СПОСОБ КОМПЛЕКСНОЙ ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ СПОРОВЫХ ФОРМ БАКТЕРИЙ НА ОСНОВЕ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА Российский патент 2011 года по МПК C12Q1/02 G01N33/569 

Изобретение относится к экспрессным способам специфической идентификации микроорганизмов, а именно к специфической идентификации бактерий в споровой форме методом капиллярного электрофореза.

Известно, что для экспрессной специфической идентификации бактерий, в том числе и в споровой форме, наиболее широкое распространение получили иммунологические и молекулярно-генетические методы анализа. Однако данные методы требуют усовершенствования, так как имеют ряд недостатков. Так, например, из иммунологических методов наибольшее распространение получил способ идентификации бактерий, в том числе и в споровой форме, на основе иммуноферментного анализа, заключающийся в специфическом взаимодействии антител с бактериальными клетками и измерении скорости ферментативной реакции [1-3]. При этом иммуноферментный анализ имеет несколько модификаций, например твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА), «точечный» иммуноферментный анализ (дот-ИФА) и другие.

К недостаткам данного способа следует отнести:

- использование дорогих тест-систем;

- многостадийность и длительность анализа (до 6 часов);

- влияние примесей (дот-ИФА).

Известен способ идентификации бактерий, в том числе и в споровой форме, на основе полимеразной цепной реакции и его разновидность ПЦР-РВ, относящийся к молекулярно-генетическим методам анализа, заключающийся в выделении ДНК (РНК) из клинического образца (пробы), амплификации специфических фрагментов ДНК и детекции продуктов амплификации [4, 5].

К недостаткам данного способа также следует отнести:

- использование дорогих тест-систем;

- многостадийность анализа (выделение ДНК, амплификация).

При этом для выполнения перечисленных разновидностей методов необходим квалифицированный оператор, подготовка которого в специализированных учреждениях занимает длительный (несколько месяцев) период времени.

Наиболее близким по существу к заявляемому способу является способ идентификации на основе иммуноэлектрофореза [6, 7]. Иммуноэлектрофорез представляет собой сочетание двух методов: иммунодиффузии и зонального электрофореза в геле. Он применяется в основном для идентификации белков. Суть данного способа заключается в следующем:

- образец антигенного состава помещается в лунку, вырезанную в геле;

- проводится электрофоретическое разделение;

- в геле вырезается бороздка, параллельная направлению миграции белков при электрофорезе, и заполняется смесью антител к белкам (антигенам);

- разделенные при электрофорезе белки (антигены) и антитела диффундируют навстречу друг другу. В местах связывания антител с антигенами образуются дуги преципитации, по которым и осуществляют идентификацию белков.

Иммуноэлектрофорез может быть использован для решения задач специфической идентификации бактерий в споровой форме при использовании капиллярного электрофореза.

Как известно, при капиллярном электрофорезе разделение компонентов пробы осуществляется в капилляре, внутренний диаметр которого может быть от 25 до 160 мкм. После введения пробы к концам капилляра прикладывается напряжение, и заряженные частицы под действием электрического поля и создаваемого электроосмотического потока начинают двигаться в направлении катода или анода. Детектирование может проводиться в ультрафиолетовой и видимой области спектра в диапазоне длин волн от 191 до 599 нм. При этом метод капиллярного электрофореза активно используется для электрофоретического разделения биологических микрообъектов, в том числе и белков [8].

Известно, что иммуноглобулины - группа близких по химической природе и свойствам глобулярных белков позвоночных животных и человека, которые обладают свойствами антител, то есть специфической способностью соединяться с антигеном, который стимулирует их образование [9]. Так как иммуноглобулины, по сути, являются белками, следовательно, возможно их детектирование в системе капиллярного электрофореза Agilent 3D СЕ за счет наличия аминокислот и пептидных связей, поглощающих свет в ультрафиолетовой области [10]. При этом электрофоретическое разделение возможно за счет того, что каждая молекула белка, а следовательно, и иммуноглобулина, имеет заряд. Этот заряд определяется как сумма электрических зарядов боковых групп аминокислот: основных (диаминомонокарбоновые кислоты) и кислых (моноаминодикарбоновые кислоты), лежащих на поверхности белка [10].

Для проведения комплексной иммуноэлектрофоретической идентификации бактерий в споровой форме с использованием системы Agilent 3D СЕ предварительно проводят реакцию «антиген - антитело» путем добавления рабочего раствора иммуноглобулина специфического в фосфатном буфере. При этом реакцию проводят непосредственно в виале в течение 25 мин при 37°С. В ходе реакции образуется комплекс «бактерия в споровой форме - иммуноглобулин специфический», отличающийся размером и суммарным зарядом от иммуноглобулина специфического.

Электрофоретическое разделение комплекса проводят непосредственно в кварцевом капилляре диаметром 75 мкм с использованием в качестве электролита фосфатного буфера и с соблюдением следующих параметров:

- температура капилляра, равная плюс 20±0,1°С;

- напряжение, используемое для разделения, равное плюс 20±0,1 кВ;

- способ введения пробы - гидродинамический в течение 5 с при давлении 30±0,2 мбар.

Разделение осуществляют в течение 15 мин.

Детектирование и иммуноглобулина, и его комплекса с бактерией осуществляют на выходе из кварцевого капилляра в ультрафиолетовой области с использованием длины волны λ=254 нм.

Общее время анализа с момента получения пробы до выдачи результатов, с учетом осуществления реакции «антиген - антитело», не превышает 50 мин.

Таким образом, предлагаемый способ комплексной иммуноэлектрофоретической идентификации споровых форм бактерий на основе капиллярного электрофореза заключается в выявлении разницы во времени миграции иммуноглобулина специфического и образовавшегося комплекса «бактерия в споровой форме - иммуноглобулин специфический». При этом время миграции иммуноглобулина специфического, используемого в качестве реперной метки, устанавливают заблаговременно для каждой серии и производителя.

Предложенный способ комплексной иммуноэлектрофоретической идентификации споровых форм бактерий на основе капиллярного электрофореза обладает следующими достоинствами:

продолжительность анализа вместе с проведением реакции «антиген - антитело» не более 50 мин;

- детектирование проводится непосредственно в капилляре;

- реакцию «антиген - антитело» проводят непосредственно в виале для капиллярного электрофореза в термостате при температуре 37°С;

- доступное для самостоятельного освоения программное обеспечение;

- относительно низкая стоимость одного анализа (не более 130 руб.).

Способ позволяет провести специфическую идентификацию бактерий в споровой форме в условиях специализированных и полевых лабораторий.

Пример

В лаборатории готовят пробу, содержащую бактерии в споровой форме с концентрацией 10⁴ КОЕ × мл^-1, общим объемом 10 мл. При этом в качестве имитатора используют вакцинный штамм B.anthracis («Вакцина живая против сибирской язвы животных из штамма СТИ»).

В виалу для капиллярного электрофореза микродозатором переносят 0,2 мл пробы. Затем в виалу прикалывают 0,1 мл иммуноглобулина специфического. Полученную пробу термостатируют при 37°С в течение 25 мин. После термостатирования проводят анализ пробы в течение 15 мин.

В качестве средства измерения используют систему высокоэффективного капиллярного электрофореза Agilent 3D СЕ (США). При этом в ходе анализа используют следующие параметры и условия электрофоретического разделения и детектирования:

- температура капилляра - плюс 20±0,1°С;

- напряжение, используемое для разделения, - плюс 20±0,1 кВ;

- введение пробы - гидродинамическое в течение 5 с при давлении 30±0,2 мбар;

- длина волны детектирования - 254 нм;

- время анализа - 15 мин;

- электролит - фосфатный буфер.

Результаты анализа представлены на фигурах 1 и 2. На фигуре 1 представлена электрофореграмма пробы, содержащей иммуноглобулин диагностический сибиреязвенный. На фигуре 2 представлена электрофореграмма пробы, содержащей комплекс штамм СТИ-1 с иммуноглобулином диагностическим сибиреязвенным. Из представленных электрофореграмм в обоих случаях видны пики при одинаковой длине волны детектирования λ=254 нм. Появление пика через 10,52 мин свидетельствует о наличии в пробе чистого иммуноглобулина диагностического. Появление пика через 11,56 мин свидетельствует о наличии в пробе комплекса штамм СТИ-1 с иммуноглобулином диагностическим сибиреязвенным антиспоровым. При этом разница во времени миграции чистого иммуноглобулина и комплекса составляет 64 с.

В ходе статистических расчетов результатов повторных опытов было показано, что разница во времени миграции комплекса и чистого иммуноглобулина данной серии и производителя равна (80±29) с, что вполне достаточно для однозначной идентификации спор B.anthracis. Следует отметить, что идентификация других видов бактерий в споровой форме также представляется возможной при наличии соответствующего специфического иммуноглобулина. При этом для достоверной идентификации необходимо также установить разницу во времени миграции иммуноглобулина специфического и образуемого им комплекса бактерия в споровой форме с иммуноглобулином специфическим.

Литература

1. Патент на изобретение №2265051 от 10.03.2004 г. Уткин Д.В., Девдариани З.Л., Федорова В.А., Дроздов И.Г. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. РKKK (П) 679D - продуцент моноклональных антител, специфичных к белково-полисахаридному антигену Yersinia enterocolitica 03 Е 09 сероваров.

2. Патент на изобретение №2345365 от 29.05.2007 г. Вострикова О.П., Новикова О.Д., Малашенкова В.Г., Гордеец А.В., Соловьева Т.Ф. Способ дифференциальной диагностики иерсиниоза и диагностический набор для его осуществления.

3. Патент на изобретение №2339952 от 29.05.2007 г. Вострикова О.П., Портнягина О.Ю., Малашенкова В.Г., Хоменко В.А., Новикова О.Д., Гордеец А.В., Соловьева Т.Ф. Способ дифференциальной диагностики псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза и диагностический набор для его осуществления.

4. Патент на изобретение №2329305 от 01.03.2002 г. Ротман Р.Э., Янг С., Лин Ш., Елен Г.Д. Количественный анализ, позволяющий одновременно обнаруживать и идентифицировать бактериальные инфекции.

5. Патент на изобретение №2223499 от 12.04.2000 г. Абгарян А.Г., Еременко Е.И., Ефременко В.И, Саркисова Н.В., Жарникова И.В., Афанасьева Е.Н., Жданова Е.В. Способ индикации возбудителя сибирской язвы в объектах окружающей среды.

6. Патент на изобретение №2366715 от 24.03.2008 г. Будченко А.А., Мазурова И.Ю., Илючин В.И. Способ дифференциации возбудителя мелиоидоза и сапа методом иммуноэлектрофореза.

7. Воробьева Н.В. Иммунодиффузия и иммуноэлектрофорез / Теория и практика // Учебное пособие для вузов / Н.В. Воробьева. - М.: Научный мир, 2006.

8. Патент на изобретение №2327978 от 22.07.2006 г. Сидорова А.А., Ганжа О.В. Способ идентификации объекта путем построения его характеристического электрофоретического профиля.

9. Иммуноглобулины [электронный ресурс] - ХиМик.ru http://www.xumuk.ru/ encyklopedia/1664.html>ИММУНОГЛОБУЛИНЫ</а>.

10. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот [текст] /Пособие для студентов биологических факультетов и учащихся специализированных старших классов гимназий / Л.А.Остерман. - М.: МЦНМО, 2002. - 248 с.

Для осуществления способа предварительно устанавливают время миграции рабочего раствора иммуноглобулина специфического для каждой серии и производителя, при этом иммуноглобулин специфический используется в качестве реперной метки (контроль). Далее готовят исследуемую пробу, подозреваемую на наличие споровых бактерий, для проведения реакции антиген-антитело путем добавления рабочего раствора иммуноглобулина специфического в фосфатном буфере к пробе. В ходе реакции образуется комплекс бактерия в споровой форме - иммуноглобулин специфический. Далее проводят капиллярный электрофорез, детектирование в УФ-области спектра, определение времени миграции комплекса в системе капиллярного электрофореза и сравнивают его со временем миграции в системе капиллярного электрофореза иммуноглобулина специфического (контроля). При превышении времени миграции комплекса свыше 50 с по сравнению со временем миграции иммуноглобулина специфического идентифицируют наличие в пробе бактерий в споровой форме. Описываются также условия и параметры проведения анализа. Изобретение позволяет провести специфическую идентификацию бактерий в споровой форме с высокой степенью достоверности. 5 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Способ комплексной иммуноэлектрофоретической идентификации бактерий в споровой форме на основе капиллярного электрофореза, включающий этапы:
а) подготовку рабочего раствора иммуноглобулина специфического, проведение капиллярного электрофореза, детектирование иммуноглобулина в ультрафиолетовой области спектра и определение времени его миграции в системе капиллярного электрофореза (контроль),
б) подготовку пробы, подозреваемой на наличие бактерий в споровой форме, для проведения реакции антиген-антитело с рабочим раствором иммуноглобулина специфического для получения комплекса иммуноглобулин специфический - бактерия в споровой форме, проведение капиллярного электрофореза, детектирование в ультрафиолетовой области спектра и определение времени миграции комплекса в системе капиллярного электрофореза,
в) сравнение времени миграции в системе капиллярного электрофореза иммуноглобулина специфического и комплекса иммуноглобулин специфический - бактерия в споровой форме и при превышении времени миграции комплекса свыше 50 с по сравнению со временем миграции иммуноглобулина специфического идентифицируют наличие в пробе бактерий в споровой форме.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что пробоподготовка иммуноглобулина специфического включает его разведение 0,5 см³ кипяченой дистиллированной водой и приготовление рабочего раствора.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед электрофоретическим разделением готовят рабочий раствор иммуноглобулина путем добавления в пробирку поочередно разведенного иммуноглобулина и фосфатно-солевого буфера в объемах, указанных в инструкции к иммуноглобулину, полученный рабочий раствор перемешивают в течение 3 мин.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что электрофоретическое разделение проводят непосредственно в капилляре с внутренним диаметром 75 мкм.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что для электрофоретического разделения используют фосфатный буфер, а также применяют следующие условия и параметры разделения:
- температура капилляра, равная плюс 20±0,1°С;
- напряжение, используемое для разделения, равное плюс 20±0,1 кВ;
- способ введения пробы - гидродинамический в течение 5 с при давлении 30±0,2 мБар;
- время анализа - 15 мин.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что детектирование в ультрафиолетовой области спектра проводят при длине волны 254 нм.