АССОЦИИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ЭНЗООТИЧЕСКОГО ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА СВИНЕЙ И БОЛЕЗНИ АУЕСКИ Российский патент 2009 года по МПК A61K39/295 C12N7/00 A61P31/12 

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к производству и применению биологических препаратов для одновременной специфической профилактики энзоотического энцефаломиелита свиней (болезни Тешена) и болезни Ауески.

В настоящее время в ветеринарной практике широко используются моновакцины из инактивированного вируса болезни Ауески («Вирусные болезни сельскохозяйственных животных. Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции». Владимир, 1995, с.146). Такие вакцины готовят из концентратов вирусного сырья, что значительно усложняет технологию приготовления вакцин и увеличивает их стоимость. Имеется инактивированная вакцина против болезни Ауески («Материалы Международной научно-практической конференции». Покров, 2001, с.155). При их изготовлении использовали производственный вирулентный штамм УНИЭВ-18в вируса болезни Ауески, который выращивали в суспензионной культуре клеток почки сирийского хомячка (ВНК 21/_2-17), инактивировали и аминоэтиленимином и добавляли масляный адъювант.

Использование вирулентного штамма в производстве требует строгого соблюдения правил ветеринарно-санитарной безопасности персоналом при изготовлении вакцины. Аминоэтиленимин является веществом, обладающим токсическими свойствами и представляющим определенную опасность для здоровья людей, поэтому работа с этим инактивантом требует наличия специальных технических и индивидуальных средств защиты и соблюдения особой осторожности.

Вакцинопрофилактика болезни Тешена обеспечивается инактивированными вакцинами (А.И.Козин, А.А.Коломыцев, Д.А.Васильев. Болезнь Тешена, Ульяновск, 2002, 22 с.).

Известна инактивированная вакцина против болезни Тешена (Способ получения вакцины против энзоотического энцефаломиелита свиней (болезни Тешена, свидетельство №707327, 1979 г., Сергеев В.А., Коломыцев А.А., Жестерев В.И.). Вакцина содержит инактивированный 0,06-0,08% формальдегидом вирус, выращенный в однослойной культуре клеток почки поросенка и масляный адъювант.

Существующие вакцины используют в вакцинопрофилактике независимо друг от друга и их применение не может создать одновременно иммунитет против болезней Ауески и Тешена. Кроме того, вакцинацию проводят последовательно (Ауески - дважды. Тешена - однократно), что требует между каждыми прививками временных промежутков по 10-14 суток между ними.

Использование этих вакцин в отдельности связано с увеличением трудозатрат и оказывает дополнительное стрессовое воздействие на организм животных. Учитывая наличие на территории Российской Федерации неблагополучных зон, где регистрируются как болезнь Тешена, так и болезнь Ауески, трудность их ранней клинической дифференциальной диагностики, а также множеством проводимых прививок поросят в раннем возрасте, не всегда укладывающихся в предлагаемые схемы вакцинации.

Целью настоящего изобретения является создание ассоциированной инактивированной вакцины против энзоотического энцефаломиелита свиней и болезни Ауески, обладающей высокой иммуногенностью, ареактогенностью, безвредностью и стабильностью при хранении.

Указанная цель достигается тем, что ассоциированная вакцина содержит культуральное вируссодержащее сырье эпизоотического изолята вируса болезни Тешена (ВБТ) с исходной биологической активностью 10^7,5-10^9,0 lg ТЦД₅₀/см³ и культуральное вируссодержащее сырье вакцинного штамма вируса болезни Ауески (ВБА) - 10^7,0-10^8,0 lg ТЦД₅₀/см³, инактивированное теотропином, и масляный адьювант при следующем содержании этих компонентов в вакцине, мас.%:

Культуральное инактивированное сырье вакцинного штамма вируса болезни Ауески23-27Культуральное инактивированное сырье эпизоотического изолята вируса болезни Тешена23-27Теотропин0,03-0,05Масляный адъювантостальное

Для приготовления предлагаемой вакцины используют вакцинные штаммы МК-25, БУК-622, БУК-900 вируса болезни Ауески. Все штаммы хорошо размножаются в перевиваемых культурах клеток ПСКГ-60 (в монослое и суспензии) и накапливаются через 48-72 часа в титрах 7,5-8,5 lg ТЦД₅₀/см³.

Ассоциированная инактивированная вакцина против энзоотического энцефаломиелита свиней и болезни Ауески создает иммунитет после однократной прививки животных на 21 сутки одновременно против болезней Тешена и Ауески длительностью не менее 6 месяцев (срок наблюдения). По иммуногенности и безвредности ассоциированная вакцина не уступает моновакцинам, применяемым при этих болезнях, и стабильна при хранении (табл.1)

Таблица 1Сравнительная характеристика индукции ВН-антител в сыворотках крови животных, привитых моно- и ассоциированной вакцинамиВакцинаИнактивантдоза введения (см³)кратность введенияТитр (log₂) ВН - антителВБАВБТмоновакцина против ВБТформальдегид2однократно 5-8моновакцина против ВБАаминоэтиленимин2двукратно7 ассоциированная ВБТ+ВБАтеотропин2однократно6-87-82двукратно7-88-8,5

Приводим примеры, содержащие компоненты в конкретных соотношениях на 100 л вакцины.

Пример №1.

Получение инактивированного культурального вируссодержащего сырья эпизоотического изолята вируса болезни Тешена

Эпизоотический изолят вируса болезни Тешена выделяют из поступившего патматериала от больных и павших животных во время вспышки заболевания, из которого приготовляют 10% суспензию. Этой суспензией заражают элективную клеточную культуру ПСГК-60 и культивируют при 37°С до 6 суток или до проявления цитопатического действия.

Затем инфицированную культуру клеток замораживают-оттаивают и делают следующий пассаж. После 2-3х пассажей в культуре клеток определяют инфекционную активность, паспортизируют и хранят при -40°С. Для получения культурального вируссодержащего сырья готовят 2-суточную культуру клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-60 в роллерных бутылях заражают выделенным эпизоотическим изолятом вируса болезни Тешена с множественностью 0,01 ТЦД₅₀/клетка и инкубируют при 37°С в течение 72 часов до проявления полного цитопатического действия вируса. Затем содержимое бутылей объединяют, определяют инфекционность титрованием в культуре клеток, затем к вируссодержащей культуральной суспензии с исходной активностью не менее 10^7,5 lg ТЦД₅₀/см³ вносят теотропин, растворяют его путем тщательного перемешивания и инкубируют при 37°С 48 ч.

Получение инактивированного культурального вируссодержащего сырья вакцинного штамма вируса болезни Ауески

2-суточную культуру клеток ПСГК-60 в роллерных бутылях заражают вакцинным штаммом МК-25 вируса болезни Ауески с множественностью 0,01 ТЦД₅₀/клетка и инкубируют при 37°С в течение 72 часов до проявления полного цитопатического действия вируса. Затем содержимое бутылей объединяют, определяют инфекционность титрованием в культуре клеток, затем к вируссодержащей культуральной суспензии с исходной активностью не менее 10^7,0 lg ТЦД₅₀/см³ вносят теотропин, растворяют его путем тщательного перемешивания и инкубируют при 37°С 48 ч.

Полученное таким образом культуральное вируссодержащее сырье эпизоотического изолята вируса болезни Тешена (ВБТ) с исходной биологической активностью 10^7,0-10^9,0 lg ТЦД₅₀/см³ смешивают (мас.%) с культуральным вируссодержащим сырьем вакцинного штамма вируса болезни Ауески (ВБА) - 10^7,0-10^8,0 lg ТЦД₅₀/см³, инактивируют теотропином, добавляют масляный адъювант - остальное, тщательно перемешивают и получают вакцину при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Культуральное вируссодержащее сырье вакцинного штамма вируса болезни Ауески25,00Культуральное инактивированное сырье эпизоотического изолята вируса болезни Тешена25,00Теотропин0,04Масляный адъювантостальное

Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета.

Вакцину проверяют на безвредность, иммуногенность. Серонегативных подсвинков белой породы массой 25-30 кг прививают ассоциированной вакциной против БА и БТ внутримышечно в дозе 2 см³ две свиньи однократно и две - двукратно.

Сыворотки, взятые перед прививкой и в разные сроки после вакцинации, исследуют на наличие вируснейтрализующих антител к вирусам БА и БТ в реакции нейтрализации в культуре клеток ПСГК - 60. Реакцию ставят с постоянной дозой вируса, равной 1000 ТЦД₅₀.

Титр ВН-антител в сыворотках крови против ВБА на 21 сутки составляет 6 log₂ и 8,5 log₂ - против ВБТ, после 2-ой иммунизации на 21 сутки 7,8 log₂ против ВБА и 8,3 log₂ против ВБТ.

Пример №2.

Получение инактивированного культурального вируссодержащего сырья эпизоотического изолята вируса болезни Тешена

Эпизоотический изолят вируса болезни Тешена выделяют из поступившего патматериала от больных и павших животных во время вспышки заболевания, из которого приготовляют 10% суспензию. Этой суспензией заражают элективную клеточную культуру ПСГК-60 и культивируют при 37°С до 6 суток или до проявления цитопатического действия.

Затем инфицированную культуру клеток замораживают-оттаивают и делают следующий пассаж. После 2-3х пассажей в культуре клеток определяют инфекционную активность, паспортизируют и хранят при -40°С. Для получения культурального вируссодержащего сырья готовят 2-суточную культуру клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-60 в роллерных бутылях заражают выделенным эпизоотическим изолятом вируса болезни Тешена с множественностью 0,01 ТЦД₅₀/клетка и инкубируют при 37°С в течение 72 часов до проявления полного цитопатического действия вируса. Затем содержимое бутылей объединяют, определяют инфекционность титрованием в культуре клеток, затем к вируссодержащей культуральной суспензии с исходной активностью не менее 10^7,5 lg ТЦД₅₀/см³ вносят теотропин, растворяют его путем тщательного перемешивания и инкубируют при 37°С 48 ч.

Получение инактивированного культурального вируссодержащего сырья вакцинного штамма вируса болезни Ауески

2-суточную культуру клеток ПСГК-60 в роллерных бутылях заражают вакцинным штаммом БУК-622 вируса болезни Ауески с множественностью 0,02 ТЦД₅₀/клетка и инкубируют при 37°С в течение 48 часов до проявления полного цитопатического действия вируса. Затем содержимое бутылей объединяют, определяют инфекционность титрованием в культуре клеток, затем к вируссодержащей культуральной суспензии с исходной активностью не менее 10^7,0 lg ТЦД₅₀/см³, вносят теотропин, растворяют его путем тщательного перемешивания и инкубируют при 37°С 48 ч.

Полученное таким образом культуральное вируссодержащее сырье эпизоотического изолята вируса болезни Тешена (ВБТ) с исходной биологической активностью 10^7,5-10^9,0 lg ТЦД₅₀/см³ смешивают (мас.%) с культуральным вируссодержащим сырьем вакцинного штамма вируса болезни Ауески (ВБА) - 10^7,0-10^8,0 lg ТЦД₅₀/см³ инактивируют теотропином, добавляют масляный адъювант - остальное, тщательно перемешивают и получают вакцину при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Культуральное вируссодержащее сырье вакцинного штамма вируса болезни Ауески27,00Культуральное инактивированное сырье эпизоотического изолята вируса болезни Тешена27,00Теотропин0,05Масляный адъювантостальное

Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета.

Вакцину проверяют на безвредность, иммуногенность.

Серонегативных подсвинков белой породы массой 25-30 кг прививают ассоциированной вакциной против БА и БТ внутримышечно в дозе 2 см³ две свиньи однократно и две - двукратно.

Сыворотки, взятые перед прививкой и в разные сроки после вакцинации, исследуют на наличие вируснейтрализующих антител к вирусам БА и БТ в реакции нейтрализации в культуре клеток ПСГК - 60. Реакцию ставят с постоянной дозой вируса, равной 1000 ТЦД₅₀.

Титр ВН-антител в сыворотках крови против ВБА на 21 сутки составляет 6,5 log₂ и 8,0 log₂ - против ВБТ, после 2-ой иммунизации на 21 сутки 7,5 log₂ против ВБА и 8,5 log₂ против ВБТ.

Пример №3.

Получение инактивированного культурального вируссодержащего сырья эпизоотического изолята вируса болезни Тешена

Эпизоотический изолят вируса болезни Тешена выделяют из поступившего патматериала от больных и павших животных во время вспышки заболевания, из которого приготовляют 10% суспензию. Этой суспензией заражают элективную клеточную культуру ПСГК-60 и культивируют при 37°С до 6 суток или до проявления цитопатического действия.

Затем инфицированную культуру клеток замораживают-оттаивают и делают следующий пассаж. После 2-3х пассажей в культуре клеток определяют инфекционную активность, паспортизируют и хранят при -40°С. Для получения культурального вируссодержащего сырья готовят 2-суточную культуру клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-60 в роллерных бутылях заражают выделенным эпизоотическим изолятом вируса болезни Тешена с множественностью 0,01 ТЦД₅₀/клетка и инкубируют при 37°С в течение 72 часов до проявления полного цитопатического действия вируса. Затем содержимое бутылей объединяют, определяют инфекционность титрованием в культуре клеток, затем к вируссодержащей культуральной суспензии с исходной активностью не менее 10^7,5 lg ТЦД₅₀/см³, вносят теотропин, растворяют его путем тщательного перемешивания и инкубируют при 37°С 48 ч.

Получение инактивированного культурального вируссодержащего сырья вакцинного штамма вируса болезни Ауески

2-суточную культуру клеток ПСГК-60 в роллерных бутылях заражают вакцинным штаммом БУК-900 вируса болезни Ауески с множественностью 0,01 ТЦД₅₀/клетка и инкубируют при 37°С в течение 72 часов до проявления полного цитопатического действия вируса. Затем содержимое бутылей объединяют, определяют инфекционность титрованием в культуре клеток, затем к вируссодержащей культуральной суспензии с исходной активностью не менее 10^7,0 lg ТЦД₅₀/см³, вносят теотропин, растворяют его путем тщательного перемешивания и инкубируют при 37°С 48 ч.

Полученное таким образом культуральное вируссодержащее сырье эпизоотического изолята вируса болезни Тешена (ВБТ) с исходной биологической активностью 10^7,0-10^9,0 lg ТЦД₅₀/см³ смешивают (мас.%) с культуральным вируссодержащим сырьем вакцинного штамма вируса болезни Ауески (ВБА) - 10^7,0-10^8,0 lg ТЦД₅₀/см³, инактивируют теотропином, добавляют масляный адъювант - остальное, тщательно перемешивают и получают вакцину при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Культуральное вируссодержащее сырье вакцинного штамма вируса болезни Ауески23,00Культуральное инактивированное сырье эпизоотического изолята вируса болезни Тешена23,00Теотропин0,03Масляный адъювантостальное

Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета.

Вакцину проверяют на безвредность, иммуногенность. Серонегативных подсвинков белой породы массой 25-30 кг прививают ассоциированной вакциной против БА и БТ внутримышечно в дозе 2 см две свиньи однократно и две - двукратно.

Сыворотки, взятые перед прививкой и в разные сроки после вакцинации, исследуют на наличие вируснейтрализующих антител к вирусам БА и БТ в реакции нейтрализации в культуре клеток ПСГК - 60. Реакцию ставят с постоянной дозой вируса, равной 1000 ТЦД₅₀.

Титр ВН-антител в сыворотках крови против ВБА на 21 сутки составляет 6,0 log₂ и 8,0 log₂ - против ВБТ, после 2-ой иммунизации на 21 сутки 7,0 log₂ против ВБА и 8,3 log₂ против ВБТ.

Пример 4.

Сохраняемость ассоциированной вакцины при температуре 4-8°С (табл.2). Как видно из таблицы, при рекомендуемой температуре хранения (4-8°С) вакцина индуцирует тот же уровень ВН-антител в крови привитых подсвинков, т.е. остается иммуногенной.

Таблица 2Антигенная характеристика ассоциированной инактивированной вакцины в процессе хранения при 4-8°СДлительность хранения вакцины (мес.)Титр ВН-антител (log₂)Против ВБАПротив ВБТисходная7,08,06 мес7,57,512 мес7,07,0

Вакцина иммуногенна через 12 месяцев хранения при 4-8°С (срок наблюдения).

Изобретение относится к области биотехнологии. Ассоциированная вакцина содержит инактивированное теотропином культуральное вируссодержащее сырье эпизоотического изолята вируса энзоотического энцефаломиелита свиней (болезни Тешена) с исходной биологической активностью 10^7,5-10^9,0 lg ТЦД₅₀/см³ и инактивированное теотропином культуральное вируссодержащее сырье вакцинного штамма вируса болезни Ауески с исходной биологической активностью 10^7,0-10^8,0 lg ТЦД₅₀/см³, а также масляный адьювант при следующем содержании компонентов, мас.%: инактивированное теотропином культуральное вируссодержащее сырье эпизоотического изолята вируса энзоотического энцефаломиелита свиней (болезни Тешена) - 23-27, инактивированное теотропином культуральное вируссодержащее сырье вакцинного штамма вируса болезни Ауески - 23 -27, теотропин - 0,03-0,05, масляный адьювант - остальное. Вакцина характеризуется высокой иммуногенностью, ареактогенностью, безвредностью и стабильностью при хранении. 2 табл.

Ассоциированная вакцина против энзоотического энцефаломиелита свиней (болезни Тешена) и болезни Ауески, отличающаяся тем, что она содержит инактивированное теотропином культуральное вируссодержащее сырье эпизоотического изолята вируса энзоотического энцефаломиелита свиней (болезни Тешена) с исходной биологической активностью 10^7,5-10^9,0 lg ТЦД₅₀/см³ и инактивированное теотропином культуральное вируссодержащее сырье вакцинного штамма вируса болезни Ауески с исходной биологической активностью 10^7,0-10^8,0 lg ТЦД₅₀/см³, а также масляный адьювант при следующем содержании компонентов, мас.%:

инактивированное теотропином культуральное вируссодержащее сырье эпизоотического изолята вируса энзоотического энцефаломиелита свиней (болезни Тешена)23-27инактивированное теотропином культуральное вируссодержащее сырье вакцинного штамма вируса болезни Ауески23-27теотропин0,03-0,05масляный адьювантостальное