Штамм Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии, медицинской и ветеринарной промышленности. Получен штамм Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД, обладающий спектром антагонистической активности по отношению к глобально распространившимся зооантропонозным штаммам антибиотикорезистентного клона Escherichia coli ST 131, вызвавшего пандемию внекишечных инфекционных заболеваний у человека и животных, а также к возбудителям кишечных инфекционных заболеваний (энтеропатогенные Escherichia coli, энтеротоксигенные Escherichia coli, Salmonella Enteritidis, Campylobacter jejuni) и нозокомиальных инфекционных заболеваний (Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans). Штамм Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД фенотипически апатогенный, имеет высокие показатели адгезии на энтероцитах Caco-2 и НТ-29, а также на перевиваемых клетках НТВ-9 мочевого пузыря и А-498 почки, в опытах in vitro устойчив к желудочному и кишечному стрессам. Штамм Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД может быть использован в изготовлении пробиотиков и пробиотических кормовых добавок для профилактики внекишечных заболеваний, вызываемых глобально распространившимися зооантропонозными штаммами антибиотикорезистентного клона Escherichia coli ST 131, а также для профилактики кишечных и нозокомиальных инфекционных заболеваний.

В настоящее время актуальной задачей является разработка новых препаратов пробиотиков и пробиотических кормовых добавок, обладающих антагонистической активностью к антибиотикорезистентным зооантропонозным штаммам Е. coli, персистирующим в кишечнике у человека и животных, вызывающим внекишечные инфекционные заболевания. Пандемия внекишечных инфекционных заболеваний, вызванных антибиотикорезистентными зооантропонозными штаммами Е. coli, персистирующими в кишечнике у человека, была впервые зарегистрирована в 2008 году и продолжает развиваться [Nicolas-Chanoine M., et al., 2008; Cantón R., et al., 2008; Klemm, E. J., et al., 2018; Tchesnokova V., et al., 2019]. Эти штаммы имеют пили типа 1, на конце которых расположены адгезины FimH или UclD, обеспечивающие прикрепление патогена к энтероцитам кишечника или к уроэпителиоцитам мочевыделительной системы. Интенсивно развиваясь в кишечнике у людей различных возрастных групп (дети, взрослые, пожилые), они повышают проницаемость кишечника, проникают в мезентериальные лимфатические узлы и кровь, что сопровождается инфицированием паренхиматозных органов (печень, селезёнка, лёгкие, мозг) с развитием многочисленных экстраинтестинальных инфекций от циститов и пиелонефритов [Russo T.A.,et al., 2003; Kaper J., et al.,2004; Yun K., et al., 2017; Ahn D., et al., 2015; Kocak M., et al., 2016] до опасной для жизни септицемии [Tumbarello M, et al., 2007]. Более 85% первичных пиогенных уропатий, так называемых «бытовых» инфекций, т.е. инфекций мочевыводящей системы, регистрируемых у практически здоровых взрослых, а также детей (чаще у женщин в 14 раз) вне госпитальных условий, связано с антибиотикорезистентными штамами E.coli [Yun et al, et al., 2017]. Транслокация E.coli имеет место также и при массивной антибиотикотерапии, химиотерапии, подавляющей нормальную кишечную микробиоту и способствующей селективной пролиферации штаммов Е. coli с высокой лекарственной резистентностью. Антибиотикорезистентные штаммы Е. coli, персистирующие в кишечнике - источник заболеваемости и смертности, требующий увеличения расходов на здравоохранение. За последнее десятилетие внекишечные инфекционные заболевания, индуцируемые персистирующими в кишечнике антибиотикорезистентными зооантропонозными штаммами Е. coli, стали более частыми [Thelwall S., et al., 2015] и сложными для лечения [Walker E.B., et al., 2016]. Это создает серьезные клинические проблемы из-за постоянного роста устойчивости к противомикробным препаратам, в первую очередь к фторхинолонам и цефалоспоринам расширенного спектра. Быстрый рост антибиотикорезистентности патогенов обусловлен широким применением антибиотиков в медицине и, особенно, в сельском хозяйстве. Более 70% антибиотиков, мирового производства использовались в животноводстве как кормовые добавки, стимулирующие рост молодняка сельскохозяйственных животных. Часть этих антибиотиков оседала в мясе животных и сохранялась в пищевых продуктах питания человека. В результате у животных и человека нарушалась нормальная кишечная микробиота, участвующая в нормальных метаболических процессах организма-хозяина и развивался метаболический синдром, одним из проявлений которого является увеличение массы тела - ожирение и диабет второго типа. Проведенные в России исследования выявили наличие метаболического синдрома у 29,7% (каждый третий) взрослого населения (Бойцов С. и соавт., 2014). Среди антибиотикорезистентных изолятов Е. coli человека и животных наиболее распространённой в мире является клональная группа штаммов ST 131, пандемичный клон, ответственный за развитие внекишечных инфекционных заболеваний [Nicolas-Chanoine M., 2014]. Выделенные у бройлеров патогенные полирезистентные штаммы Е. coli, принадлежащие к клону ST 131, имеют генетическое сходство и общность генов вирулентности с изолятами Е. coli, циркулирующими в кишечнике у человека и вызывающими внекишечные инфекционные заболевания [Kathayat D., et al., 2021]. Устойчивость штаммов Е. coli к противомикробным препаратам опосредована главным образом Бета-Лактамазами Расширенного Спектра (БЛРС) таких классов, как TEM, SHV и CTX-M-15 [Pitout J.D., 2008; Talan D., et al., 2016]. Распространение специфических устойчивых к лекарственным препаратам клональных групп Е. coli во многом объясняет причину возникновения пандемии [Johnson J.R., et al., 2009; Tchesnokova V., et al., 2013]. Основной субклон H30 клона E. coli 131 (ST131- H30), принадлежащий к филогруппе В2, содержащий гены, кодирующие БЛРС класса CTX-M-15 и гены, кодирующие фимбриальные адгезины типа 1 fimH, стал ведущей линией устойчивости к двум ключевым классам противомикробных препаратов для лечения внекишечных инфекционных заболеваний - фторхинолонам и цефалоспоринам расширенного спектра и обусловил быстрое развитие пандемии [Colpan A. , et al.,2013; Tchesnokova V., et al., 2013; Petty N., et al., 2014 ; Stoesser N. et al., 2016].

Известны пробиотические штаммы Lactobacillus salivaris AH102, AH103, AH105, AH109, AH110, обладающие адъювантными свойствами и используемые при вакцинации для усиления иммунного ответа [Патент RU 2302458 C2, дата опубликования заявки 10.07.2007 г. Бюл. №19; PCT WO 03.010298 (06.02.2003)]. Однако сведения об антагонистической активности этого штамма по отношению к антибиотикорезистентным зооантропонозным штаммам E. coli клона ST 131, вызывающим внекишечные инфекции, а также возбудителям кишечных инфекционных заболеваний, включая штаммы Salmonella Enteritidis, Campylobacter jejuni и возбудителям нозокомиальных инфекционных заболеваний отсутствуют.

Известен пробиотический штамм Lactobacillus salivaris 3606, предназначенный для профилакики рака и комплексного лечения раковых заболеваний [Patent PCT WO 2012103785 A1. Дата опубликования 08.09.2012]. Однако сведения об антагонистической активности этого штамма по отношению к антибиотикорезистентным зооантропонозным штаммам E. coli клона ST 131, вызывающим внекишечные инфекции, а также возбудителям кишечных инфекционных заболеваний, включая штаммы Salmonella Enteritidis, Campylobacter jejuni и возбудителям нозокомиальных инфекционных заболеваний отсутствуют.

Известен пробиотический штамм Lactobacillus salivaris ICIS-540, предназначенный для получения ингибитора цитокинов IL-6 и IL-17 [Патент RU 2726653 C2. Дата опубликования 25.02.2020. Бюл. №6]. Однако сведения об антагонистической активности этого штамма по отношению к антибиотикорезистентным зооантропонозным штаммам E. coli клона ST 131, вызывающим внекишечные инфекции, а также возбудителям кишечных инфекционных заболеваний, включая штаммы Salmonella Enteritidis, Campylobacter jejuni и возбудителям нозокомиальных инфекционных заболеваний отсутствуют.

Известен пробиотический штамм Lactobacillus salivaris, предназначенный для профилактики и комплексного лечения отита [Patent ES 2898876 T3. Дата опубликования 03.09.2022]. Однако сведения об антагонистической активности этого штамма по отношению к антибиотикорезистентным зооантропонозным штаммам E. coli клона ST 131, вызывающим внекишечные инфекции, а также возбудителям кишечных инфекционных заболеваний, включая штаммы Salmonella Enteritidis, Campylobacter jejuni и возбудителям нозокомиальных инфекционных заболеваний отсутствуют.

Задачей изобретения является расширение номенклатуры пробиотических штаммов, обладающих антагонистической активностью к зооантропонозным патогенным антибиотикорезистентным штаммам E. coli клона ST 131, а также патогенным и условно-патогенным возбудителям кишечных и нозокомиальных инфекционных заболеваний.

Техническим результатом изобретения является высокая антагонистическая активность штамма по отношению к антибиотикорезистентным штаммам Escherichia coli, продуцирующим БЛРС и вызывающим внекишечные инфекционные заболевания человека и животных. Культуральная жидкость штамма обладает антагонизмом к по отношению к возбудителям нозокомиальных инфекционных заболеваний и кишечных заболеваний, вызываемых бактериальными инфекциями.

Заявленный технический результат достигается благодаря тому, что полученный штамм Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД отличается высокой антагонистической активностью по отношению к антибиотикорезистентным зооантропонозным штаммам E. coli клона ST 131, индуцировавшего развитие пандемии внекишечных инфекционных заболеваний у человека, а также антагонистической активностью по отношению к возбудителям кишечных инфекционных заболеваний (энтеропатогенные Escherichia coli, энтеротоксигенные Escherichia coli, Salmonella Enteritidis, Campylobacter jejuni) и возбудителям нозокомиальных инфекционных заболеваний (Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans). Штамм Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД выделен из кишечника бройлера. Принадлежность выделенного штамма лактобацилл к виду Lactobacillus salivarius определена методом секвенирования гена, кодирующего 16S rRNA. Полученный штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов, ФГБУН Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований» РАН (ФИЦ ПНЦБИ РАН Пущино) под номером BKM B- 2834D.

Штамм Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД характеризуется следующими биологическими свойствами.

Культурально-морфологические признаки

Грамположительные прямые бесспоровые палочки, располагающиеся поодиночке или в виде цепочек из 2-4 и более клеток или поодиночке. Величина клеток 18-часовой культуры в молоке составляет 10-20 мкм. Клетки равномерно окрашиваются по Граму. При выращивании на агаре с гидролизованным молоком через 48 ч роста штамм образует «локонообразные» колонии на поверхности агара. Диаметр колоний - 1-2 мм. При культивировании на среде МРС-5 в анаэробных или микроаэрофильных условиях через 48 ч штамм образует круглые без четких границ колонии. Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный анаэроб, микроаэрофил; растет в присутствии азота и углекислого газа в атмосфере. Температурный диапазон роста 38±1°С, фаза максимального накопления микробных клеток заканчивается к 24-48 ч. Оптимум рН 7,2-7,5. Ферментирует без образования газа глюкозу, рамнозу, сахарозу, галактозу, лактозу, слабо - сорбит, мальтозу, салицин, магнит. Условия хранения лиофильно высушенной культуры: в герметичной упаковке при температуре 4±2°С в защищенном от прямых солнечных лучей месте при относительной влажности воздуха не более 70%. При соблюдении всех норм, срок хранения 12 месяцев. Условия и состав сред для размножения: - плотные среды: МРС-5, Schaedler-arap (48 ч, 38±1°С, анаэробные условия) и агар с гидролизованным молоком (48 часов 38±1°С, анаэробные условия); - Schaedler - бульон (24-48 часов, 38±1°С, анаэробные условия).

Штамм Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД фенотипически апатогенный. Он не обладает гемолитической, протеолитической, летициназной, гиалуронидазной, антилизоцимной, ДНК-ной и РНК-ной активностью.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Изучение безвредности штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД на лабораторных животных

Определение безвредности штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД проводили в соответствии с ОФС.1.7.2.0001.15 «Безопасность пробиотиков в тестах in vivo». Безвредность штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД изучали на здоровых мышах линии Balb/c и беспородных белых мышах обоего пола массой 15±1 г, полученных из питомника «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России (Московская обл., Чеховский р-н, п. Столбовая). Длительность карантина для животных составляла 14 суток. В течение карантина проводили ежедневный осмотр животных (общее состояние и поведение). Клетки с животными помещали в отдельные комнаты. Световой режим: 12 ч - свет, 12 ч - темнота. Температуру воздуха поддерживали в пределах 19-25°С, относительную влажность - 30-70%. Содержание экспериментальных животных соответствовало действующим санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев). Животным давалась стандартная диета в соответствии с действующими нормами. Для обеспечения водой использовались автопоилки. Кормление производилось в фиксированное время. Наряду с подопытными животными из этой же партии в аналогичных условиях содержались контрольные животные. Формирование групп подопытных и контрольных животных проводили методом рандомизации. Безвредность одной дозы штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД оценивали на 10 мышах линии Balb/c и 10 беспородных белых мышах. Исследовали 3 дозы штамма (10⁹ КОЕ/0,5 мл; 10¹⁰ КОЕ/0,5 мл; 10¹¹ КОЕ/0,5 мл). Взвешивание животных производили непосредственно перед опытом. Взвесь штамма 2-го или 3-го пассажа в концентрации 10⁹ КОЕ; 10¹⁰ КОЕ; 10¹¹ КОЕ в объёме 0.5 мл водили каждой мыши перорально при помощи насадки на шприц вместимостью 1мл. Наблюдение за мышами осуществляли в течение 5 суток.

Учет и интерпретация результатов

Препарат считают выдержавшим испытание на безвредность, если в течение всего срока наблюдения:

- отсутствует гибель подопытных животных;

- отсутствует снижение групповой массы тела животных по сравнению с исходной.

Результаты экспериментов представлены в Таблицах 1, 2.

Штамм Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД при однократном пероральном введении в трех возрастающих концентрациях: 10⁹ КОЕ/0,5 мл, 10¹⁰ КОЕ/0,5 мл и 10¹¹ КОЕ/0,5 мл и с последующим наблюдением в течение 5 дней не влиял на среднегрупповую массу тела и не вызывали летальных исходов в опытной группе животных.

Таблица 1. Оценка безвредности штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД в опытах in vivo на мышах линии Balb/c

Название микроорганизма (род, штамм) Вводимая доза, КОЕ/0,5 мл Выживаемость Среднегрупповая масса тела,
(М, г) До начала После завершения Кол-во павших мышей До начала После завершения Δ, г Lactobacillus
salivarius MD IIE 2348 10⁹ 10 10 0 15,7 16.3 0,6 10¹⁰ 10 10 0 15,6 16,2 0,6 10¹¹ 10 10 0 15.8 16.4 0,6

Таблица 2. Оценка безвредности штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД в опытах in vivo на нелинейных белых мышах

Название микроорганизма (род, штамм) Вводимая доза,
КОЕ/0,5 мл Выживаемость Среднегрупповая масса тела,
(М, г) До начала После завершения Кол-во павших мышей До начала После завершения Δ, г Lactobacillus
salivarius MD IIE 2348 10⁹ 10 10 0 15,7 16,6 0,9 10¹⁰ 10 10 0 15,8 16,7 0,9 10¹¹ 10 10 0 15,5 16.4 0,9

Таким образом, из результатов экспериментов, представленных в Таблицах 1 и 2, штамм Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД не оказывает отрицательного влияния на выживаемость и массу тела экспериментальных животных в течение 5 дней после его однократного перорального введения. Вывод: штамм Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД является безвредным, т.к. при однократном пероральном введении в трех возрастающих концентрациях: 10⁹ КОЕ/0,5 мл, 10¹⁰ КОЕ/0,5 мл и 10¹¹ КОЕ/0,5 мл и с последующим наблюдением в течение 5 дней, не влияет на среднегрупповую массу тела и не вызывает летальных исходов.

Пример 2. Исследование антагонистической активности штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД по отношению к антибиотикорезистентным штаммам Escherichia coli, продуцирующим Бета-Лактамазы Расширенного Спектра (БЛРС) и вызывающим внекишечные инфекционные заболевания

Антагонистическую активность штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД проводили in vitro методом отсроченного антагонизма на плотной питательной среде (бифидоагар Hi Media, Индия) согласно инструкции, изложенной в работе [Чупринина Р.П. и соавт, 2012]. В опытах использовали 3 тест-штамма E. coli АТСС (E. coli ATCC BAA 198; E. coli ATCC BAA 204; E. coli ATCC BAA 2326), 3 тест-штамма, выделенные у пациентов в клинике, вызвавшие внекишечные инфекционные заболевания, 4 тест-штамма, выделенные у бройлеров, 1 тест-штамм, выделенный у поросёнка, 1 тест-штамм, выделенный у коровы с лактационным маститом. Тест-штамм E. coli ATCC BAA 198 продуцирует молекулярный класс БЛРС TEM-26; тест-штамм E. coli ATCC BAA 204 продуцирует молекулярный класс БЛРС SHV-2; тест-штамм: E. coli ATCC BAA 2326 продуцирует молекулярный класс БЛРС CTX-M-15. Клинический тест-штамм E. coli IIE Hu4326, выделен из мочи больной циститом; клинический тест-штамм E. coli IIE Hu4435, выделен из мочи больной пиелонефритом; клинический тест-штамм E. coli IIE Hu4518, выделен из крови больного с развившимся сепсисом. Тест-штаммы E. coli IIE Br5137; E. coli IIE Br5164; E. coli IIE Br5210, E. coli IIE Br5372 выделены из кишечника бройлеров. Тест-штамм E. coli IIE Pi5528, выделен из кишечника поросёнка. Тест-штамм E. coli IIE Со5679, выделен у коровы, больной маститом. Клинические изоляты (E. coli IIE Hu4326 и E. coli IIE Hu4435), а также все тест-штаммы, выделенные у сельскохозяйственных животных были резистентны к цефалоспоринам третьего поколения (цефотаксим, цефтазидим, цефоперазон) и четвёртого поколения (цефалим, цефпиром). Клинический изолят E. coli IIE Hu4518 был резистентен к цефалоспоринам III-IV поколения, фторхинилонам I поколения (ципрофлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин) и II поколения (левофлоксацин). Согласно данным ПЦР все выделенные тест-штаммы содержали в своём геноме гены БЛРС, принадлежащих к одному из молекулярных классов TEM, SHV или СТХ-М. Учёт результатов антагонистической активности штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД по отношению к антибиотикорезистентным штаммам E. coli, продуцирующим БЛРС, проводили через 24-48 часов инкубирования при 37°С в термостате по величине зоны отсутствия роста тест-культуры в мм. Результаты исследований приведены в Таблице 3. Согласно полученным данным штамм Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД проявляет высокую антагонистическую активность по отношению к, выделенным от человека и от сельскохозяйственных животных, антибиотикорезистентным штаммам E. coli, продуцирующим БЛРС и вызывающим внекишечные инфекционные заболевания.

Таблица 3. Антагонистическая активность штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД по отношению к антибиотикорезистентным штаммам Escherichia coli, продуцирующим БЛРС и вызывающим внекишечные инфекционные заболевания

Тест-культура, штамм Зона подавления роста тест-культуры, мм Примечания Escherichia coli ATCC BAA 198 24 ± 3 Молекулярный класс БЛРС*
ТЕМ-26 Escherichia coli ATCC BAA 204 25 ± 3 Молекулярный класс SHV-2 Escherichia coli ATCC BAA 2326 23 ± 1 Молекулярный класс CTX-M-15 Escherichia coli IIE Hu 4326 27 ± 3 КИ**- выделен из мочи больной циститом. Молекулярный класс SHV Escherichia coli IIE Hu 4435 26 ± 2 КИ- выделен из мочи больной пиелонефритом. Молекулярный класс TEM Escherichia coli IIE Hu 4518 25 ± КИ- выделен из крови больного сепсисом. Молекулярный класс CTX-M Escherichia coli IIE Br 5137 28 ± 3 Штамм выделен из кишечника бройлера. Молекулярный класс MEM. Escherichia coli IIE Br 5164 24 ± 2 Штамм выделен из кишечника бройлера. Молекулярный класс SHV. Escherichia coli IIE Br 5210 27 ± 3 Штамм выделен из кишечника бройлера. Молекулярный класс CTX-M. Escherichia coli IIE Br 5372 23 ± 1 Штамм выделен из тушки бройлера, супермаркет. Молекулярный класс CTX-M. Escherichia coli IIE Pi 5548 22 ± 1 Штамм выделен из кишечника поросенка. Молекулярный класс CTX-M. Escherichia coli IIE Co 5622 24 ± 2 Штамм выделен из вымени коровы, больной маститом. Молекулярный класс CTX-M Примечания:
* - бета лактамазы расширенного спектра; ** - клинический изолят. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

Пример 3

Исследование антагонистической активности штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД по отношению к возбудителям кишечных инфекционных заболеваний

Антагонистическую активность штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД по отношению к возбудителям кишечных инфекций исследовали методом отсроченного антагонизма согласно инструкции, изложенной в работе [Чупринина Р.П. и соавт, 2012]. В опытах использовали энтеропатогенный тест-штамм E. coli АТСС Е 2448/69; энтеротоксигенный тест-штамм E. coli АТСС 31705; тест-штамм S. Enteritidis АТСС 13076, тест-штамм C. jejuni ATCC 29428. Учёт результатов проводили через 24-48 часов инкубирования при 37°С в термостате по величине зоны отсутствия роста тест-культуры в мм. Результаты исследований приведены в Таблице 4. Согласно полученным данным штамм Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД проявляет антагонистическую активность по отношению к возбудителям кишечных инфекционных заболеваний.

Таблица 4. Антагонистическая активность штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД по отношению к возбудителям кишечных инфекционных заболеваний

Спектр антагонистической активности штамма Lactobacillus salivarius MD IIE 2348 по отношению к тест-культурам патогенов, вызывающих кишечные инфекционные заболевания Зоны подавления роста тест-культур патогенов, мм Escherichia coli ATCC Е2448/69 (ЕРЕС)^а Escherichia coli ATCC 31705 (ЕТЕС)^б Salmonella Enteritidis ATCC 13076 Campylobacter jejuni ATCC 29428 27 ± 2 28 ± 3 24 ± 2 23 ± 2 Примечания: ^аEscherichia coli - энтеропатогенный штамм. ^бEscherichia coli - энтеротоксигенный штамм. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

Пример 4

Исследование антагонистической активности штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД по отношению к возбудителям нозокомиальных инфекционных заболеваний

Антагонистическую активность штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД по отношению к возбудителям нозокомиальных инфекционных заболеваний проводили методом отсроченного антагонизма согласно инструкции, изложенной в работе [Чупринина Р.П. и соавт., 2012]. В опытах использовали тест-штамм K. pneumoniae АТСС 43816; тест-штамм P. aeruginosa АТСС 27853; тест-штамм S. aureus АТСС 25923, тест-штамм C. albicans ATCC 10231. Учёт результатов проводили через 24-48 часов инкубирования при 37°С в термостате по величине зоны отсутствия роста тест-культуры в мм. Результаты исследований приведены в Таблице 5. Согласно полученным данным, штамм Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД проявляет антагонистическую активность по отношению к возбудителям нозокомиальных инфекционных заболевний.

Таблица 5. Антагонистическая активность штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД по отношению к возбудителям нозокомиальных инфекционных заболеваний

Спектр антагонистической активности штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД по отношению к тест-культурам патогенов, вызывающих нозокомиальные инфекционные заболевания Зоны подавления роста тест-культур патогенов, мм Klebsiella pneumoniae ATCC 43816 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Candida albicans ATCC 10231 27 ± 3 26 ± 3 25 ± 2 13 ± 1 Примечание: Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

Пример 5

Исследование антагонистической активности супернатанта культуральной жидкости, полученного после культивирования штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД, по отношению к возбудителям нозокомиальных инфекционных заболеваний

Бесклеточные супернатанты культуральной жидкости штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД, выращенного в MRS бульоне в течение 18 ч в микроаэрофильных условиях, вносили в лунки агара, содержащего соответствующие микроорганизмы-возбудители нозокомиальных инфекций, как описано в работах [Magaldi, 2004]. Антагонистическую активность супернатанта культуральной жидкости штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД оценивали по величине задержки роста исследуемых штаммов микроорганизмов в агаре в мм. Результаты исследований приведены в Таблице 6. Согласно полученным данным, супернатант культуральной жидкости штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД проявляет антагонистическую активность по отношению к возбудителям нозокомиальных инфекционных заболеваний.

Таблица 6. Антагонистическая активность супернатанта культуральной жидкости, полученного после культивирования штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД, по отношению к возбудителям нозокомиальных инфекционных заболеваний

Спектр антагонистической активности супернатанта культуральной жидкости штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД по отношению к тест-культурам патогенов, вызывающих нозокомиальные инфекционные заболевания Зоны подавления роста тест-культур патогенов, мм Klebsiella pneumoniae ATCC 43816 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Candida albicans ATCC 10231 19 ± 1 18 ± 3 16 ± 1 14 ± 1 Примечание: Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

Пример 6

Исследование адгезии штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД на перевиваемых энтероцитах тонкой кишки (Caco-2) и перевиваемых энтероцитах толстой кишки (HT-29) человека

Адгезивные свойства штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД исследовали с помощью перевиваемых энтероцитов тонкой кишки (Caco-2) и перевиваемых энтероцитов толстой кишки (HT-29) человека. Энтероциты Caco-2 или HT-29 в концентрации 3.0×10⁵ кл/мл высевали в объёме 2 мл на лунку на среду DMEM, содержащую 10% эмбриональной сыворотки телёнка, в 6-ти луночные планшеты и культивировали 24 ч в СО₂ инкубаторе для формирования 70-80% монослоя. Планшеты с монослоем энтероцитов промывали трёхкратно средой DMEM без фетальной сыворотки, затем к монослою энтероцитов добавляли среду DMEM, содержащую L-глутамин и культуру клеток штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД, выращенную на среде MRS, pH=6.5. Перед добавлением к монослою энтероцитов лактобациллы дважды промывали забуференным физиологическим раствором (ЗФР) путём центрифугирования при 5000 об/ мин в течение 15 мин и ресуспендировали в среде DMEM, содержащей L-глутамин. Множественность инфицирования (МОИ) составляла 200 бактерий на один энтероцит. Планшеты, содержащие монослой энтероцитов с внесёнными к ним лактобациллами инкубировали 5 ч при 37°С в СО₂ инкубаторе в атмосфере, содержащей 5% СО_2, затем лунки планшетов трижды промывали охлаждённым ЗФР для удаления лактобацилл, не связавшихся с монослоем энтероцитов, фиксировали в холодном этаноле (3 мин), окрашивали по Романовскому-Гимзе в теч. 30 мин, промывали охлаждённым ЗФР, высушивали при комнатной температуре и исследовали микроскопически. Определяли активность адгезии- количество энтероцитов из 100 проанализированных под микроскопом, содержащих на своей поверхности лактобациллы, в процентах, а также индекс адгезии штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД представляющий собой средний показатель адгезии, число микробов на поверхности одной клетки - микроб/клетка. Результаты исследований представлены в Таблице 7. Штамм Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД является высокоадгезивным для Caco-2 и HT-29 энтероцитов человека.

Таблица 7. Адгезия клеток штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД на перевиваемых энтероцитах тонкой кишки (Caco-2) и перевививаемых энтероцитах толстой кишки (HT-29) человека

Перевиваемые энтероциты человека Caco-2 HT-29 Активность адгезии, % Индекс адгезии Активность адгезии, % Индекс адгезии 100 ± 0 26± 4 100 ± 0 28 ± 5 Примечание: Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

Пример 7

Исследование адгезии штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД на перевиваемых клетках НТВ-9 мочевого пузыря и А-498 почки человека

Адгезивные свойства штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД исследовали с помощью перевиваемых клеток НТВ-9 мочевого пузыря и А-498 почки человека. Клетки НТВ-9 и клетки А-498 в концентрации 3.0×10⁵ кл/мл высевали в объёме 2 мл на лунку на среду RPMI-1640, содержащую 10% эмбриональной сыворотки телёнка в 6-ти луночные планшеты и культивировали 24 ч в СО₂ инкубаторе для формирования 70-80% монослоя. Планшеты с монослоем клеток НТВ-9 или А-498 промывали трёхкратно средой RPMI-1640 без фетальной сыворотки, затем к монослою клеток НТВ-9 или А-498 добавляли культуру клеток Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД выращенную на среде MRS, pH=6.5. Предварительно лактобациллы промывали ЗФР путём центрифугирования при 5000 об/ мин в течение 15 мин и ресуспендировали в среде RPMI-1640. Множественность инфицирования (МОИ) составляла 200 бактерий на одну клетку НТВ-9 или А-498. Планшеты, содержащие монослой клеток НТВ-9 или А-498 с внесёнными к ним лактобациллами инкубировали 5 ч при 37°С в СО₂ инкубаторе в атмосфере, содержащей 5% СО_2, затем лунки планшетов трижды промывали охлаждённым ЗФР для удаления лактобацилл, не связавшихся с монослоем клеток НТВ-9 или А-498, фиксировали в холодном этаноле (3 мин), окрашивали по Романовскому-Гимзе в теч. 30 мин, промывали охлаждённым ЗФР, высушивали при комнатной температуре и исследовали микроскопически. Определяли активность адгезии- количество клеток НТВ-9 или А-498 из 100 проанализированных под микроскопом, содержащих на своей поверхности лактобациллы, в процентах, а также индекс адгезии штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД. Результаты исследований представлены в Таблице 8. Штамм Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД является высокоадгезивным для клеток НТВ-9 и клеток А-498.

Таблица 8. Адгезия клеток штамма Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД на перевиваемых клетках НТВ-9 мочевого пузыря и А-498 почки человека

Перевиваемые клетки мочевыделительной системы человека НТВ-9 А-498 Активность адгезии, % Индекс адгезии Активность адгезии, % Индекс адгезии 100 ± 0 29 ± 3 100 ± 0 30 ± 4 Примечание: Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

Таким образом, заявляемый штамм Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД отличается высокой антагонистической активностью по отношению к глобально распространившимся патогенным штаммам антибиотикорезистентного клона Escherichia coli ST 131. Исследуемый штамм фенотипически апатогенный, т.е. не обладает гемолитической, протеолитической, летициназной, гиалуронидазной, антилизоцимной, ДНК-ной и РНК-ной активностью. Штамм Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД имеет высокие показатели адгезии на перевиваемых энтероцитах тонкой кишки (Caco-2), энтероцитах толстой кишки (HT-29), перевиваемых клетках НТВ-9 мочевого пузыря (НТВ-9) и клетках почки (А-498 ) человека. Штамм Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД высокотехнологичен, на искусственных питательных средах быстро накапливает биомассу с высокой концентрацией лактобактерий. Все это позволяет предложить штамм Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД для использования в производстве пробиотиков, обладающих высокой антагонистической активностью по отношению к глобально распространившимся патогенным штаммам антибиотикорезистентного клона Escherichia coli ST 131, вызвавшего пандемию внекишечных инфекционных заболеваний у человека и животных, а также для использования в производстве кормовых добавок для сельскохозяйственных животных.

Список литературы

1. Nicolas-Chanoine M-H, Blanco J, Leflon-Guibout V, Demarty R, Alonso MP, Caniça MM, Park Y-J, Lavigne J-P, Pitout J, Johnson JR. 2008. Intercontinental emergence of Escherichia coli clone O25:H4-ST131 producing CTX-M-15. J Antimicrob Chemother 61:273-281. https://doi.org/ 10.1093/jac/dkm464.

2. Cantón R, Nordmann P. Dissemination of clonally related Escherichia coli strains expressing extended-spectrum -lactamase CTX-M-15. Emerg. Infect. Dis.2008. 14:195-200. https://doi.org/10.3201/eid1402.070350.

3.Klemm, E. J., Wong, V. K., and Dougan, G. Emergence of Dominant Multidrug-Resistant Bacterial Clades: Lessons From History and Whole-Genome Sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. 2018. 115 (51), 12872. doi: 10.1073/pnas.1717162115

4. Tchesnokova V., Rechkina E., Chan D., Haile H., Larson L., Ferrier K., Schroeder D., Solyanik T., Shibuya S., Hansen K., Ralston J., Riddell K., Scholes D., Sokurenko E. Pandemic uropathogenic fluoroquinolone-resistant Escherichia coli have enhanced ability to persist in the gut and cause bacteriuria in healthy women. Clin. Infect. Dis. 2019. https://doi.org/10.1093/cid/ ciz547.

5. Russo TA, Johnson JR. 2003. Medical and economic impact of extraintestinal infections due to Escherichia coli: an overlooked epidemic. Microbes Infect 5:449 - 456. http://dx.doi.org/10.1016/S1286 -4579(03)00049-2.

6. Kaper JB, Nataro JP, Mobley HL. 2004. Pathogenic Escherichia coli. Nat Rev Microbiol.2004. 2:123-140. https://doi.org/10.1038/nrmicro818.

7.Yun K., Lee M., Kim W., Lim I. Uropathogenic Escherichia coli ST 131 in urinary tract infections in children. Korean J. Pediatr.2017. 60 (7): 221-226.https://doi.org/10.3345/kip.2017.60.7.221.

8.Ahn D., Kim K., Cho H., Tchah H., Jeon I.,Ryoo E., et al. Febrile urinary tract infections caused by community-acquired extended-spectrum beta-lactamase -producing and -nonproducing bacteria: a comparative study. Pediatr. Infect.Vaccine.2015. 22: 29-35.

9.Kocak M., Buyukkaragaz B., Celebi Tayfur A., Caltic A., Koksoy A., Cizmeci Z., et al. Causative pathogens and antibiotic resistance in children hospitalized for urinary tract infection. Pediatr. Int. 2016.58:467-471.

10. Tumbarello M, Sanguinetti M, Montuori E, Trecarichi EM, Posteraro B, Fiori B, Citton R, D’Inzeo T, Fadda G, Cauda R, Spanu T. Predictors of mortality in patients with bloodstream infections caused by extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae: importance of inadequate initial antimicrobial treatment. Antimicrob Agents Chemother. 2007 51: 1987-1994. https://doi.org/10.1128/AAC.01509-06

11.Thelwall S, Nsonwu O, Wasti S, Elmi M, Gerver S, Davies J, Hope R. 2016. Annual epidemiological commentary: mandatory MRSA, MSSA and E. coli bacteraemia and C. difficile infection data 2015/16, p 33- 42. Public Health England, London, United Kingdom. https://www.researchgate.net/ publication/305392637_Annual_Epidemiological_Commentary_Mandatory _MRSA_MSSA_and_E_coli_bacteraemia_and_C_difficile_infection_data _201516.

12. Walker EB, Lyman A, Gupta K, Mahoney MV, Snyder GM, Hirsch EB. Clinical management of an increasing threat: outpatient urinary tract infections due to multidrug-resistant uropathogens. Clin. Infect. Dis.2016 63: 960 -965. https://doi.org/10.1093/cid/ciw396.

13. Бойцов С., Баланова Ю., Шальнов С. И др. Артериальная гипертония среди лиц 25-64 лет: распространённость, осведомлённость, лечение и контроль. По материалам исследования ЭССЕ. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2014.13(4):4-14.

14. Nicolas-Chanoine MH, Bertrand X, Madec JY. Escherichia coli ST131, an intriguing clonal group. Clin. Microbiol. Rev.2014. 27:543-574. http:// dx.doi.org/10.1128/CMR.00125-13.

15.Kathayat D, Lokesh D, Ranjit S, Rajashekara G Avian pathogenic Escherichia coli (APEC): an overview of virulence and pathogenesis factors, zoonotic potential, and control strategies. Pathogens.2021. 10(4):467. https://doi.org/10.3390/pathogens10040467

16. Pitout JD. 2008. Multiresistant Enterobacteriaceae: new threat of an old problem. Expert Rev Anti Infect Ther.2008. 6:657- 669. http://dx.doi.org/ 10.1586/14787210.6.5.657.

17. Talan DA, Takhar SS, Krishnadasan A, Abrahamian FM, Mower WR, Moran GJ, EMERGEncy ID Net Study Group. Fluoroquinoloneresistant and extended-spectrum -lactamase-producing Escherichia coli infections in patients with pyelonephritis, United States. Emerg. Infect. Dis.2016. 22:160148. http://dx.doi:org/10.3201/eid2209.160148.

18. Johnson JR, Menard M, Johnston B, Kuskowski MA, Nichol K, Zhanel GG. Epidemic clonal groups of Escherichia coli as a cause of antimicrobial-resistant urinary tract infections in Canada, 2002 to 2004. Antimicrob. Agents Chemother. 2009. 53:2733-2739. http://dx.doi.org/ 10.1128/AAC.00297-09.

19. Tchesnokova V, Billig M, Chattopadhyay S, Linardopoulou E, Aprikian P, Roberts PL, Skrivankova V, Johnston B, Gileva A, Igusheva I, Toland A, Riddell K, Rogers P, Qin X, Butler-Wu S, Cookson BT, Fang FC, Kahl B, Price LB, Weissman SJ, Limaye A, Scholes D, Johnson JR, Sokurenko EV. Predictive diagnostics for Escherichia coli infections based on the clonal association of antimicrobial resistance and clinical outcome. J Clin Microbiol. 2013. 51:2991-2999. http://dx.doi.org/ 10.1128/JCM.00984-13.

20. Colpan A, Johnston B, Porter S, Clabots C, Anway R, Thao L, et al. Escherichia coli sequence type 131 (ST131) subclone H30 as an emergent multidrug-resistant pathogen among US veterans. Clin. Infect. Dis. 2013. 57:1256-65.

21. Petty NK, Ben Zakour NL, Stanton-Cook M, Skippington E, Totsika M, Forde BM, Phan MD, Gomes Moriela D, Peters KM, Davies M, Rogers BA, Dougan G, Rodriguez-Baño J, Pascual A, Pitout JD, Upton M, Paterson DL, Walsh TR, Schembri MA, Beatson SA. Global dissemination of a multidrug resistant Escherichia coli clone. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2014. 111:5694 -5699. http://dx.doi.org/10.1073/ pnas.1322678111.

22. Hutt P, Shchepetova J, Loivukene K, et al. Antagonistic activity of probiotic lactobacilli and bifidobacteria against entero- and uropathogens. J Appl Microbiol. 2006;100:1324-1332.

23.Stoesser N, Sheppard AE, Pankhurst L, de Maio N, Moore C, Sebra R, Turner P, Anson L, Kasarkis A, Batty E, Kos V, Wilson D, Phetsouvanh R, Wyllie D, Sokurenko E, Manges A, Johnson TJ, Price LB, Peto T, Johnson J, Didelot X, Walker AS, Crook D, Modernizing Medical Microbiology Informatics Group (MMMIG). 2016. Evolutionary history of the global emergence of the Escherichia coli epidemic clone ST131. mBio 7(2): e02162-15. https://doi.org/10.1128/mBio.02162-15.

24. Патент RU 2302458 C2.

25. Patent PCT WO 2012103785 A1.

26. Патент RU 2726653 C2.

27. Patent ES 2898876 T3.

28. ОФС.1.7.2.0001.15 «Безопасность пробиотиков в тестах in vivo», Минздрав России, http://www.rosminzdrav.ru/docs/mzsr/regulation/81.

29. Чупринина Р.П., Осипова И.Г., Евлашкина В.Ф., Ладыгина А.В., Терёшкина Н.В. Доклинические исследования препаратов нормофлоры. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (иммунобиологические лекарственные препараты). Часть вторая / под ред. А.Н. Миронова. -М.: Гриф и К, 2012.-536 с.

30. Magaldi S., Mata-Essayag S., Hartung de Capriles C., et al. Well diffusion for antifungal susceptibility testing. Int. J. Infect. Dis. 2004.8. 39-45.DOI: 10.1016/j.ijid.2003.03.002

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм Lactobacillus salivarius ВКШМ-Г-08ПД, обладающий антагонистической активностью по отношению к зооантропонозным штаммам антибиотикорезистентного клона Escherichia coli ST 131. 8 табл., 7 пр.

Штамм Lactobacillus salivarius, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов, ФГБУН Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований» РАН (ФИЦ ПНЦБИ РАН Пущино) под номером ВКШМ-Г-08ПД, обладающий антагонистической активностью по отношению к зооантропонозным штаммам антибиотикорезистентного клона Escherichia coli ST 131.