БИВАЛЕНТНАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ БОЛЕЗНИ ТЕШЕНА Российский патент 2003 года по МПК A61K39/235 C12N7/00 C12N7/00 C12R1/93 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к средствам профилактики болезни Тешена.

Для профилактики болезни Тешена используют живые и инактивированные вакцины. Живую вакцину готовят из культурального штамма "Перечинский-346", не обладающего патогенностью для свиней и индуцирующего антитела к энтеровирусам свиней (Романенко В.В., Сорока В.И., Прус О.Г. Иммуногенность вирусвакцины против болезни Тешена. Ветеринария, 1991, 7, 27-28). Однако в современных эпизоотических условиях она не эффективна из-за иммунологического несоответствия эпизоотическим вариантам возбудителя.

Инактивированные препараты готовят из тканей центральной нервной системы зараженных свиней (Klobouk A. Encephalomyelitis enzootica suum. Immunisation active. (Чех. ) Zverolek. Rozpavy, 1935, 9; 73, 85, 217), либо с использованием культуральной вирусной суспензии с добавлением гидроокиси алюминия или масляного адъюванта (Дудников Л.А., Сергеев О.В., Алипер Т.И., Непоклонов Е.А., Сергеев В.А. Антигенная активность инактивированного препарата болезни Тешена на свиньях в зависимости от адъюванта. Вирусные болезни с.-х. животных. Владимир, 1995. - 152; Bourden P., Serres H. Vaccination centre la maladie de Teschen avec le virus de culture. Anticorps et immunite. - Ann. Inst. Pasteur, 1959, 97, 4, 583-589). Иммуногенность этих вакцин в современных условиях является недостаточной, поэтому вакцинопрофилактика на их основе не вполне эффективна, в том числе в ряде регионов бывшего СССР.

Известна вакцина против болезни Тешена инактивированная культуральная эмульгированная (Рыбалкин П. В., Жестерев В.И. Пути повышения запаса иммуногенности, снижения реактогенности и вязкости эмульгированной вакцины против болезни Тешена. Тез. докл. Всесоюзн. научной конференции "Разработка, апробация и государственный контроль ветеринарных препаратов", М.- 1981.-71). При ее производстве используют культуральный штамм "Закарпатский" возбудителя болезни, выращенный в однослойной культуре первично-трипсинизированных клеток почки поросенка или в перевиваемых культурах клеток почки поросенка (ПП). Вируссодержащую культуральную суспензию с исходной активностью не ниже 10^7,0 ТЦД₅₀/мл инактивируют формальдегидом при 28^oС в течение 8 сут и затем смешивают в равных объемах (1:1) с масляным адъювантом (80% масла +20% эмульгатора). Конечный препарат представляет собой эмульсию типа "вода в масле" с кинематической вязкостью 250-400 сП, что зависит от используемого минерального масла (вакцинное, вазелиновое, парфюмерное) и жирового эмульгатора (ланолин).

Однако известный вакцинный препарат, который может служить прототипом предполагаемого изобретения, обладает рядом недостатков.

Штамм "Закарпатский" выделен в Закарпатской области Украинской ССР во время эпизоотии болезни Тешена 1969-1972 гг. На территории России болезнь Тешена впервые зарегистрирована в 1994 г. По нашим данным, выделенный на территории Брянской области штамм "Навля-96" возбудителя болезни Тешена отличается по антигенным и иммуногенным свойствам от штамма "Закарпатский". Специфические сыворотки в реакции нейтрализации с гомологичными штаммами были в 8-128 раз активнее, чем с гетерологичными (Бузун А.И., Жестерев В.И. О роли внутритиповых различий возбудителя для вакцинопрофилактики болезни Тешена свиней. Труды Международной конференции к 40-летию Всероссийского НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии, 1998. - 220-222; А.Д. Середа, B.C. Кропотов, Н.Г. Шубина, А.И. Бузун, В.В. Кадетов, М.В. Колосова, В.И. Жестерев, Ю. Ф. Калантаенко. Антигенные различия производственных штаммов вируса болезни Тешена. Сборник статей международной научно-практической конференции, посвященной 75-летию И.А. Бакулова, г. Покров, 2000 г., 235). Иммунологически вакцина из штамма "Закарпатский" эффективна в Брянской области только при использовании ее в повышенной дозировке (2 - 3-кpaтнoй), либо при 2 - 3-кратном применении (с интервалом 1-2 месяца).

В составе прототипного препарата в качестве инактиванта применяется формалин, требующий воздействия на вирус не менее 8 сут. Кроме того, применение формалина требует обязательной нейтрализации остаточного количества формальдегида как иммунодепресанта гипосульфитом натрия для остановки его действия. Поэтому в прописи прототипной вакцины как баластное вещество присутствует и этот компонент.

Вследствие применения в прототипе ланолина в качестве эмульгатора целевой продукт характеризуется высокой кинематической вязкостью: до 400 сП. Данное обстоятельство существенно затрудняет фасовку и особенно применение препарата, поскольку в зимних условиях его необходимо прогревать (Вакцина против болезни Тешена инактивированная культуральная эмульгированная, ТУ 9384-020-00008064-96).

Целью предлагаемого изобретения является создание бивалентного вакцинного препарата против болезни Тешена, обеспечивающего иммунологическую защиту привитых животных против обоих серологических подтипов возбудителя, которые в настоящее время циркулируют в нозоареале. Дополнительной целью является также совершенствование технологических параметров целевого продукта (сокращение срока технологического процесса изготовления и снижение кинематической вязкости).

Указанная цель достигается тем, что в состав вакцины вводят два антигенно различающиеся штамма вируса болезни Тешена - "Закарпатский" и "Навля-96", которые циркулируют в современном нозоареле, инактиватор теотропин (ТУ 9336-02-0000864-98), и эмульгатор для вакцин 139 (ТУ 6-02-011-1213942-99).

Штамм "Навля-96" выделен в культуре перевиваемых клеток почки свиньи (СПЭВ) из головного мозга подсвинка, проявлявшего признаки нейроинфекции и принадлежащего ОПХ одного из учреждений на территории Брянской области. Вирус вызывает ЦПД, характерное для энтеровирусов свиней 1-го типа, в культурах клеток почки свиньи (первичных и перевиваемых) и сибирского горного козерога (ПСГК), перевиваемых клеток тестикул поросенка (ПТП), накапливаясь в титрах 3,0-8,0 lg ТЦД_50/мл при культивировании в стационарных условиях и роллерном культивировании при 37^oС. Штамм "Навля-96" размножается в организме морских свинок, не вызывая у них заболевания, и контактно передается от них свиньям, вызывая у них типичную клиническую форму болезни Тешена.

Существенным признаком изобретения является использование в качестве исходных компонентов вирусного сырья двух штаммов вируса болезни Тешена - "Навля-96" и "Закарпатский". Сырье нарабатывается в пермиссивных культуральных системах, инактивируется и смешивается в соотношениях 0,5:1, 1:1 или 2:1 перед компоновкой вакцины. Применение других изолятов и штаммов не улучшает качества препарата, поскольку заявляемые компоненты вакцины перекрывают их антигенный спектр в достаточной для иммунопрофилактики болезни Тешена степени. Применение указанных штаммов в моновакцинах против болезни Тешена требует проведения дополнительных исследований по типированию возбудителя, циркулирующего в очаге, поэтому менее эффективно в экономическом плане.

Вторым отличительным признаком изобретения является присутствие в его составе инактиванта теотропина, который по химическому составу близок к уротропину и в отличие от формалина и других баластных компонентов прототипной вакцины не является иммунодепрессантом и быстро выводится из организма свиньи. С другой стороны, теотропин в отличие от формалина "нарезает" вирусные белки на отдельные антигены и таким образом дополнительно повышает иммуногенность вируссодержащего компонента заявляемой вакцины. Наконец, применение теотропина позволяет сократить время инактивации сырья при производстве вакцины с 8 до 2 сут и избавиться от введения в рецептуру веществ для нейтрализации свободного инактиватора, так как последний используется в конечной концентрации (0,06-0,08)% и практически полностью связывается с вируссодержащим сырьем. Меньшее количество теотропина не инактивирует вирус, а большее не приводит к улучшению качества препарата.

Третьим существенным отличительным признаком изобретения является применение в составе адъюванта эмульгатора 139 отечественного производства (ТУ 6-02-011-1213942-99). Объем эмульгатора в адъюванте составляет 2,0-7,5%. Адъювант смешивается с инактивированным вируссодержащим сырьем в соотношении от 3:1 до 1:1. Кинематическая вязкость полученной вакцины при соотношении 3: 1 составляет 6-15 сП, при 2:1-18-22 сП, при 1:1-56-96 сП. Уменьшение количественного содержания эмульгатора (<2%) в адъюванте приводит к неустойчивости получаемой эмульсии, а увеличение (>7,5%) к повышению вязкости вакцины (108-250 сП). Соотношение адъюванта и антигенсодержащего сырья является оптимальным, поскольку применение адъюванта в более высокой или более низкой концентрациях в конечном продукте за рамками заявляемых значений по отношению к антигенсодержащему сырью приводит либо к ухудшению иммуногенности вакцины, либо делает невозможным получение эмульсии типа "вода-в-масле". Защищаемые параметры, с одной стороны, улучшают технологические возможности производства вакцины при использовании автоматических систем ее разлива, с другой стороны - потребительские требования, так как вакцина легко инъецируется животным без предварительного прогревания даже в зимних условиях.

Таким образом, положительный эффект достигается при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Суспензия инактивированного вируса "Закарпатский" - 12,5 - 35,0
Суспензия инактивированного вируса "Навля-96" - 12,5 - 35,0
Теотропин - 0,06 - 0,08
Масло вакцинное синтетическое (типа Marcol 52 или МЦ) - 33,3 - 50,0
Эмульгатор 139 (ТУ 6-02-011-1213942-99) - 0,5 - 4,0
Пример 1
2-суточную культуру клеток ПТП в 60 клинских матрасах заражают вирусом болезни Тешена штамма "Навля-96" с множественностью 0,1 ТЦД₅₀/клетка и инкубируют при 37^oС в течение 72-96 ч до проявления полного цитопатического действия вируса. Затем содержимое матрасов замораживают при минус 20^oС. После размораживания содержимое матрасов сливают в 10- литровые бутыли, определяют инфекционность титрованием в культуре клеток, затем к 10 л вируссодержащей культуральной суспензии с исходной активностью не менее 10^7,0 ТЦД₅₀/мл вносят 6 г теотропина, растворяют его путем тщательного перемешивания и инкубируют при 37^oС 48 ч.

Аналогично готовят инактивированный вирус болезни Тешена штамма "Закарпатский".

Смешивают в стерильном реакторе по 10 л инактивированной по инфекционности вируссодержащей суспензии штаммов "Навля-96" и "Закарпатский", добавляют стерилизованный автоклавированием в течение 1 ч при 1,5 атм адъювант, состоящий из 38 л масла МЦ и 2 л эмульгатора 139. Перемешивают 24 ч при 200 об/мин, сливают из реактора и фасуют по 1-10 доз.

Серологическое исследование проб сывороток крови свиней, иммунизированных однократно, показывает наличие вируснейтрализующих антител в титрах 1: 32-1: 256 через 2 месяца после вакцинации, тогда как титры предиммунных проб сывороток крови не превышают 1:4.

Пример 2
2-суточную культуру клеток в 90 клинских матрасах заражают вирусом болезни Тешена штамм "Навля-96" с множественностью 0,1 ТЦД₅₀/клетка и инкубируют при 37^oС в течение 72-96 ч до проявления полного цитопатического действия вируса. Затем содержимое матрасов замораживают при минус 20^oС. После размораживания содержимое матрасов сливают в 10-литровые бутыли, определяют инфекционность титрованием в культуре клеток, затем в вируссодержащую культуральную суспензию с исходной активностью не менее 10^7,0 ТЦД₅₀/мл вносят 8 г теотропина и инкубируют при 37^oС 48 ч.

Аналогично готовят инактивированный вирус болезни Тешена штамма "Закарпатский", используя 45 клинских матрацев.

Смешивают в стерильном реакторе 15 литров инактивированной по инфекционности вируссодержащей суспензии штамма "Навля-96" и 7,5 л - штамма "Закарпатский", добавляют стерильный адъювант, состоящий из 22 л масла Marcoll 52 и 0,5 л эмульгатора 139. Перемешивают 24 ч при 200 об/мин, сливают из реактора и фасуют по 1-10 доз.

Полученная вакцина представляет собой эмульсию белого цвета (иногда с розовым оттенком) типа "вода в масле" с вязкостью 6-96 сП, которая не расслаивается при центрифугировании при 3000 x g в течение 15-20 мин, а также при хранении в течение года при 6-10^oС. Иммуногенность препарата и напряженность иммунитета соответствуют требованиям, изложенных в действующих наставлениях к вакцине против болезни Тешена.

Полученные в результате проведенных лабораторных и клинических испытаний данные свидетельствуют о том, что вакцина заявляемого состава позволяет при применении 1 раз в год достичь 100% защиты привитого свинопоголовья в течение всего цикла выращивания. Эффективность использования предлагаемого вакцинного препарата подтверждена производственными испытаниями.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии. Вакцина состоит из двух циркулирующих в России и ближнем зарубежье антигенно различных штаммов - "Закарпатского" и "Навля-96". Кроме того, вакцина содержит теотропин в конечной концентрации 0,06-0,08%, который эффективно инактивирует вирус, не влияя на его иммуногенные свойства. Для снижения вязкости вакцины в ее состав введен вакцинный эмульгатор 139 в конечной концентрации 0,5-4%. Вакцина удобна в применении, стабильна при хранении, позволяет достичь 100% защиты привитого свинопоголовья в течение всего цикла выращивания.

Инактивированная вакцина против болезни Тешена, включающая инактивированную по инфекционности вируссодержащую суспензию, смешанную с масляным адъювантом, отличающаяся тем, что она содержит два антигенно различающихся штамма "Закарпатский" и "Навля-96", теотропин и адъювант, состоящий из синтетического масла и эмульгатора 139, в следующих соотношениях, мас. %:
Суспензия инактивированного вируса "Закарпатский" - 12,5 - 35,0
Суспензия инактивированного вируса "Навля-96" - 2,5 - 35,0
Теотропин - 0,06 - 0,08
Масло вакцинное синтетическое (типа Marcol 52 или МЦ) - 33,3 - 50,0
Эмульгатор 139 (ТУ 6-02-011-1213942-99) - 0,5 - 4,0