняя молекулярная масса" определена в ее обычном и привычном значении, означающем арифметическое среднее молекулярных масс компонентов (например, молекул) композиции, независимо от точности определения данного среднего. Например, полиэтиленгликоль, или PEG, со средней молекулярной массой в размере 3,5 килодальтон может содержать молекулы PEG различной молекулярной массы при условии, что среднее арифметическое их молекулярных масс определено как 3,5 килодальтон на том уровне точности, который может отражать оценку арифметического среднего, как понимают в данной области. Аналогично, PEG 15-20 означает PEG, чьи молекулярные массы дают среднее арифметическое от 15 до 20 килодальтон, при условии, что арифметическое среднее удовлетворяет указанным выше предостережениям. Данные молекулы PEG включают в себя в качестве неограничивающих примеров простые полимеры PEG. Например, множество относительно меньших молекул PEG (например, от 7000 до 10000 дальтон) необязательно можно связывать с линкерной молекулой, такой как фенол, в одну молекулу с большей средней молекулярной массой (например, от 15000 до 20000 дальтон).

"Целостность клеточной мембраны" означает относительное отсутствие функционально значимых изменений клеточной мембраны как функционального компонента живой клетки, как понимают в данной области.

"Заметно не изменен" определено в его обычном и привычном значении, означающем изменение, которое различают с применением средств детекции, пригодных в данных условиях, как понимают в данной области.

"Характер роста" в собирательном значении относится к значениям таких свойств клетки или группы клеток (например, популяции клеток), которые признаны в данной области, как характеризующие клеточный рост, таким как время генерации или удвоения клетки, появление рельефа возникающей группы клеток и другие переменные, признанные в данной области, как способствующие пониманию характера роста клетки или группы клеток.

"Ингибирование" определено в его обычном и привычном значении, означающем ингибирование с уменьшением или предотвращением. Например, ингибирование морфологического изменения означает, что данное морфологическое изменение становится более трудным или полностью предотвращается.

"Экспрессия PA-I" или "экспрессия лектина/адгезина PA-I" означает продукцию PA-I или появление активности, характерной для лектина/адгезина PA-I. Как правило, экспрессия лектина/адгезина PA-I включает в себя трансляцию кодирующей лектин/адгезин PA-I мРНК с продукцией полипептида лектина/адгезина PA-I, по меньшей мере, с одним видом активности, характерной для лектина/адгезина PA-I. Необязательно лектин/адгезин PA-I дополнительно включает в себя транскрипцию кодирующей лектин/адгезин PA-I ДНК с продукцией указанной выше мРНК.

"Индуцируемая эпителием активация" относится к увеличению активности определенной мишени (например, лектина/адгезина PA-I) посредством прямого или непрямого влияния эпителиальной клетки. Например, в контексте настоящего изобретения индуцируемая эпителием активация лектина/адгезина PA-I относится к увеличению активности данного полипептида, которую можно приписать непрямому влиянию эпителия, выражающемуся прямым контактом эпителиальной клетки или клеток с кишечным патогенным микроорганизмом.

"Морфологическое изменение" определено в его обычном и привычном значении, означающем изменение формы.

"Кишечный патогенный микроорганизм" означает патогенный микроорганизм, способный, в целом или частично, служить причиной энтерогенного сепсиса у животного, такого как человек. Известные в данной области кишечные патогенные микроорганизмы, охватываемые данным определением, включают в себя грамотрицательные бациллы, такие как псевдомонады (например, Pseudomonas aeruginosa).

"Облегчение" означает уменьшение степени или тяжести, согласуясь с его обычным и привычным значением.

"Патогенный кворум" означает агрегацию или ассоциацию достаточного количества патогенных организмов (например, P.aeruginosa) для инициации или поддержания сигнала распознавания кворума, как известно в данной области.

"Взаимодействие" определено в его обычном и привычном значении, означающем взаимодействие, как взаимодействие между двумя или несколькими биологическими продуктами, такими как молекулы, клетки и т.п.

"Трансэпителиальному электрическому сопротивлению", или TEER, придают значение, которое данная фраза приобрела в данной области, что относится к измерению электрического сопротивления эпителиальной ткани, что без исключений пригодно в оценке статуса плотных контактов между эпителиальными клетками в эпителиальной ткани.

"Адгезия" определена в ее обычном и привычном значении, означающем физическую ассоциацию, более длительную, чем кратковременный период.

"Топографически ассиметричный" относится к изображению, карте или другому представлению поверхности трехмерного объекта (например, клетки), которое не симметрично.

"Атомно-силовая микроскопия", также известная как сканирующая силовая микроскопия, представляет собой технику для получения топографической карты вещества с высоким разрешением посредством применения свободно свисающего зонда перемещающегося по поверхности образца при растровом сканировании и применение высокочувствительных средств для детекции отклонения зонда, как понимают в данной области.

"Фармацевтическая композиция" означает состав соединений пригодных для терапевтического введения живому животному, такому как пациент, представляющий собой человека. Предпочтительные фармацевтические композиции по изобретению содержат раствор, сбалансированный по вязкости, электролитному профилю и осмотическому давлению, содержащий электролит, покрытый декстраном L-глутамин, покрытый декстраном инулин, лактулозу, D-галактозу, N-ацетил-D-галактозамин и 5-20% PEG (15000-20000).

Каждому из "адъюванта", "носителя" или "разбавителя" придают значение, которое данные термины приобрели в данной области. Адъювант представляет собой одно или несколько веществ, служащих для пролонгирования иммуногенности совместно вводимого иммуногена. Носитель представляет собой одно или несколько веществ, облегчающих такую процедуру как перемещение переносимого вещества. Разбавитель представляет собой одно или несколько веществ, уменьшающих концентрацию или разбавляющих данное вещество, смешиваемое с разбавителем.

"PEG HMW" относится к PEG с относительно большой молекулярной массой, определенному как PEG со средней молекулярной массой, большей чем 3,5 килодальтон. Предпочтительно средняя молекулярная масса PEG HMW является большей, чем 5 килодальтон, и в конкретных осуществлениях средняя молекулярная масса PEG HMW составляет, по меньшей мере, 8 килодальтон, по меньшей мере, 15 килодальтон и от 15 до 20 килодальтон.

Следующие ниже примеры иллюстрируют осуществления изобретения. В примере 1 описана защита от энтерогенного сепсиса, обеспечиваемая мышам с гепатэктомией PEG высокой молекулярной массы. В примере 2 описано как PEG HMW предотвращает прикрепление патогенного микроорганизма к клеткам кишечного эпителия. В примере 3 раскрыто как PEG HMW ингибирует проявление патогенной вирулентности в целом и экспрессию лектина/адгезина PA-I, в частности. В примере 4 показано, что PEG не влияет на рост или целостность мембран клеток патогенных организмов. В примере 5 проиллюстрирована уникальная топографическая конфигурация покрытых PEG HMW патогенных микроорганизмов с применением атомно-силовой микроскопии. В примере 6 описаны межклеточные взаимодействия под воздействием PEG HMW. В примере 7 описаны профилактические способы с применением композиций по изобретению. В примере 8 описаны способы мониторинга введения PEG HMW, такого как способы лечения по изобретению, и соответствующие наборы.

ПРИМЕР 1

PEG HMW защищает от энтерогенного сепсиса после 30% резекции печени

Самцов мышей Balb/c анестезировали и подвергали гепатэктомии с применением стандартного протокола. Проводили 30% бескровную резекцию печени вдоль свободной левой доли. Контрольных мышей подвергали манипуляции с печенью без гепатэктомии. Каждая из экспериментальных и контрольных групп включала в себя по семь мышей. Всем мышам в основание слепой кишки посредством прямой пункции иглой инъецировали 200 мкл Pseudomonas aeruginosa PA27853 в концентрации 10⁷ КОЕ/мл, разбавленных физиологическим раствором, PEG 3,350 или PEG 15-20 (PEG). PEG с относительно низкой молекулярной массой коммерчески доступен; PEG 15-20 со средней молекулярной массой от 15000 до 20000 дальтон представляет собой комбинацию PEG 7-8 и PEG 8-10, ковалентно связанных с фенольным кольцом. Средняя молекулярная масса PEG 7-8 составляет от 7000 до 8000 дальтон, а средняя молекулярная масса PEG 8-10 составляет от 8000 до 10000 дальтон. Специалист в данной области поймет, что PEG HMW включают в себя соединения, содержащие любую из множества субъединиц PEG с каждой субъединицей, обладающей любой из множества средних молекулярных масс, соединенных, предпочтительно ковалентно, друг с другом или с одной или несколькими линкерными молекулами, представляющими собой относительно низкомолекулярные соединения с функциональными группами, пригодными для связывания молекул PEG. Пригодные линкеры в значительной степени сохраняют биологическую активность PEG HMW (сохранение достаточной биологической активности для оказания полезного профилактического или терапевтического действия, как описано здесь).

Для обеспечения постоянного источника PEG в течение эксперимента длительностью 48 часов в тонкую кишку (подвздошная кишка) вводили иглу и в проксимальную кишку ретроградно инъецировали 1 мл физиологического раствора, PEG 3,35 или PEG 15-20. Место прокалывания зашивали шелковой хирургической нитью и слепую кишку промывали спиртом. Мышей возвращали в их клетки и в течение следующих 48 часов давали только H₂O.

Кривые "доза-ответ" для PEG 15-20 представлены на части b фиг.1. a. Статистически значимый защитный эффект PEG 15-20 определяли посредством точного критерия Фишера (p<0,001). b. Определили, что минимальная защитная концентрация PEG 15-20 составляла 5% (p<0,05). c. Количественные бактериальные культуры содержимого слепой кишки (фекалии), отмытой слизистой слепой кишки, печени и крови через 24 часа после хирургической резекции 30% печени и прямой инъекции в слепую кишку 1×10⁷ КОЕ/мл PA27853. Односторонний ANOVA показал статистически значимое увеличение числа бактерий в содержимом слепой кишки, слизистой, печени и крови у мышей после гепатэктомии (p<0,001). Для PEG 3350 наблюдали значимое уменьшение (p<0,05) количества бактерий в печени и крови, тогда как PEG 15-20 полностью предотвращал распространение PA27853 в печени и крови мышей.

Штамм Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (PA27853) представляет собой не образующий слизь изолят из гемокультуры. Прямая инъекция в слепую кишку штамма PA27853 мышам, ранее подвергнутым 30% бескровной хирургической резекции печени, приводило к состоянию клинического сепсиса и отсутствию выживших через 48 часов. Все мыши, подвергнутые ложной лапаротомии без гепатэктомии (контрольные), которым подобным образом инъецировали P.aeruginosa, выживали без каких-либо клинических признаков сепсиса (Фиг.1a). Для определения способности раствором PEG предотвращать или уменьшать смертность в данной модели 200 мкл PA27853 в концентрации 1×10⁷ КОЕ/мл, суспендировали в одном из двух 10% (мас./об.) растворов полиэтиленгликоля (PEG-3,35 и PEG-15-20). PEG 3,35 выбрали, так как он соответствует молекулярной массе PEG, доступных для клинического применения в последние 25 лет (Golytely®). Для сравнения молекулярная масса применяемых по изобретению растворов PEG варьировала от 15 до 20 кДа. Суспендированные штаммы вводили в слепую кишку посредством прямой пункции. PEG 3,35 не оказывал эффекта на смертность у мышей после гепатэктомии, тогда как PEG 15-20 являлся полностью защитным. Фактически PEG 15-20 оказывал статистически значимый защитный эффект, что определяли посредством точного критерия Фишера (p<0,001). Эксперименты "доза-ответ" показали, что 5% раствор является минимальной концентрацией PEG 15-20, которая является полностью защитной (p<0,05; см фиг.1b), хотя специалист в данной области поймет, что можно ожидать, что растворы PEG HMW с концентрацией менее чем 5% окажут некоторый защитный эффект и, таким образом, находятся в объеме настоящего изобретения. В отношении количества бактерий у экспериментальных и контрольных мышей односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) выявил статистически значимое увеличение количества бактерий в содержимом слепой кишки, слизистой, печени и крови мышей после гепатэктомии (p<0,001). Для PEG 3350 наблюдали значимое уменьшение (p<0,05) количества бактерий в печени и крови, тогда как PEG 15-20 полностью предотвращал распространение PA27853 в печень и кровь мышей. PEG 15-20 полностью ингибировал распространение кишечных PA27853 в печень и кровоток (Фиг.1c). Данные показывают, что действие растворов PEG вовлекает механизмы, не являющиеся микробицидными. Вводя PEG при концентрациях, не токсичных для клеток млекопитающих (т.е. ≤ приблизительно 10%), воздействие на характер роста бактерий показать не могли.

Пример демонстрирует, что PEG HMW уменьшает коэффициент смертности, свойственный энтерогенному сепсису у мышей, подвергнутых хирургическому вмешательству в форме частичной гепатэктомии. Данная модель на мышах указывает на то, что терапия PEG HMW пригодна для уменьшения коэффициента смертности у видов животных (т.е. уменьшения вероятности смертности у любого данного организма), таких как млекопитающие, подобные человеку, подвергнутых физиологическому стрессу, такому как инвазивная хирургия (например, частичная гепатэктомия). Ожидают, что лечение PEG HMW будет эффективным в способах предотвращения гибели или тяжелой болезни, связанных с сепсисом, когда его применят после физиологического стресса (например, в период послеоперационного ухода). Кроме того, для уменьшения риска тяжелой болезни или смерти, лечение PEG HMW можно применять до начала физиологического стресса (например, предоперационная подготовка) в условиях, когда наступление стресса предсказуемо. Лечение PEG HMW также пригодно для улучшения симптомов, ассоциированных с заболеванием или патологическим состоянием, связанным с энтерогенным сепсисом.

ПРИМЕР 2

PEG HMW предотвращает прикрепление патогенного микроорганизма к кишечному эпителию

Плотные контакты представляют собой динамические элементы цитоскелета эпителиальной клетки, которые играют ключевую роль в барьерной функции кишечного тракта у млекопитающих. P.aeruginosa приводит к глубокому изменению проницаемости через плотные контакты, что измеряли посредством трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) клеток Caco-2 и T-84. Клетки Caco-2 являются хорошо охарактеризованными клетками человеческого кишечного эпителия, поддерживающими стабильное TEER в культуре, и данная клеточная линия предоставляет общепризнанную модель in vitro поведения кишечных патогенных микроорганизмов in vivo. Для определения защитного эффекта PEG на индуцированные PA27853 P.aeruginosa уменьшения TEER культивируемых в монослоях Caco-2, в присутствии 10% PEG 3,35 или 10% PEG 15-20 на апикальные поверхности двух монослоев Caco-2 инокулировали 1×10⁷ КОЕ/мл PA27853. TEER периодически измеряли в течение 8 часов и записывали максимальное падение TEER.

Только PEG 15-20 значимо защищал против индуцированного P.aeruginosa уменьшения TEER (Фиг.2a). Данные, представленные на фиг.2, представляют собой средний ± SEM из культур, взятых в трех экземплярах (n=7), процент максимального падения TEER от исходного уровня, наблюдаемый в течение 8 часов воздействия 1×10⁷ КОЕ/мл PA27853 на апикальные поверхности. Посредством одностороннего ANOVA (p<0,001), как показано для клеток Caco-2, подвергнутых воздействию PA27853, выявили статистически значимое уменьшение TEER. Для PEG 15-20 показан статистически значимый защитный эффект в отношении падения TEER, индуцированного PA27853 (p<0,001). На фигуре 2b показаны клетки Caco-2 в присутствии PEG 3,35 и воздействия PA27853 на апикальные поверхности. После 4 часов совместного культивирования в присутствии PEG 3,35 наблюдали разрушение монослоев клеток Caco-2 с отображением фокально прикрепленных бактерий, с клетками, плавающими на 30-40 микрон выше контуров монослоев (Фиг.2b). Напротив, на фиг.2c, демонстрирующей изображения клеток Caco-2, подвергнутых воздействию на апикальные поверхности PA27853 после 4 часов в присутствие PEG 15-20, не выявили доказательств плавающих клеток в любой из исследуемых плоскостей. Защитный эффект PEG 15-20 на клеточную целостность Caco-2 связан с меньшей прикрепляемостью бактерий, отраженной в 15 раз большим возвратом бактерий в клеточные супернатанты после 4 часов воздействия 1×10⁶ КОЕ/мл PA27853.

Устойчивость культивируемых с PEG клеток человеческого кишечного эпителия к разрушающему барьер действию P.aeruginosa, как подтверждено посредством сохранения TEER, предлагает практический подход к стабилизации барьерной функции плотных контактов, несмотря на воздействие инвазивных патогенных микроорганизмов. Дополнительным доказательством терапевтической значимости PEG 15-20 является то, что данное соединение не затрагивает функцию эпителиального транспорта (обмен Na+/H+, транспорт глюкозы).

Таким образом, PEG HMW является относительно инертным к кишечному эпителиальному барьеру и обладает на него стабилизирующим действием. Изобретение включает в себя способы лечения нарушений кишечного барьера, связанных с кишечными патогенными микроорганизмами, такими как P.aeruginosa, посредством введения PEG HMW животному, такому как млекопитающее, а предпочтительно - человек. Нарушение кишечного барьера можно выявить любым диагностическим способом или другими средствами, известными в данной области. Однако выявлять нарушение кишечного барьера до лечения PEG HMW необязательно. Низкая стоимость и высокая степень безопасности, связанные с лечением PEG HMW, делают данный подход пригодным и для профилактических мероприятий, особенно направленных в отношении организмов с риском, и для способов лечения, применяемых к животным, по меньшей мере, с одним симптомом, характерным для нарушения кишечного барьера. Способы лечения PEG HMW могут облегчать симптомы, связанные с нарушением кишечного барьера; предпочтительно способы будут уменьшать или устранять в подвергаемом лечении организме эффекты энтерогенного сепсиса.

ПРИМЕР 3

PEG HMW ингибирует проявление вирулентности патогенными микроорганизмами

В слепой кишке мышей после гепатэктомии увеличивалась экспрессия лектина/адгезина PA-I у PA27853 P.aeruginosa и играла ключевую роль в летальном действии P.aeruginosa в кишечники мыши. PA-I функционирует как значимая вирусная детерминанта в кишечнике мыши, облегчая прикрепления PA27853 к эпителию, а также создавая значительную недостаточность барьера для цитотоксинов, экзотоксина A и эластазы. Экспрессия PA-I у P.aeruginosa регулируется регулятором транскрипции RhIR и узнаваемым им активатором C4-HSL. Экспрессия PA-I у PA27853 увеличивалась не только под воздействием C4-HSL, но также при контакте с клетками Caco-2, препаратами клеточной мембраны Caco-2 и супернатантами клеточных культур Caco-2.

Для анализа экспрессии PA-I на транскрипционном уровне применяли "нозерн"-гибридизацию. Тотальную РНК P.aeruginosa выделяли модифицированным трехдетергентным способом. Зонды получали посредством ПЦР с применением праймеров для PA-I: F (ACCCTGGACATTATTGGGTG) (SEQ ID No. 1), R (CGATGTCATTACCATCGTCG) (SEQ ID No. 2) и праймеров для 16S: F (GGACGGGTGAGTAATGCCTA) (SEQ ID No. 3), R (CGTAAGGGCCATGATGACTT) (SEQ ID No. 4) и клонировали в вектор pCR2.1 (Invitrogen, Inc.). Вставки представляли собой последовательности, соответствующие или последовательности PA-I или 16S. Специфические для PA-I и 16S зонды кДНК радиоактивно метили посредством α³²P-dCTP. Специфическую радиоактивность измеряли посредством фосфоимиджера Storm 860 (Molecular Dynamics, CA), а относительный процент изменений в сравнении с контролем рассчитывали на основе соотношения интенсивностей PA-I и 16S. Для анализа белка PA-I использовали "вестерн"-блот с применением кроличьих аффинно очищенных поликлональных антител против PA-I. Один мл клеток P.aeruginosa отмывали PBS и нагревали при 100°C в лизирующем буфере (4% SDS, 50 мМ Tris-HCl, pH 6,8); иммуноблот-анализ проводили посредством электроблоттинга белков после SDS-PAGE с трицином. Лектин PA-I выявляли реагентом ECL (Amersham, NJ).

Воздействие на PA27853 1 мМ сигнальной молекулы распознавания кворума C4-HSL приводило к статистически значимому увеличению (p<0,001, односторонний ANOVA) экспрессии белка PA-I, которое частично ингибировалось в присутствии 10% PEG 3,35 и ингибировалось в значительно большей степени в присутствии 10% PEG 15-20 (Фиг.3). Минимальная полностью ингибирующая концентрация PEG 15-20 для индуцированной C4-HSL экспрессии PA-I составляла 5% (p<0,01, односторонний ANOVA). Исследование посредством электронной микроскопии отдельных бактериальных клеток, подвергнутых воздействию C4-HSL в присутствии и отсутствие PEG, показало, что C4-HSL вызывала морфологическое изменение в форме и экспрессии пилей у P.aeruginosa (Фиг.3b). Индуцированный C4-HSL морфологический эффект полностью устранялся в присутствии PEG 15-20, но не PEG 3,35. Вокруг PA27853, подвергнутых воздействию PEG 15-20, можно наблюдать ореолоподобный эффект (Фиг.3b).

Воздействие на PA27853 0,1 мМ C4-HSL приводило к статистически значимому увеличению (p<0,001, односторонний ANOVA) экспрессии мРНК PA-I, оцениваемому с применением "нозерн"-блотинга. Экспрессия PA-I сильно ингибировалась в присутствии 10% PEG 15-20. На фиг.3d показано, что увеличение мРНК PA-1, индуцированное посредством 4 часов контакта с клетками Caco-2, ингибировалось в присутствии PEG 15-20, но не PEG 3,35 (p<0,001, односторонний ANOVA).

Представленные здесь данные показывают, что когда бактерии предварительно обрабатывали 10% PEG 15-20, у PA27853 наблюдали значимое снижение (уменьшение в 3-4 раза) экспрессии PA-I (белка и мРНК), индуцированной 100 мкМ - 1 мМ C4-HSL. Данный эффект не наблюдали в присутствии PEG 3,35 (Фиг.3a). Для 10% PEG 3,35 также наблюдали снижение индуцированной C4-HSL экспрессии PA-I, хотя степень снижения являлась значительно меньшей, чем для 10% PEG 15-20. Минимальная концентрация PEG 15-20, ингибирующая индуцированную C4-HSL экспрессию белка PA-I, составляла 5% (Фиг.3b). Электронная микроскопия отдельных бактериальных клеток под воздействием C4-HSL показала, что C4-HSL вызывала морфологическое изменение в форме и экспрессии пилей у PA27853 (Фиг.3b). Индуцированный C4-HSL морфологический эффект полностью устранялся в присутствии PEG 15-20, но не PEG 3,35 (Фиг.3b). Экспрессия PA-I (мРНК), индуцированная контактом в течение 4 часов с клетками Caco-2, ингибировалась в присутствии PEG 15-20, но не PEG 3,35 (Фиг.3b). Защитное действие PEG 15-20 от индуцированной клетками Caco-2 экспрессии PA-I сохранялось в экспериментах с воздействием в течение ночи.

PEG HMW также влияет на проявление вирулентности P.aeruginosa в ответ на известные стимулы. Ослабление индуцированной C4-HSL экспрессии PA-I у PA27853 может являться основным эффектом PEG 15-20, принимая во внимание, что передача сигнала распознавания кворума представляет собой четко доказанный механизм проявления вирулентности данным патогенным микроорганизмом. Полагают, что индуцированное PEG 15-20 препятствие для индуцированной клетками Caco-2 экспрессии PA-I представляет собой важный аспект защитного действия PEG 15-20. Обнаружено, что PEG 15-20 в ответ на профильтрованное содержимое слепой кишки (фекалии) от мышей после 30% гепатэктомии оказывает защитное действие на животных-хозяев посредством ослабления экспрессии PA-I у P.aeruginosa (PA27853). Полагают, что способность PEG 15-20 защищать P.aeruginosa от факторов хозяина, увеличивающих проявление ею вирулентности, представляет собой еще один механизм, посредством которого организмы защищены от энтерогенного сепсиса.

Таким образом, изобретение включает в себя вещества в форме наборов и соответствующие способы введения PEG HMW животному для профилактики или лечения состояния, характеризующегося проявлением фактора или детерминанты вирулентности кишечным патогенным микроорганизмом, таким как одна из псевдомонад. Детерминанта вирулентности может вносить вклад в вирулентность прямо или косвенно. Пример косвенного вклада представляет собой действие лектина/адгезина PA-I P.aeruginosa на прикрепление кишечного патогенного микроорганизма к кишечному эпителию и/или образование недостаточности барьера для цитотоксинов, экзотоксина A и эластазы.

ПРИМЕР 4

PEG не влияет на рост клеток или целостность мембран патогенных микроорганизмов

Действие двух растворов PEG (PEG 3,35 и PEG 15-20) на целостность бактериальных мембран оценивали посредством способа окрашивания, состоящего из SYTO 9 и иодида пропидия. Никакой из двух растворов PEG не оказывал какого-либо действия на проницаемость бактериальной мембраны (Фиг.4a). Целостность мембран определяли по принципу живая/погибшая с применением набора оценки бактериальной жизнеспособности L-3152 (Molecular Probes). Бактерий подсчитывали и количество выражали как КОЕ/мл посредством посевов способом 10-кратного разведения образцов, взятых в различные периоды инкубации. Кривые роста P.aeruginosa, растущих в течение ночи в среде TSB, содержащей один из двух растворов PEG, показали отсутствие ингибирующего эффекта любого из двух растворов PEG на количество бактерий (Фиг.4b). Фактически, характер роста в каждой, содержащей PEG среде, являлся неотличимым от характера роста в среде TSB без PEG. В различные временные точки в течение экспоненциальной и стационарной фаз роста измеряли активность фермента "домашнего хозяйства", вовлеченного в энергетический обмен, лактатдегидрогеназы (LDH). Активность LDH измеряли в анализе сопряженной диафоразной активности с применением субстратной смеси из CytoTox 96 (Promega). Концентрацию белка определяли с применением анализа BA Protein Assay (Pierce). Изменений активности LDH в бесклеточных супернатантах P.aeruginosa, растущей в присутствии PEG, не наблюдали. Результаты данного эксперимента указывают на то, что PEG HMW оказывает незначительное действие на характер роста бактерий.

Способы по изобретению и соответствующие продукты (например, наборы) предоставляют преимущества профилактики или лечения заболеваний или патологических состояний, связанных с энтерогенным сепсисом, без значительного влияния композиции на кишечную флору. Подобным образом, способы и продукты по изобретению можно применять для облегчения симптомов, ассоциированных с такими заболеваниями или патологическими состояниями без значительного изменения микробного состава кишечника. Специалисты в данной области признают, что способы (и наборы), значительно не нарушающие состав флоры кишечника, являются желательными, так как полагают, что такие способы не ведут к вторичным осложнениям со здоровьем, возникающим вследствие такого нарушения.

ПРИМЕР 5

Атомно-силовая микроскопия покрытого PEG патогенного микроорганизма

Однопроцентные аликвоты культуры PA27853, растущей в течение ночи, субкультивировали в трипсинизированном соевом бульоне (TSB) с 10% PEG HMW или без, в течение 4 часов при 37°C. Забирали одну каплю каждой субкультуры и клетки PA27853 P.aeruginosa тщательно отмывали PBS, сушили на поверхности слюды в проходящем воздухе в течение 10 минут и сразу же получали изображение. Получение изображений высушенных бактерий посредством AFM с прерывистым контактом проводили в воздухе с применением Multimode Nanoscope IIIA Scanning Probe Microscope (MMAFM, Digital Instruments). Субконфлуэнтные клетки Caco-2 обрабатывали 10% PEG HMW в течение 4 часов и тщательно отмывали PBS. Получение изображений клеток посредством AFM проводили в PBS без применения уплотнительного кольца. Для электронной микроскопии PA27853 инокулировали в TSB с 1 мМ C4-HSL и 10% PEG HMW или без и инкубировали в течение ночи. Каплю 1% P.aeruginosa окрашивали уранилацетатом и перед исследованием на электронном микроскопе отмывали в 0,5 M NaCl.

Атомно-силовая микроскопия клеток Caco-2 показала классическую неоднородную поверхность с щеточной каемкой микровосинок, тогда как у клеток Caco-2 под воздействием PEG 3,35 на поверхности эпителиальных клеток возникала гладкая плоская структура (Фигуры 5a, c). PEG 15-20 покрывал клетки Caco-2, заполняя асимметричности вдоль топографически определенной плоскости (Фиг.5e), образуя более сложное топографически определенное покрытие. До некоторой степени подобным образом у клеток PA27853 под воздействием PEG 3,35 наблюдали картину гладкого покрытия бактериальных клеток полимером в виде диффузной плоской структуры (Фиг.6d), тогда как PEG 15-20 окружал и охватывал бактерии вокруг более топографически асимметричным образом. Перекрестный анализ атомно-силового измерения диаметра бактерий в присутствии PEG 15-20 показывает значительное увеличение оболочки бактерия/PEG в растворе PEG (Фиг.5e, f). Другими словами, PEG 3,35 формирует гладкую оболочку вокруг отдельных бактериальных клеток (Фиг.5e), тогда как PEG 15-20 плотно охватывает отдельные клетки (Фиг.5f) и увеличивает диаметр полимер/бактерия (Фигуры 5g, 5h), тем самым отдаляя отдельные бактериальные клетки друг от друга.

Без желания быть связанным теорией, PEG HMW может проявлять свое положительное действие всего лишь посредством физического отдаления P.aeruginosa от кишечного эпителия. Альтернативно, PEG HMW может предоставлять преимущества посредством предотвращения формирования патогенного активационного сигнала распознавания кворума, возникающего вследствие межклеточного взаимодействия у патогенных клеток. Опять же без желания быть связанным теорией, возможно, что покрытие биологических поверхностей PEG HMW приводит к потере конформационной свободы покрывающих цепей PEG и отталкиванию сближающихся белков. Полярные взаимодействия между PEG HMW и клетками Caco-2 могут влиять на эластичность цепей PEG, выстраивая определенные боковые цепи PEG HMW в молекулярную конструкцию, отталкивающую белок. Представленные здесь данные поддерживают заключение о том, что покрытые PEG HMW клетки Caco-2 являются более отталкивающими для P.aeruginosa, чем непокрытые клетки Caco-2, вероятно вследствие потери "конформационной энтропии", как результат некоего динамического взаимодействия PEG HMW с клетками Caco-2.

Результат данных экспериментов показывает, что обработка PEG HMW оказывает эффект на обрабатываемые клетки, значительно влияя на топологию поверхности таких клеток. Кроме того, эффект воздействия PEG HMW на такие клетки отличается от того эффекта, который оказывает на такие клетки PEG 3,35. Хотя и без желания быть связанными с теорией, описанные здесь результаты предоставляют физическое обоснование для явно отличающегося действия на клетки, оказываемого PEG HMW относительно PEG с низкой молекулярной массой, такие как PEG 3,35.

ПРИМЕР 6

PEG HMW влияет на межклеточные взаимодействия

Для прямого наблюдения за действием растворов PEG на пространственную ориентацию P.aeruginosa, проводили эксперименты с живыми штаммами P.aeruginosa PA27853/EGFP, несущими ген egfp, кодирующий зеленый флуоресцентный белок. Эксперименты проводили в присутствии и в отсутствие клеток Caco-2. Для визуализации действия PEG на бактерии и их взаимодействие с культивируемыми эпителиями, применяли микроскопию на основе дифференциального интерференционного контраста (DIC) и визуализацию посредством GFP.

Ген egfp, кодирующий зеленый флуоресцентный белок, амплифицировали с применением в качестве матрицы плазмиды pBl-EGFP (Clontech). С применением праймеров TCTAGAACTAGTGGATCCCCGCGGATG (SEQ ID No. 5) и GCAGACTAGGTCGACAAGCTTGATATC (SEQ ID No. 6) вносили участки рестрикции XbaI и PstI. Продукт ПЦР непосредственно клонировали в вектор pCR 2.1 с применением набора TA-cloning kit (Invitrogen), с последующей трансформацией конструкции pCR2.1/EGFP в DH5a E.coli. Ген EGFP вырезали из данной конструкции посредством расщепления XbaI и PstI, а фрагмент, содержащий вырезанный ген, клонировали в челночный вектор E.coli-P.aeruginosa pUCP24, расщепленный теми же рестрикционными ферментами. Полученную конструкцию (т.е. pUCP24/EGFP), содержащую ген EGFP в челночном векторе, посредством электропорации при 25 мкФ и 2500 В вводили в электрокомпетентные клетки PA27583. Содержащие PA27853/EGFP клетки отбирали на планшетах со средой LB с агаром, содержащих 100 мкг/мл гентамицина (Gm).

Клетки, несущие PA27853/EGFP, растили в течение ночи в среде LB, содержащей 100 мкг/мл Gm и 1% культуры применяли для инокуляции свежей среды LB, содержащей 50 мкг/мл Gm. После 3 часов роста добавляли изопропил-β-D-тиогалактопиранозид (IPTG) в конечной концентрации 0,5 мМ, и культуры инкубировали 2 дополнительных часа. 100 мкл бактериальной культуры смешивали с 1 мл среды HDMEM (Gibco BRL), забуференной HEPES и содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (HDMEM HF) и 10% PEG HMW. Один мл бактериальной суспензии наносили на чашки толщиной 0,15 мм с dTC3 (Bioptech). Четырехсуточные клетки Caco-2 (p10-p30), растущие на чашках толщиной 0,15 мм с dTC3 (Bioptech) в HDMEM HF, однократно отмывали в HDMEM HF с PEG HMW или без. Один мл бактериальной суспензии, полученной как указано выше, добавляли к чашкам с dTC3, содержащим клетки Caco-2. Характер рассеивания бактериальных клеток в чашках с dTC3 наблюдали непосредственно с применением флуоресцентного инвертированного микроскопа Axiovert 100 TV с применением фильтров флуоресценции DIC и GFP, при увеличении объектива 63×. Температуру регулировали системой контроля температуры, термостатом Bioptechs. И для возбуждения DIC, и для возбуждения GFP применяли вольфрамовые лампы (100 В). Для изображения характера рассеивания бактериальных клеток в плоскости Z с применением фильтра GFP применяли программное обеспечение обработки 3D-изображений (Slidebook) из Intelligent Imaging Innovations. Без клеток Caco-2 на изображении с применением DIC (6a₁) и реконструированной плоскости Z (6a₂) наблюдали однородно рассеянные, пассивно плавающие клетки P.aeruginosa. В присутствии клеток Caco-2 выявляли расположение бактериальных клеток скоплениями (6b₁) и их видели прикрепленными к клеткам Caco-2 (6b₂). Раствор 10% PEG 3350 уменьшал подвижность бактерий и индуцировал немедленное формирование грибовидных бактериальных микроколоний (6c₁), прикрепленных ко дну лунки (6c₂). В присутствии клеток Caco-2 бактериальные микроколонии находились приблизительно на 8 микрон выше плоскости эпителиальных клеток (6d_1,2). Раствор 10% PEG 15-20 значительно сокращал подвижность клеток P.aeruginosa. Однако в течение первых 0,5-1 часа инкубации в содержащей PEG 15-20 среде бактериальные клетки формировали микроколонии в форме ножек паука, которые располагались в непосредственной близости с дном лунки (6e_1,2). В течение нескольких часов микроколонии в форме ножек паука полностью занимали пространство/объем среды. В присутствии клеток Caco-2 клетки P.aeruginosa теряли подобное пауку очертание, и их видели приподнятыми значительно выше плоскости эпителия (30-40 микрон) (6f_1,2).

Для определения пространственной ориентации взаимодействий бактерий и эпителиальных клеток в трех направлениях проводили реконструкции плоскости Z. Изображения показали, что два раствора PEG оказывают различные действия на агрегацию P.aeruginosa и различным образом влияют на пространственную ориентацию бактерий в зависимости от присутствия или отсутствия клеток Caco-2. В экспериментах только со средой видели, что P.aeruginosa демонстрировали равномерный характер распределения (Фиг.6a). Однако бактериальные клетки, исследованные в присутствии клеток Caco-2, располагались скоплениями, и их наблюдали расположенными рядом с плоскостью эпителиальных клеток на дне лунок (Фиг.6b). Бактериальные клетки, исследованные в присутствии только PEG 3,35, формировали большие агглютинированные агрегаты и оставались на дне культуральных лунок (Фиг.6c), тогда как бактериальные клетки, исследованные вместе с клетками Caco-2 в среде, содержащей PEG 3,35, оставались взвешенными выше плоскости эпителиальных клеток (приблизительно 8 микрон), сохраняя свое агрегированное состояние (Фиг.6d). Бактериальные клетки, исследованные в присутствии только PEG 15-20, демонстрировали равномерный характер образования микроскоплений (Фиг.6e), тогда как бактериальные клетки, исследованные вместе с клетками Caco-2 в среде, содержащей PEG 15-20, находились взвешенными значительно выше плоскости эпителия (≈32 микрона) в агрегированной форме (Фиг.6f). Во временных экспериментах наблюдали, что подвижность бактерий уменьшалась посредством PEG 3,35 и даже в большей степени посредством PEG 15-20.

Аналогичным эксперименту, описанному в примере 5, образом данный пример предоставляет физическое обоснование для наблюдаемого действия PEG HMW на межклеточное взаимодействие, согласующееся с его полезной профилактической и терапевтической активностью, описанной здесь. Ожидают, что применение PEG HMW уменьшит или устранит опасные межклеточные взаимодействия в кишечнике (например, между кишечными эпителиальными клетками и кишечными патогенными микроорганизмами, такими как псевдомонады), уменьшая риск заболеваний и/или патологических состояний, связанных с энтерогенным сепсисом.

ПРИМЕР 7

Способы профилактики заболевания/патологических состояний

Изобретение также относится к способам профилактики множества заболеваний и/или патологических состояний у людей и других животных, особенно других млекопитающих. В данных способах пациенту, представляющему собой человека, или животному, нуждающемуся в этом, вводят эффективное количество PEG HMW. PEG можно вводить с применением протокола введения, который определен с применением стандартных процедур оптимизации, известных в данной области. Предпочтительно средняя молекулярная масса PEG составляет 5000-20000 дальтон, а более предпочтительно - от 10000 до 20000 дальтон. Предполагают, что вводят, по меньшей мере, 5% PEG HMW. PEG HMW можно вводить в любой пригодной форме, например в виде раствора, геля или крема, в виде раствора, пригодного для распыления (например, для ингаляционного применения), в фармацевтической композиции, содержащей PEG HMW, и в стерильном, изотоническом растворе, пригодном для инъекции животному. Введение можно проводить с применением любого традиционного маршрута; в частности, предполагают, что PEG HMW вводят перорально или местно. В некоторых осуществлениях композиция PEG HMW для введения дополнительно содержит соединение, выбранное из группы, состоящей из покрытого декстраном L-глутамина, покрытого декстраном инулина, покрытой декстраном масляной кислоты, фруктоолигосахарида, N-ацетил-D-галактозамина, покрытой декстраном маннозы, галактозы и лактулозы. В другом осуществлении вводимая композиция PEG HMW дополнительно содержит покрытый декстраном L-глутамин, покрытый декстраном инулин, покрытую декстраном масляную кислоту, один или несколько фруктоолигосахаридов, N-ацетил-D-галактозамин, покрытую декстраном маннозу, галактозу и лактулозу.

Изобретение относится к способам профилактики множества заболеваний и патологических состояний, таких как "ухо пловца", острый или хронический отит среднего уха, ассоциированная с вентиляторами пневмония, энтерогенный сепсис, некротизирующий энтероколит, индуцированная антибиотиками диарея, псевдомембранозный колит, воспалительное заболевание кишечника, синдром раздраженной кишки, нейтропенический энтероколит, панкреатит, синдром хронической усталости, синдром дисбиоза, микроскопический колит, хроническая инфекция мочевыводящих путей, передающееся половым путем заболевание и инфекция (например, воздействие окружающей среды загрязненной биологически опасным возбудителем, таким как Bacillus anthracis, вирус оспы, энтеропатогенная E.coli (EPEC), энтерогеморрагическая E.coli (EHEC), энтероагрегативная E.coli, (EAEC), Clostridium difficile, ротавирус, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Klebsiella oxytocia, Enterobacteria cloacae, Candida albicans и Candida globrata и т.п.). В предпочтительном осуществлении способа профилактики инфекции мочевыводящего тракта, или лечения такой инфекции PEG HMW вводят в форме оросителя мочевого пузыря. Для передающегося половым путем заболевания композицию по изобретению предпочтительно применяют для смазывания презерватива. В предпочтительном осуществлении способа профилактики инфекции биологически опасным возбудителем, композицию по изобретению предоставляют в форме геля или крема, пригодного для топического применения. Полагают, что такое топическое применение будет полезным для профилактики ряда заболеваний/патологических состояний, связанных с любым из биологически опасных факторов или связанных с рядом химических или физико-химических факторов, которые ставят под угрозу выживание, здоровье или комфорт человека или животного. Такие химические или физико-химические факторы включают в себя такие факторы, которые способны вызывать ожоговые или другие повреждения кожи и которые являются неактивными или плохо растворимыми в композициях по изобретению.

В одном из осуществлений профилактических способов самцов мышей Balb/c анестезировали и в основание слепой кишки посредством прямой пункции иглой инъецировали 5% раствор PEG 15-20. Для обеспечения постоянного источника PEG в течение эксперимента длительностью 48 часов в тонкую кишку (подвздошная кишка) вводили иглу и в проксимальную кишку ретроградно инъецировали 1 мл физиологического раствора PEG 15-20. Место прокалывания зашивали шелковой хирургической нитью и слепую кишку промывали спиртом. Мышей возвращали в их клетки и давали только H₂O. Через сорок восемь часов мышей подвергали общепринятой процедуре гепатэктомии, включающей в себя 30% бескровную резекцию печени вдоль свободной левой доли. Контрольных мышей подвергали манипуляции с печенью без гепатэктомии. Ожидают, что профилактическое воздействие, состоящее из введения PEG HMW, уменьшит или устранит возникновение энтерогенного сепсиса у мышей.

Данные способы кроме профилактического лечения таких домашних животных как мыши, морские свинки, собаки и кошки, применимы для таких значимых с точки зрения сельского хозяйства животных, как крупный рогатый скот, лошади, козы, овцы, свиньи, куры, индейки, утки, гуси и любое другое домашнее животное. Кроме того, ожидают, что данные профилактические способы применимы для людей, улучшая состояние здоровья и среднюю продолжительность жизни многих пациентов или кандидатов с риском развития заболевания и/или патологического состояния, такого как "ухо пловца", острый или хронический отит среднего уха, ассоциированная с вентиляторами пневмония, энтерогенный сепсис, некротизирующий энтероколит, индуцированная антибиотиками диарея, псевдомембранозный колит, воспалительное заболевание кишечника, синдром раздраженной кишки, нейтропенический энтероколит, панкреатит, синдром хронической усталости, синдром дисбиоза, микроскопический колит, хроническая инфекция мочевыводящих путей, передающееся половым путем заболевание и возбудители инфекции (например, биологически опасные композиции), включающие в себя в качестве неограничивающих примеров сибирскую язву и оспу. Как указано выше, профилактические способы включают в себя введение человеку или другому животному композиции, содержащей, по меньшей мере, 5% PEG HMW (5-20 кДа), любым известным или традиционным маршрутом введения. Предпочтительно, профилактические способы осуществляют для индивидуумов с риском развития одного или нескольких указанных выше заболеваний и/или патологических состояний, но предполагают, что композиции и способы по изобретению будут пригодны в профилактической или терапевтической роли для общего лечения или профилактики таких заболеваний или патологических состояний в полных популяциях или субпопуляциях человека или других животных.

ПРИМЕР 8

Способы мониторинга введения PEG HMW

Изобретение также относится к способам мониторинга введения PEG HMW, например, для способа лечения. В таких способах мониторинга вводят меченый PEG HMW, отдельно или в сочетании с немеченым PEG HMW, и в течение лечения в непрерывном или прерывистом режиме, включая сюда простые определения конечных точек, определяют метку. Термин "меченый" PEG HMW означает, что метка или детектируемое соединение прямо или косвенно присоединено к PEG HMW или PEG HMW присоединен к репортерному соединению, способному связывать метку с PEG HMW (естественно, метки, не присоединенные к PEG HMW или предназначенные для ассоциации с ним, также пригодны для данного изобретения, как указано ниже). PEG HMW метят с применением любой детектируемой метки, известной в данной области, и PEG метят на уровне, достаточном для его детекции. Специалисты в данной области поймут, что уровень будет варьировать в зависимости от метки и способа детекции. Специалист в данной области может оптимизировать степень мечения с применением стандартных процедур оптимизации. Метка химически связана с PEG HMW нековалентной или ковалентной связью, которая стабильна при применении и предпочтительно при хранении. Метка, ковалентно связанная с PEG HMW, предпочтительна. Плотность присоединения метки регулируют, чтобы в значительной степени сохранялась биологическая активность PEG HMW (сохранение биологической активности, достаточной для осуществления полезного профилактического и терапевтического действия, описанного здесь). Этого, как правило, достигают подбором соотношения PEG HMW:метка, как известно в данной области. Принимая во внимание относительный размер средней молекулы PEG HMW, можно ожидать, что для присоединения к PEG HMW подойдет широкое разнообразие меток со значительным сохранением его биологической активности.

Метки, пригодные для данного изобретения, представляют собой известные в данной области метки, которые включают в себя радиометку, хромофор, флуорофор и репортер (включая сюда фермент, катализирующий образование детектируемого соединения и партнер по связыванию, такой как антитело, располагающий детектируемое соединение рядом с репортером). Типичные ферментные репортеры включают в себя ферментативный компонент системы люминесценции и катализатор колориметрической реакции. Более конкретно, типичные репортерные молекулы включают в себя биотин, авидин, стрептавидин и ферменты (например, пероксидазу хрена, люциферазу, щелочные фосфатазы, включая сюда секретируемую щелочную фосфатазу (SEAP); β-галактозидазу; β-глюкуронидазу; хлорамфениколацетилтрансферазу). Применение таких репортеров хорошо известно специалистам в данной области и описано, например, в патенте США №3817837, патенте США №3850752, патенте США №3996345 и патенте США №4277437. Типичные субстраты ферментов, которые можно конвертировать в детектируемые соединения репортерными ферментами, включают в себя 5-бром-4-хлор-3-индолил β-D-галактопиранозид или Xgal и Bluo-gal. Субстраты ферментов как соединения, способные к преобразованию в детектируемые соединения, в некоторых осуществлениях также могут являться метками, как понимают в данной области. Патенты США, относящиеся к меткам и их применениям, включают в себя патент США №3817837; патент США №3850752; патент США №3939350 и патент США №3996345. Типичные радиоактивные метки представляют собой ³H, ¹⁴C, ³²P, ³³P, ³⁵S и ¹²⁵I; типичные флуорофоры представляют собой флуоресцеин (FITC), родамин, Cy3, Cy5, экворин и зеленый флуоресцентный белок. Предпочтительная метка представляет собой флуорофор, такой как флуоресцеин.

Способы мониторинга по изобретению могут также включать в себя более чем одну метку. В одном из осуществлений одна метка служит для идентификации расположения PEG HMW после или в течение лечения, тогда как вторая метка специфична к одному или нескольким микроорганизмам, в той мере, в какой метка детектируемо связывается, по меньшей мере, с одним микроорганизмом. Например, способ мониторинга может включать в себя флуоресцеин, присоединенный к PEG HMW таким образом, что существенно сохраняется биологическая активность PEG HMW и свободный (т.е. неприсоединенный) Xgal или Bluo-gal для детекции специфичной для прокариот активности β-галактозидазы. Флуоресцеин определяет местоположение PEG HMW, тогда как окрашенный (синий) продукт указывает на присутствие метаболизирующего лактозу прокариотического микроорганизма, такого как Pseudomonad. Изобретение также включает в себя способы мониторинга, где данную информацию предоставляет одна метка (т.е. местоположение PEG HMW и указание на присутствие микроорганизма).

В способах мониторинга по изобретению можно применять любой способ детекции, известный в данной области. На способ детекции будут оказывать влияние несколько факторов, включающих в себя тип метки, биологический материал, подвергаемый мониторингу (например, эпидермальные клетки кожи, наружного слухового прохода или кишечника intestine; образцы стула, слизи или ткани), желаемый уровень разрешения, необходимость количественного анализа и т.п. Пригодные способы детекции включают в себя простое визуальное наблюдение невооруженным глазом, визуальное наблюдение с применением такого устройства как эндоскоп, необязательно снабженный подходящим источником света и/или камерой для ведения протокола, традиционное применение счетчиков Гейгера, рентгеновскую пленку, сцинтилляционные счетчики и т.п. и любые другие известные в данной области способы детекции.

Специалист в данной области поймет, что способы мониторинга по изобретению пригодны для оптимизации способов лечения. Например, способ мониторинга можно применять для оптимизации количества и/или концентрации PEG HMW (например, для получения желательной вязкости для раствора или смеси PEG HMW), который доставляют к эпителиальной клетке, такой как эпителиальные клетки наружного слухового прохода для профилактики или лечения "уха пловца". В качестве дополнительных примеров оптимизацию лечения кишечника можно облегчить посредством эндоскопического наблюдения кишечного тракта, под воздействием меченого PEG HMW, или посредством мониторинга образцов стула.

Способы мониторинга по изобретению включают в себя анализ стула на микроорганизмы, способные к прикреплению к эпителиальным клеткам кишечника, где анализ включает в себя приведение микроорганизма и клетки кишечного эпителия в контакт и детекцию прикрепления микроорганизма к эпителиальной клетке с применением известного в данной области способа. В предпочтительном осуществлении клетку кишечного эпителия иммобилизуют на подходящей поверхности, такой как дно и/или боковые поверхности лунки для микротитрования. В другом предпочтительном осуществлении до или в течение стадии детекции добавляют прямую или непрямую метку, такую как репортер, способный к генерации детектируемого продукта. Способы мониторинга могут дополнительно включать в себя добавление свободной метки. Например, к образцу, в котором предполагают наличие метаболизирующих лактозу прокариотических организмов, добавляют свободный Bluo-gal; если он присутствует, фермент микроорганизма β-галактозидаза будет расщеплять Bluo-gal с выходом детектируемого синего продукта.

В одном из осуществлений коммерчески доступные клетки кишечного эпителия (например, клетки Caco-2, ATCC HTB 37 и/или клетки IEC-6, ATCC CRL 1952) фиксируют в лунках планшета для микротитрования с применением традиционного способа. Собирают образец стула и смешивают с такой жидкостью, как фосфатно-солевой буфер. Получают жидкую фазу смеси, содержащую суспендированные микроорганизмы (например, подходящим фильтрованием (т.е., разделением больших твердых частиц от бактерий в жидкой суспензии), декантацией и т.п.) и разводят в PBS 1:100. К живой суспензии микроорганизмов добавляют Bluo-gal. Суспензию микроорганизмов помещают в лунки для микротитрования на 1 час при 24°C, с последующей отмывкой лунок подходящей жидкостью (например, PBS) для удаления несвязавшихся микроорганизмов. Несвязанные и/или связанные с иммобилизованными эпителиальными клетками микроорганизмы подвергают детекции, например, посредством подсчета с применением микроскопии в поляризованном свете. В альтернативных осуществлениях для детекции прикрепления применяют иммунологический анализ с применением подходящих иммунологических реагентов, представляющих собой специфичные к микроорганизму(ам) моноклональные или поликлональные антитела, необязательно с прикрепленной меткой, такой как радиоактивная метка, флуорофор или хромофор.

Специалист в данной области поймет, что клетки кишечного эпителия или микроорганизм иммобилизовать необязательно, хотя такая иммобилизация может способствовать точной детекции микроорганизмов, присоединяющихся к эпителиальным клеткам. Например, в одном из осуществлений иммобилизованные микроорганизмы из образца стула приводят в контакт с клеткой кишечного эпителия, которая не иммобилизована. Кроме того, специалист в данной области поймет, что для получения суспензии микроорганизмов можно применять любую пригодную жидкость, известную в данной области, с предпочтением жидкостям, являющимся любым из известных изотонических буферов. Также, как указано выше, для детекции прикрепления клеток можно применять любую известную метку.

В связанном аспекте изобретение относится к набору для анализа прикрепления клеток микроорганизмов, где набор содержит эпителиальные клетки и протокол для анализа прикрепления клеток микроорганизмов к эпителиальной клетке. Протокол описывает любой известный способ детекции микроорганизма. Предпочтительный набор содержит клетки кишечного эпителия. Другие наборы по изобретению дополнительно содержат метку, такую как флуорофор или репортер.

Другой рассматриваемый в изобретении способ мониторинга представляет собой анализ гидрофобности микроорганизмов. В данном способе определяют относительную или абсолютную гидрофобность клетки микроорганизма с применением любого традиционного способа. Типичный способ включает в себя подвергание любого микроорганизма хроматографии гидрофобного взаимодействия, как известно в данной области. Ukuku et al., J. Food Prot. 65:1093-1099 (2002), полностью включено сюда в качестве ссылки. Другой типичной способ представляет собой распределение любого микроорганизма в неполярной : полярной жидкостях (например, 1-октанол : вода или ксилол : вода). См. Majtan et al., Folia Microbiol (Praha) 47:445-449 (2002), полностью включено сюда в качестве ссылки.

В одном осуществлении анализа гидрофобности для мониторинга введения PEG образец стула суспендируют в 50 мМ фосфатно-натриевого буфера (pH 7,4), содержащего 0,15 М NaCl. Микроорганизмы в суспензии собирают посредством центрифугирования и ресуспендируют в том же буфере, а цикл центрифугирования-ресуспендирования повторяют. Если возможно, микроорганизмы ресуспендируют в том же буфере до поглощения в размере 0,4 при 660 нм, позволяющего спектрофотометрический мониторинг без применения меченого PEG. Суспензию микроорганизмов обрабатывают ксилолом (2,5:1, об./об., Merck), суспензию энергично перемешивают в течение двух минут и суспензии позволяют отстаиваться в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем определяют наличие микроорганизмов в водной фазе, например, посредством спектрофотометрического определения поглощения при 660 нм. Для устранения фона применяют чистую кювету, содержащую натрий-фосфатный буфер.

При получении клеток микроорганизмов из образцов стула для применения в данных способах предпочтительно, чтобы PEG HMW являлся относительно нерастворимым в жидкостях, применяемых для получения суспензии микроорганизмов, и в любой жидкости, применяемой для разбавления суспензии микроорганизмов.

Изобретение дополнительно относится к набору для проведения способа мониторинга, включающему в себя анализ гидрофобности микроорганизмов, где набор содержит клетки кишечного эпителия и протокол, описывающий определение гидрофобности микроорганизмов. Предпочтительный набор содержит клетки кишечного эпителия. Связанные наборы дополнительно содержат метку, такую как флуорофор или репортер.

Кроме того, изобретение относится к способу мониторинга, включающему в себя получение образца кишечной флоры и детекцию активности лектина/адгезина PA-I. Можно применять любой известный в данной области способ детекции активности лектина/адгезина PA-I. Например, лектин/адгезин PA-I можно детектировать с применением антитела (поликлональное, моноклональное, фрагмент антитела, такой как Fab-фрагмент, одниночная цепь, химерное, гуманизированное илу любую другую форму антитела, известную в данной области), специфически распознающего лектин/адгезин PA-I. Иммунологический анализ принимает форму любого формата иммунологического анализа, известного в данной области, например ELISA, "вестерн"-блот, имунопреципитация и т.п. Альтернативно можно детектировать способность лектина/адгезина PA-I к связыванию углеводов или можно измерять активность лектина/адгезина PA-I в отношении нарушения барьерной функции кишечного эпителия, например, посредством мониторинга трансэпителиального электрического сопротивления или TEER эпителиального слоя до и/или в течение воздействия образца. В связанных наборах изобретение относится к партнеру лектина/адгезина PA-I по связыванию и протоколу для детекции активности лектина/адгезина PA-I (например, связывающей активности). Другие наборы по изобретению содержат любой углевод, для которого известно, что он связывается с лектином/адгезином PA-I, и протокол для детекции активности лектина/адгезина PA-I (например, связывающей активности).

ПРИМЕР 9

Выживаемость мышей, подвергнутых хирургическому стрессу и обработанных P.aeruginosa, оценивали способом, описанным в примере 1 заявки, за исключением того, что мышей не обрабатывали растворами ПЭГ в течение 48 часов после хирургического вмешательства, как описано в примере 1. В настоящем эксперименте выживаемость мышей прослеживали в течение 24 часов после хирургического вмешательства. После 30% гепатэктомии мышей обрабатывали P.aeruginosa и постоянно вводили ПЭГ или физиологический раствор через иголку, помещенную в подвздошную кишку, для обеспечения ретроградной доставки к проксимальной кишке.

Кривая выживаемости представлена на фигуре 7. Из фигуры ясно, что приблизительно через 12 часов после хирургического вмешательства мыши, получавшие P.aeruginosa и физиологический раствор, начинали проявлять относительно резкое снижение выживаемости, так как процент выживаемости снижался от 100% через приблизительно 12 часов после хирургического вмешательства до приблизительно 35% через 24 часа после хирургического вмешательства. Мыши, которым вводили либо ПЭГ 8000, либо ПЭГ 1520 кДа, демонстрировали менее резкое снижение с процентом выживаемости, снижающимся от 100% через приблизительно 12 часов до приблизительно 50% через 24 часа после хирургического вмешательства. У мышей, которым вводили ПЭГ 15100, был показан процент выживаемости, который снижался менее всего, т.е. от 100% через 12 часов до приблизительно 75% через 24 часа после хирургического вмешательства.

ПРИМЕР 10

Защитный эффект другого семейства высокомолекулярных молекул ПЭГ исследовали, применяя пиоцианиновый тест. ПЭГ HMW, имеющий среднюю молекулярную массу 15100, демонстрировал структуру, включающую расположенную практически по центру фенильную группу, с которой ковалентно связаны молекулы ПЭГ с линейной цепью. В частности, проиллюстрированным семейством ПЭГ HMW является сополимер полиэтиленгликоль-бисфенол А-эпихлоргидрин, Lot# CDU-2-72-2 (Delmar Chemicals Inc.). Этот ПЭГ HMW сравнивали с осуществлением ПЭГ HMW 15-20 кДа (Sigma, каталожный no. Р2263, лот no 016К0141).

Организмом, используемым в этих пиоцианиновых тестах, был Pseudomonas aeruginosa MPAО1. Продукцию пиоцианина в Р. aeruginosa индуцировали, подвергая микроорганизм воздействию известного индуктора пиоцианина, т.е. молекулой U-50488 синтетического агониста опиоидного рецептора-каппа. Первоначально замороженные штаммы Р.Aeruginosa MPAО1 непосредственно высевали на плашки с агаром для индукции Pseudomonas (PIA) и инкубировали в обычных условиях до появления колоний. Колонию с плашки PIA затем использовали для инокуляции триптического соевого бульона (TSB) и культуры выращивали в течение ночи при перемешивании при 220 об/мин при 37°С. Индуктор пиоцианина U-50488 присутствовал в указанных концентрациях и их получали разведением 24 мМ исходного раствора U-50488 прямо в TSB. Для культур, которые подвергали действию с ПЭГ, соответствующий ПЭГ добавляли непосредственно к TSB до указанного весового процента (например, 5% ПЭГ означает 5 г ПЭГ на 100 мл TSB).

Для пиоцианинового теста культуры обычно разводили 1:50 в 1,0 мл TSB с или без ПЭГ, и культуры перемешивали (220 об/мин) в течение 1 часа при 37°С. Индуктор пиоцианина добавляли, где это указано, до конечной концентрации 200 мкМ. Пятьсот мкл культуры, содержащей ПЭГ и U-50488, где это указано, добавляли к каждой из двух лунок 96-луночного планшета для культивирования и инкубировали в течение ночи при перемешивании (100 об/мин) при 37°С.

После инкубирования в течение ночи пиоцианин в культуре выделяли и измеряли по поглощению при 520 нм. Негативный контроль в форме культуры P.aeruginosa MPAО1 без какого-либо ПЭГ и без какого-либо количества U-50488 давал A₅₂₀=0,372. Положительный контроль в форме культуры Р.aeruginosa MPAО1 без какого-либо ПЭГ, но с 200 мкМ U-50488 для индукции продукции пиоцианина давал А₅₂₀=0,544. Культуры MPAО1, экспонированные с 5% ПЭГ HMW 15-20 кДа и индуктором пиоцианина, давали A₅₂₀=0,396. Культуры MPAО1, экспонированные с 5% ПЭГ HMW 15,1 кДа (бис-аддукт) давали A₅₂₀=0,272. Для культур MPAО1 с индуктором пиоцианина и 1% ПЭГ культура, содержащая ПЭГ HMW 15-20 кДа, давала А₅₂₀=0,472, а культура, содержащая ПЭГ HMW 15,1 кДа (бис-аддукт), давала A₅₂₀=0,5. Наконец, для культур MPAО1, экспонированных с индуктором пиоцианина и 0,5% ПЭГ, культура, экспонированная с ПЭГ HMW 15-20 кДа, давала A₅₂₀=0,492, a культура, экспонированная с ПЭГ HMW 15,1 кДа, давала A₅₂₀=0,5.

ПРИМЕР 11

В эксперименте с пиоцианином, сходном с экспериментом, описанным в примере 10, разнообразные ПЭГ HMW проверяли в отношении их защитных свойств. Кроме того, исследовали влияние рН на продукцию индуцированного пиоцианина. Уровни пиоцианина измеряли путем определения оптической плотности при 520 нм. Результаты представлены в виде гистограммы, показанной на фигуре 8. Для Р.aeruginosa, культивируемых в триптическом соевом бульоне (TSB), рН 7,4, но не обработанных индуктором пиоцианина или каким-либо ПЭГ, продукция пиоцианина составляла приблизительно 0,14 единиц A₅₂₀ (фиг.8, полоса 1). Для P.aeruginosa, культивируемых в TSB, рН 7,4 и обработанных 200 мкМ U-50488, но без ПЭГ, наблюдалась величина единиц А₅₂₀ 0,18 (фиг.8, полоса 2). Для Р.aeruginosa, растущих в TSB при рН 8,0 и обработанных ПЭГ HMW HM20-78-5, выход составлял 0,08 единиц А₅₂₀ (фиг.8, полоса 3), тогда как Р.aeruginosa, растущие в TSB при рН 7,4 и обработанные ПЭГ HMW HM20-78-5, давали 0,09 единиц A₅₂₀ (фиг.8, полоса 4). Р.aeruginosa, растущие в TSB при рН 7,9 и обработанные ПЭГ HMW DQ24-151, давали 0,08 единиц A₅₂₀ (фиг.8, полоса 5), тогда как Р.aeruginosa, растущие в TSB при рН 7,4 и обработанные ПЭГ HMW DQ24-151, давали выход 0,085 единиц A₅₂₀ (фиг.8, полоса 6). Для Р.aeruginosa, культивируемых в TSB, рН 8,5, и обработанных ПЭГ HMW HM20-78-6, выявляли 0,10 единиц А₅₂₀ (фиг.8, полоса 7), тогда как для Р.aeruginosa в TSB, рН 7,4, и обработанных ПЭГ HMW HM20-78-6, выход составлял 0,08 единиц А₅₂₀ (фиг.8, полоса 8). Клетки Р.aeruginosa, растущие в TSB при рН 7,4 и обработанные ПЭГ HMW 8000, давали 0,07 единиц А₅₂₀ (фиг.8, полоса 9); Р.aeruginosa, растущие в TSB, рН 7,4, и экспонированные с ПЭГ HMW 15-20 кДа, давали выход 0,03 единиц A₅₂₀ (фиг.8, полоса 10). Все из этих культур, экспонированных с ПЭГ HMW, также содержали индуктор пиоцианина. Из результатов ясно, что каждый из тестируемых ПЭГ HMW имел благоприятный эффект на уровень индуцируемого пиоцианина. Понижением уровня индуцированного пиоцианина, известного фактора вирулентности Р.aeruginosa, отвечающего на «кворум-сенсорные» сигнальные молекулы, ПЭГ HMW помогают защитить эукариотические клетки, такие как эпителиальные клетки кишечника, которые вступают в контакт с потенциально летальной флорой кишечника, такой как Р.aeruginosa.

ПРИМЕР 12

Другое исследование, оценивающее эффекты разнообразных ПЭГ HMW, продемонстрировало, что защитные эффекты широко распространены среди ПЭГ HMW. Пиоцианиновый тест применяли для оценки этих эффектов. ПЭГ HMW получали от Delmar Chemicals Inc. или от Sigma (каталожный no. P2263, лот no. 016К0141).

Продукцию пиоцианина в Р.aeruginosa МРАО1 индуцировали экспозицией микроба с известным индуктором пиоцианина, т.е. с известным индуктором пиоцианина, т.е. молекулой U-50488 синтетического агониста опиоидного рецептора-каппа. Первоначально замороженные штаммы Р.aeruginosa МРАО1 прямо высевали на плашки с агаром для индукции Pseudomonas (PIA) и инкубировали в обычных условиях до появления колоний. Колонию с плашки PIA затем использовали для инокуляции триптического соевого бульона (TSB), и культуры выращивали в течение ночи с перемешиванием при 220 об/мин при 37°С. Индуктор пиоцианина U-50488 присутствовал в указанных концентрациях и их получали разведением 24 мМ маточного раствора U-50488 прямо в TSB. Для культур, экспонированных с ПЭГ, соответствующий ПЭГ добавляли прямо к TSB до указанного весового процента (например, 5% ПЭГ означает 5 г ПЭГ на 100 мл TSB).

Для пиоцианинового теста культуры обычно разводили 1:50 в 1,0 мл TSB с или без ПЭГ, и культуры в 15 мл культуральных пробирках перемешивали (220 об/мин) в течение 1 часа при 37°С. Индуктор пиоцианина добавляли, где это указано, до конечной концентрации 200 мкМ. Культуры затем инкубировали в течение ночи при перемешивании (150 об/мин) при 37°С.

После инкубации в течение ночи пиоцианин в культуре выделяли и измеряли по поглощению при 520 нм. Результаты даны в таблице, представленной непосредственно ниже.

No.ОбразецПиоцианин (О.П.₅₂₀ нм)1Контроль P.aeruginosa MPAO1 в TSB0,2142+U504880,3203+U50488+5% HM-20-78-50,0804+U50488+5% DQ24-1510,165+U50488+5% DQ24-1470,2086+U50488+5% DQ24-1430,2307+U50488+5% Dow Carbowax PEG 80000,186

Из данных, представленных в таблице, ясно, что разнообразные молекулы ПЭГ высокой молекулярной массы (5% растворы ПЭГ HMW), включая ПЭГ HMW, имеющий среднюю молекулярную массу 8000 даль тон, снижают пиоцианин, определяемый в индуцированных культурах P.aeruginosa. Эти результаты показывают, что ПЭГ, имеющие среднюю молекулярную массу, по меньшей мере, приблизительно 8 кДа и предпочтительно, по меньшей мере, 8 кДа, проявляют благоприятный защитный эффект в снижении вирулентного фенотипа микробного патогена, такого как P.aeruginosa.

Ввиду указанных выше руководств возможны многочисленные модификации и изменения настоящего изобретения, и они находятся в объеме данного изобретения. Полные описания всех цитируемых здесь публикаций включены сюда в качестве ссылки.

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована при лечении или профилактике опосредованных микроорганизмами эпителиальных нарушений, таких как энтерогенный сепсис, ожоги, некротизирующий энтероколит новорожденных и многих других патологических состояний. Для этого в качестве активного агента в способах и фармацевтических композициях, а также при производстве лекарственных препаратов предлагается использовать полиэтиленгликоль со средней молекулярной массой 8000-20000 дальтон. Полиэтиленгликоль именно такой молекулярной массы обеспечивает полное ингибирование проявлений вирулентности микроорганизмов, в том числе Pseudomonas aeruginosa, без их уничтожения с сохранением природной микрофлоры индивидуума. 21 н. и 15 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл.

1. Применение полиэтиленгликоля (PEG) в качестве активного агента для получения лекарственного средства, снижающего вероятность развития смертельного исхода у индивидуума с эпителиальным нарушением, вызванным микроорганизмом, где средняя молекулярная масса PEG составляет 8000-20000 дальтон.2. Применение по п.1, где патологическое состояние выбрано из группы, состоящей из энтерогенного сепсиса, ожога, некротизирующего энтероколита новорожденных, эпителиальных нарушений при тяжелой форме нейтропении, токсического колита, воспалительного заболевания кишечника, энтеропатии, отторжения трансплантата и синдрома послеоперационного воспаления резервуара в дистальном отделе тонкой кишки.3. Применение по п.1, где индивидуумом является животное.4. Применение по п.1, где индивидуумом является человек.5. Применение по п.1, где PEG представляет собой водный раствор, содержащий 10-20% PEG.6. Применение полиэтиленгликоля (PEG) в качестве активного агента для получения лекарственного средства для ингибирования экспрессии лектина/адгезина PA-I, где средняя молекулярная масса PEG составляет 8000-20000 дальтон.7. Способ ингибирования активации лектина/адгезина PA-I, индуцируемой в кишечнике, который предусматривает введение животному, при необходимости такого введения, эффективной дозы полиэтиленгликоля (PEG), где средняя молекулярная масса PEG составляет 8000-20000 дальтон.8. Способ ингибирования морфологического изменения индуцированного C4-HSL P.aeruginosa, который предусматривает введение животному эффективной дозы полиэтиленгликоля (PEG), при необходимости такого введения, где средняя молекулярная масса PEG составляет 8000-20000 дальтон.9. Применение полиэтиленгликоля (PEG) в качестве активного агента для получения лекарственного средства для снижения экспрессии вирулентности P.aeruginosa, где средняя молекулярная масса PEG составляет 8000-20000 дальтон.10. Применение полиэтиленгликоля (PEG) в качестве активного агента для получения лекарственного средства для облегчения симптомов бактериального патогенетического процесса в кишечнике, где средняя молекулярная масса PEG составляет 8000-20000 дальтон.11. Применение полиэтиленгликоля (PEG) в качестве активного агента для получения лекарственного средства для ингибирования прикрепления бактериальных клеток к кишечнику млекопитающих, где средняя молекулярная масса PEG составляет 8000-20000 дальтон.12. Применение по п.11, где бактериальная клетка представляет собой Pseudomonas aeruginosa.13. Способ снижения экспрессии лектина/адгезина PA-I, который заключается в контактировании бактериальной клетки и полиэтиленгликоля (PEG), где средняя молекулярная масса PEG составляет 8000-20000 дальтон.14. Применение полиэтиленгликоля (PEG) для получения лекарственного средства для снижения вероятности развития смертельного исхода у индивидуума с опосредованным микроорганизмом нарушением эпителия путем ингибирования взаимодействия эпителиальной клетки кишечника млекопитающего с бактериальной клеткой, где средняя молекулярная масса PEG составляет 8000-20000 дальтон.15. Применение по п.14, где опосредованное микроорганизмом нарушение эпителия выбрано из группы, состоящей из энтерогенного сепсиса, ожога, некротизирующего энтероколита новорожденных, эпителиальных нарушений при тяжелой форме нейтропении, токсического колита, воспалительного заболевания кишечника, энтеропатии, отторжения трансплантата и синдрома послеоперационного воспаления резервуара в дистальном отделе тонкой кишки.16. Применение по п.14, где бактериальная клетка представляет собой кишечный патоген и нет визуализируемых изменений его роста.17. Применение фармацевтической композиции, содержащей полиэтиленгликоль со средней молекулярной массой 8000-20000 дальтон и подходящий адъювант, носитель или разбавитель для профилактики или лечения инфекционного заболевания у животного.18. Применение по п.17, где фармацевтическая композиция дополнительно содержит соединение, выбранное из группы, включающей декстран, L-глутамин, покрытый декстраном L-глутамин, покрытый декстраном инулин, покрытую декстраном масляную кислоту, фруктоолигосахарид, N-ацетил-D-галактозамин, покрытую декстраном маннозу, галактозу и лактулозу.19. Набор, содержащий фармацевтическую композицию, включающую в качестве активного агента полиэтиленгликоль со средней молекулярной массой 8000-20000 дальтон, подходящий адъювант, носитель или разбавитель, а также инструкцию по применению композиции для терапевтического лечения или профилактики энтерогенного сепсиса.20. Применение полиэтиленгликоля (PEG) в качестве активного агента для получения лекарственного средства для профилактики заболевания или патологического состояния у индивидуума с опосредованным микроорганизмом эпителиальным нарушением, где средняя молекулярная масса PEG составляет 8000-20000 дальтон.21. Применение по п.20, где заболевание или патологическое состояние выбрано из группы, состоящей из наружного отита, острого отита среднего уха, хронического отита среднего уха, пневмонии, вызванной применением препарата искусственного дыхания, энтерогенного сепсиса, некротизирующего энтероколита, диареи, вызванной приемом антибиотиков, псевдомембранозного колита, воспалительного заболевания кишечника, синдрома раздраженной кишки, нейтропенического энтероколита, панкреатита, синдрома дисбиоза, микроскопического колита, хронической инфекции мочевыводящих путей, венерического заболевания и инфекции.22. Применение по п.21, где индивидуумом является человек.23. Применение полиэтиленгликоля (PEG) в качестве активного агента для получения лекарственного средства для профилактики кожной инфекции, где средняя молекулярная масса PEG составляет 8000-20000 дальтон.24. Применение по п.23, где агент, вызывающий указанную инфекцию, выбран из группы, состоящей из Bacillus anthracis, энтеропатогенной Е.coli (ЕРЕС), энтерогеморрагической Е.coli (ЕНЕС), энтероагрегативной Е.coli, (ЕАЕС), Clostridium difficile, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Klebsiella oxytocia и Enterobacteria cloacae.25. Применение полиэтиленгликоля (PEG) в качестве активного агента для получения лекарственного средства для профилактики респираторной инфекции, где средняя молекулярная масса PEG составляет 8000-20000 дальтон.26. Применение по п.25, где респираторная инфекция выбрана из группы, включающей пневмонию, вызванную применением препарата искусственного дыхания и инфекцией.27. Применение по п.26, где агент, вызывающий указанную инфекцию, представляет собой Bacillus anthracis.28. Применение полиэтиленгликоля (PEG) в качестве активного агента для получения лекарственного средства для промывания по меньшей мере части мочевыводящих путей для профилактики хронической инфекции мочевыводящих путей, где средняя молекулярная масса PEG составляет 8000-20000 дальтон.29. Применение полиэтиленгликоля (PEG) в качестве активного агента для получения лекарственного средства для нанесения на презерватив для профилактики венерического заболевания, где средняя молекулярная масса PEG составляет 8000-20000 дальтон.30. Презерватив, содержащий, по меньшей мере, частичное покрытие полиэтиленгликолем (PEG), где средняя молекулярная масса PEG составляет 8000-20000 дальтон.31. Применение полиэтиленгликоля (PEG) в качестве активного агента для получения лекарственного препарата для профилактики нарушения желудочно-кишечного тракта, где средняя молекулярная масса PEG составляет 8000-20000 дальтон.32. Применение по п.31, где нарушение желудочно-кишечного тракта выбрано из группы, включающей некротизирующий энтероколит новорожденных, диарею, вызванную приемом антибиотиков, псевдомембранозный колит, воспалительные заболевания кишечника, синдром раздраженной кишки, нейтропенический энтероколит, панкреатит, синдром дисбиоза и микроскопический колит.33. Применение полиэтиленгликоля (PEG) в качестве активного агента для получения лекарственного средства для нанесения на эпителий молочной железы для профилактики потери способности к лактации у животного с эпителиальным нарушением, влияющим на продукцию молока в молочных железах, вызванным микроорганизмом, где средняя молекулярная масса PEG составляет 8000-20000 дальтон, на эпителиальную поверхность молочной железы.34. Применение полиэтиленгликоля (PEG) в качестве активного агента для получения лекарственного средства для профилактики развития опосредованного микроорганизмом нарушения у индивидуума в грудном возрасте, где средняя молекулярная масса PEG составляет 8000-20000 дальтон.35. Применение по п.34, где PEG находится в смеси с молочной смесью для детского питания.36. Композиция, содержащая молочную смесь для детского питания и полиэтиленгликоль (PEG), где средняя молекулярная масса PEG составляет 8000-20000 дальтон.