СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ СВОБОДНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫХ АМИНОКИСЛОТ Российский патент 2009 года по МПК C07C227/40 G01N27/26 G01N27/447 

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к разделению смесей свободных генетически кодируемых аминокислот методом капиллярного электрофореза, и может быть использовано как для диагностики наиболее распространенных и опасных заболеваний, так и для контроля качества препаратов для их лечения. Данное изобретение имеет важное практическое значение для структурного анализа биополимеров и их фрагментов.

Для разделения аминокислот наиболее распространены хроматографические методы - тонкослойная хроматография (ТСХ), ионообменная хроматография (ИОХ) [Kuo Ch.-T., Wang P.-Y., Wu C.-H., J. Chromatogr. A. - 2005. - V. 1085. - P.91-97], обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ) [Shpigun О.А., Shapovalova E.N., Ananieva LA., Pirogov A.V. // J. Chromatogr. A. -2002. -V. 979. - I.1-2. - P.191-199], газовая хроматография (ГХ) [Sobolevsky T.G., Revelsky A.I., Revelsky I.A. // J. of Chromatogr. В, - 2004, - V. 800, - Р.101-107]. Во всех вышеупомянутых методах присутствует стадия химической модификации аминокислот. В газохроматографическом анализе это обусловлено тем, что аминокислоты в свободном виде представляют собой малолетучие соединения. Необходимость модификации при анализе аминокислот методами ИОХ и ОФ ВЭЖХ вызвана трудностями при их детектировании в свободном виде. В случае ИОХ это постколоночная модификация [модификация нингидрином или о-фталевым альдегидом], а в ОФ ВЭЖХ - предколоночная [Nazimov I.V., Levina N.B. // Chem. Pept. and Prot. - 1986. - Vol.3. - P.119-126]. В зависимости от способа детектирования свободные аминокислоты переводятся в фенилтиокарбамоильные (ФТК-) или 2-фенил-3-тиогидантоиновые (ФТГ-) производные.

Известен способ детектирования, не требующий предварительной модификации компонентов - масс-спектрометрический способ детектирования [Deng С., Yin X., Zhang L., Zhang X. // Rapid Commun. Mass Spectrom. - 2005. - Vol.19. - P.2227-2234]. Однако этот способ отличается высокой себестоимостью и имеет узкое применение для рутинного анализа.

Недостатками указанных классических методов аминокислотного анализа являются достаточно сложное аппаратурное оформление и большой объем дорогостоящих токсичных реактивов.

Поскольку аминокислоты в водном растворе являются заряженными частицами, то становится возможным их разделение методом капиллярного зонального электрофореза (КЗЭ). Преимуществом метода КЗЭ для определения аминокислот является простота проведения анализа. Она достигается за счет исключения из анализа стадии химической модификации разделяемых компонентов (дериватизации) и дополнительных устройств для их детектирования. Недостаток данного метода заключается в том, что из-за незначительной разницы в молекулярных массах аминокислот разница в их электрофоретических подвижностях невелика, что может сильно повлиять на качество анализа.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности является способ разделения 11 свободных аминокислот методом КЗЭ при использованием в качестве фонового электролита раствора тетрабората натрия (рН 9.18) с оптимальной концентрацией 0.01 М. [Манаенков О.В., Сидоров А.И., Сульман Э.М. // Ж. Анал. Химии. - 2003. - Т. 58. - №10. - С.1093-1096]. Анализ проводится при напряжении +23 кВ и температуре 20°С. Определение содержания аминокислот осуществляется УФ-фотометрическим способом. Существенным недостатком указанного способа является низкая селективность, затруднения в разделение таких аминокислот как лейцин и изолейцин, лизин и метионин и других из-за близких по значению времен миграции. Из-за наложения друг на друга пиков аланин и триптофан, глицин и тирозин при детектировании на длине волны 200 нм требуют проведения повторного анализа для определения ароматических аминокислот при детектировании на 235 нм. Использование щелочных фоновых электролитов без органических добавок позволяет разделить лишь 11 генетически кодируемых аминокислот из 22 возможных.

Таким образом, большинство существующих методов аминокислотного анализа является либо недостаточно чувствительным и селективным для их идентификации, либо требует дериватизации аминокислот, что существенно усложняет процесс их определения. Из этого следует, что проблема простого и экономичного анализа свободных генетически кодируемых аминокислот до сих пор до конца не решена.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка нового метода высокочувствительного и надежного определения аминокислот без предварительной дериватизации.

Основным преимуществом данной методики является возможность разделения аминокислот без их химической модификации, что значительно упрощает схему анализа и снижает себестоимость. Разработанная методика позволяет полностью разделить смесь 16 свободных генетически кодируемых аминокислот с высокой степенью разрешения. Данный способ разделения свободных аминокислот позволяет определять аминокислотный состав синтетических и природных биологически-активных пептидов.

Технический результат достигается применением метода КЗЭ, который заключается в использовании немодифицированных гибких кварцевых капилляров с внутренним диаметром 75 мкм и эффективной длиной 50 см, сильнокислых фоновых электролитов с добавкой метанола (рН 1,9-2,1). Анализ проводят при напряжении +9-+11 кВ. При несоблюдении данных условий наблюдается ухудшение в разделении анализируемой смеси аминокислот. Для идентификации свободных аминокислот используется простой и экономичный УФ фотометрический детектор. При этом УФ-детектирование проводится при длине волны поглощения карбонильных групп 208 нм, что обеспечивает детектирование всех аминокислот без использования двух различных длин волн, как в прототипе. Эффективность разделения достигается посредством добавок различных органических модификаторов к фоновому электролиту. Для этих целей удобнее использовать фоновые электролиты с рН<7, так как в щелочной среде анализируемая система становится гетерогенной.

Пример

Для идентификации приготавливают растворы стандартных аминокислот в концентрации 1 мг/мл (гистидин, метионин, фенилаланин и тирозин) и 10 мг/мл (остальные анализируемые аминокислоты) в 1% трифторуксусной кислоте.

Для разделения свободных генетически кодируемых аминокислот используют немодифицированные кварцевые капилляры с внутренним диаметром 75 мкм и эффективной длиной 50 см.

Используемый капилляр перед анализом промывается 5 минут 0,1 М раствором NaOH и далее 5 минут разделительным буфером. В качестве фонового электролита использовали водно-органический раствор 150 мМ дигидрофосфата натрия с 30% содержанием метанола (рН 2,0).

Ввод пробы в капилляр осуществляют вакуумным способом в течение 1,5 сек. Оптимальное значение напряжения для максимального разделения аминокислот - 10 кВ. Анализ проводят при температуре 28°С. Время разделения 16 аминокислот методом КЗЭ составляет 90 минут. Идентификацию компонентов анализируемой смеси осуществляли посредством встроенного УФ-фотометрического детектора при длине волны 208 нм.

Таблица 1АминокислотаПредлагаемый способτ удер.Δ τ удер.Лизин35,5 Аргинин382,5Гистидин402Глицин444Аланин47,53,5Валин568,5Изолейцин582Лейцин59,41,4Серин611,6Треонин654Метионин661Фенилаланин704Глутаминовая кислота722Пролин753Тирозин79,54,5Аспарагиновая кислота822,5

Таблица 2АминокислотаПрототипτ удер.Δ τ удер.Аргинин4,5 Глицин5,91,4Аланин5,40,5Треонин6,91,5Фенилаланин5,21,7Глутаминовая кислота10,75,5Тирозин5,94,8Аспарагиновая кислота104,1Триптофан5,45,6Аспарагин7,11,7Глутамин6,30,8Цистеин8,72,4

Таким образом, данное изобретение позволяет разделить 16 свободных аминокислот с лучшей степенью разрешения (прототип - 11 аминокислот) (табл.1 и 2). Указанные преимущества достигаются путем проведения анализа в кислой среде в присутствии добавки метанола. Низкое значение напряжения также способствует улучшению эффективности разделения. Используемый метод капиллярного электрофореза упрощает схему анализа и уменьшает себестоимость за счет исключения стадии химической модификации. Кроме того, этот способ предоставляет возможность применения для определения аминокислотного состава синтетических и природных биологически активных пептидов.

Изобретение относится к разделению смесей свободных генетически кодируемых аминокислот методом капиллярного электрофореза и может быть использовано как для контроля качества лекарственных препаратов, так и для определения аминокислотного состава биологически-активных пептидов. В качестве фонового электролита предлагается использовать раствор дигидрофосфата натрия с добавкой метанола (рН 1,9-2,1). Анализ проводится при напряжении +9-+11 кВ. В результате повышается селективность разделения свободных генетически кодируемых аминокислот, что приводит к полному разделению смеси 16 аминокислот. Становится возможным проводить аминокислотный анализ биологически-активных пептидов. 2 табл.

Способ разделения свободных генетически кодируемых аминокислот методом капиллярного зонального электрофореза с использованием фонового электролита, отличающийся тем, что в качестве фонового электролита используют раствор дигидрофосфата натрия с концентрацией 145-155 мМ и 30%-ным содержанием метанола при рН 1,9-2,1.