ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI ДЛЯ ТЕСТИРОВАНИЯ ПРИСУТСТВИЯ В СРЕДЕ ФЕНОЛА И ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА Российский патент 2009 года по МПК C12N1/21 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии, белковой и генной инженерии, конкретно - к получению геносенсоров, и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК pDps-gfp, содержащую под контролем промотора гена dps Escherichia coli ген, кодирующий мутантную форму флюоресцентного белка green fluorescent protein (GFPaav), что обеспечивает в клетках Escherichia coli JM109 синтез флюоресцентного белка GFPaav в присутствии токсических для клетки агентов; а также рекомбинантный штамм Escherichia coli JM109 [pDps] - продуцент флюоресцентного белка GFPaav в присутствии токсических, повреждающих клетку агентов, приводящих к активации промотора гена dps, в частности, перекиси водорода или фенола.

Современная экологическая обстановка диктует необходимость тестирования чистоты воды, воздуха и пищевых продуктов, что требует создания новых высокоэффективных и чувствительных методов, которые бы в отсутствие знаний о природе токсического для организма человека вещества, выявляли его присутствие в различных средах. Разработка бактериальных биосенсоров предоставила такую возможность [1]. В основе биосенсора лежит способность клетки отвечать на токсическое воздействие активацией своих защитных систем. Каскады генов активируются в клетке в присутствии агентов, повреждающих структуру и функции клетки [2, 3]. Промоторы таких генов и являются чувствительным звеном геносенсорной конструкции. Они связаны с репортерным геном, появление продукта которого свидетельствует об активации системы. В качестве репортерных генов используют гены, кодирующие флюоресцентные или люминесцентные белки, которые легко детектируются [4]. К настоящему времени разработан ряд достаточно эффективных геносенсорных конструкций на основе промоторов генов, являющихся ключевыми регуляторами стрессорных ответов или основными эффекторами ответа на стресс. Однако все имеющиеся геносенсорные конструкции способны выявлять лишь какую-то одну группу токсических факторов - в основном это сенсоры окислительного стресса [5, 6], агентов, повреждающих ДИК [6, 7], белки или мембраны [6, 8], а также сенсоры, регистрирующие присутствие тяжелых металлов [9, 10]. Геносенсоров-прототипов, которые бы в отсутствие знаний о природе повреждающего вещества тестировали его присутствие в различных средах, нами обнаружено не было.

Технической задачей изобретения является получение рекомбинантной плазмидной ДНК pDps-gfp, кодирующей флюоресцентный белок GFPvaa и штамма - продуцента флюоресцентного белка GFPvaa с использованием штамма Escherichia coli.

Поставленная задача решается

- конструированием на основе промотора гена dps Escherichia coli, плазмидной ДНК pDps-gfp, содержащей под контролем этого промотора ген, кодирующий флюоресцентный белок green fluorescent protein (GFPvaa);

- получением путем трансформации сконструированной рекомбинантной плазмидной ДНК pDps-gfp штамма бактерий Escherichia coli, способного повышать уровень продукции флюоресцентного белка GFPvaa в присутствии токсических факторов различной природы. Регистрация повышения флюоресценции клеток полученного штамма свидетельствует о присутствии токсических агентов в среде.

С помощью базы данных GenSensor [11], обнаружен ген dps Escherichia coli, экспрессия которого существенно увеличивается в случае голодания и осмотического стресса [12, 13], в присутствии кислот [3], агентов, повреждающих ДНК [14], антибактериальных препаратов [15], в стационарной фазе роста [16, 17] и пр. [18]. Использование промотора такого гена в сенсорных конструкциях обеспечивает создание полифункционального геносенсора, уровень активации которого будет отражать степень метаболического неблагополучия клетки. Информации о существовании геносенсоров на основе промотора гена dps Escherichia coli обнаружено не было.

На основе последовательности промотора гена dps конструируют плазмиду pDps-gfp, содержащую под контролем этого промотора ген gfp, кодирующий флюоресцентный белок green fluorescent protein (GFPvaa) с укороченным временем полужизни [19]. Для этого в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием олигонуклеотидных праймеров:

а также ДНК Escherichia coli HB101 в качестве матрицы синтезируют фрагмент, содержащий промоторный район гена dps. Затем обработкой ДНК плазмиды pZE21 [20] эндонуклеазами рестрикции Kpnl и HindIII получают ДНК-фрагмент, кодирующий флюоресцентный белок GFPvaa. Этот фрагмент ДНК объединяют в реакции лигирования с векторной плазмидой pRS2 [21], гидролизованной эндонуклеазами Kpnl и HindIII. Полученный таким образом промежуточный вектор гидролизуют эндонуклеазами ApaI и SphI и объединяют в реакции лигирования с обработанным теми же эндонуклеазами ПЦР-фрагментом, содержащим промотор гена dps. Сконструированную таким образом плазмидную ДНК обрабатывают эндонуклеазой рестрикции SphI и фрагментом Кленова полимеразы 1 для восстановления рамки считывания гена gfp. В результате получают плазмиду pDps-gfp, правильность участков встраивания в которой подтверждают рестрикционным анализом и секвенированием. Определение нуклеотидных последовательностей проводят в обоих направлениях с использованием автоматического секвенатора CEQ™ 2000XL DNA Analysis System ("Beckman") и наборов "F"CEQ DTCS Kit.

На основе результатов определения нуклеотидных последовательностей встроенных фрагментов и рестрикционного анализа плазмиды строят схему плазмиды, содержащей под контролем промотора гена dps Escherichia coli ген, кодирующий флюоресцентный белок GFPvaa (фиг.1).

Рекомбинантная плазмидная ДНК pDps-gfp характеризуется следующими признаками:

- имеет молекулярную массу 2,4 МДа и размер 3630 п.о.;

- содержит искусственный ген, кодирующий флюоресцентный белок GFPvaa, под контролем промотора гена dps Escherichia coli, обеспечивающего продукцию флюоресцентного белка GFPvaa в присутствие токсических факторов;

состоит из следующих элементов:

- ApaI/HindIII - векторного фрагмента плазмиды pRS2 [21], размером 2688 п.о., содержащего сайт инициации репликации плазмиды pUC 18, ori Е. coli, ген бета-лактамазы (bla);

- ApaI/ HindIII - фрагмента размером 927 п.о., содержащего промотор гена dps Escherichia coli и ген, кодирующий флюоресцентный белок GFPvaa;

содержит:

- генетический маркер: ген бета-лактамазы (bla), определяющий устойчивость трансформированных pDps-gfp клеток E.coli к ампициллину;

- уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, имеющие следующие координаты: HindIII - 442, NcoI - 1034, ApaI - 1383.

Следующий этап работы - получение рекомбинантного бактериального штамма, способного продуцировать флюоресцентный белок GFPvaa в присутствии токсических факторов, что легко детектируется по повышению флюоресценции суспензии клеток этого штамма. Для получения такого продуцента используют штамм Escherichia coli JM109 endA1, gyrA96, hsdR, relA1, R17(r_k-, m_k+), supE44, thi-1, strA, Δ(lac-proAB), [F', traD36, proAB, lacI^qZΔMIS].

Компетентные клетки Eschercihia coli JM109 трансформируют ДНК плазмиды pDps-gfp, выделенной из отобранного клона методом щелочного лизиса [22]. Полученный таким образом рекомбинантный штамм Escherichia coli JM109 [pDps] характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки мелкие утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре "Difco" - колонии круглые, гладкие, прижатые, мутные, блестящие, серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде или бульоне Луриа) образуют интенсивную ровную муть. Клетки растут при температуре 37°С при оптимуме рН от 6.8 до 7.0.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (100 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды.

Рекомбинантный штамм Escherichia coli JM109 [pDps] обеспечивает индуцируемый токсическими агентами (перекись водорода, фенол) синтез флюоресцентного белка GFPvaa, что легко детектируется по повышению флюоресценции суспензии клеток этого штамма (примеры 3-4).

Полученный штамм депонирован в Коллекции культур микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» под номером В-1147.

Для оценки чувствительности полученных клеток Escherichia coli JM109 [pDps] ночную культуру этих клеток разводят в свежем бульоне Луриа с 50 мкг/мл ампициллина и растят при 37°С до среднелогарифмической фазы. Затем клетки промывают в минимальной среде М9 и вносят в лунки 96-луночного планшета, содержащего соответствующие разведения токсических агентов. В качестве токсических агентов используют 10 мМ, 5 мМ, 2.5 мМ, 1.25 мМ и 0.68 мМ перекись водорода (окислительный агент) и 3.2 мМ, 1.6 мМ и 0.8 мМ (300, 150, 75 ppm, соответственно) фенол (повреждение мембран и белков). Чувствительность клеток Escherichia coli JM109 [pDps] к присутствию токсических агентов оценивают по увеличению флюоресценции (облучение - 485 нм, 0,1 с; эмиссия - 535 нм) при температуре культивирования 26°С и 32°С. Флюоресценцию измеряют с помощью флюориметра Perkin Elmer VICTOR³ в единицах флюоресценции, уровень индукции представляет собой отношение максимальной флюоресценции в опыте к флюоресценции в контрольной точке, измеренной за тот же период времени. Флюоресценцию клеток Escherichia coli JM109 [pDps], не подвергшихся воздействию токсических агентов, рассматривают в качестве отрицательного контроля (см. примеры 3, 4).

Определяющими отличиями предлагаемого изобретения являются:

- на основе промотора гена dps E.coli, отобранного с помощью специально созданной базы данных GenSensor [11], конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pDps-gfp, содержащую под контролем этого промотора ген, кодирующий флюоресцентный белок green fluorescent protein (GFPvaa);

- путем трансформации клеток Escherihia coli JM109 рекомбинантной плазмидной ДНК pDps-gfp получают штамм Escherichia coli JM109 [pDps], способный продуцировать флюоресцентный белок GFPvaa в присутствии токсических факторов, в частности фенола или перекиси водорода, что легко детектируется по повышению флюоресценции суспензии клеток этого штамма. Таким образом, полученная конструкция является геносенсором, регистрирующим присутствие в среде токсических факторов, в частности фенола и перекиси водорода.

Изобретение иллюстрируется следующими чертежами:

Фиг.1. Физическая карта плазмиды pDps-gfp, содержащей под контролем промотора гена dps Escherihia coli ген, кодирующий флюоресцентный белок green fluorescent protein (GFPvaa). Указаны сайты для эндонуклеаз рестрикции HindIII, Sfhl, Apal, Avail и PvuII; промотор гена dps; ген, кодирующий флюоресцентный белок GFPvaa; ген ампициллиновой устойчивости к ампициллину Amp^r.

Фиг.2. Влияние различных концентраций Н₂О₂ на флюоресценцию клеток линии Е.coli, трансформированных плазмидой pDps-gfp, в сравнении с контрольными клетками при температуре 26°С (А) и 32°С (Б).

Фиг.3. Влияние различных концентраций фенола на флюоресценцию клеток линии E.coli, трансформированных плазмидой pDps-gfp, в сравнении с контрольными клетками при температуре 26°C (А) и 32°С (Б).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pDps-gfp, содержащей под контролем промотора гена dps ген gfp, кодирующий флюоресцентный белок GFPvaa.

ДНК-фрагмент, содержащий промоторный район гена dps, получают в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием олигонуклеотидных праймеров:

а также ДНК Escherichia coli HB101 в качестве матрицы синтезируют фрагмент, содержащий промоторный район гена dps. Затем обработкой ДНК плазмиды pZE21 [20] эндонуклеазами рестрикции Kpnl и HindIII получают ДНК-фрагмент, кодирующий флюоресцентный белок GFPvaa. Этот фрагмент ДНК объединяют в реакции лигирования с векторной плазмидой pRS2 [21], гидролизованной эндонуклеазами Kpnl и HindIII. Полученный таким образом промежуточный вектор гидролизуют эндонуклеазами Apal и SphI и объединяют в реакции лигирования с обработанным теми же эндонуклеазами ПНР-фрагментом, содержащим промотор гена dps. Сконструированную таким образом плазмидную ДНК обрабатывают эндонуклеазой рестрикции SphI и фрагментом Кленова полимеразы 1 для восстановления рамки считывания гена gfp. В результате получают геносенсорную плазмиду pDps-gfp, правильность участков встраивания в которой подтверждают рестрикционным анализом и секвенированием. Определение нуклеотидных последовательностей проводят в обоих направлениях с использованием автоматического секвенатора CEQ™ 2000XL DNA Analysis System ("Beckman") и наборов "P"CEQ DTCS Kit.

Пример 2. Создание рекомбинантного штамма Escherichia coli JM109 [pDps], продуцирующего флюоресцентный белок GFPvaa в присутствии агентов, токсических для клетки.

Клетки штамма Eschercihia coli JM109 endAl, gyrA96, hsdR, relAl, R17(r_k-, m_k+), supE44, thi-1, strA, Δ(lac-proAB), [F', traD36, proAB, lacI^qZΔМ15] культивируют при 37°С до среднелогарифмической стадии роста и трансформируют кальциевым методом ДНК рекомбинантной плазмиды pDps-gfp, очищиенной методом щелочного лизиса (22). Трансформанты высевают на агаризованную среду LB, содержащую 50 мкг/мл ампициллина. Выросшие наутро клоны культивируют в бальоне Луриа с 50 мкг/мл ампициллина, и из них выделят плазмидную ДНК методом щелочного лизиса (22). Соответствие выделенных плазмидных ДНК требуемой ДНК подтверждают рестрикционным анализом и секвенированием участка встройки. Клон, содержащий плазмиду pDps-gfp, рассевают до отдельных колоний на агаризованной среде LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. ДНК плазмид из отдельных клонов выделяют методом щелочного лизиса (22), и все процедуры повторяют еще 2 раза, соответственно. В итоге получают штамм Escherichia coli JM109 [pDps], содержащий рекомбинантную геносенсорную плазмиду pDps-gfp.

Пример 3. Тестирование чувствительности созданного рекомбинантного штамма Escherichia coli JM109 [pDps] к воздействию перекиси водорода (окислительный агент).

Чувствительность полученных клеток Escherichia coli JM109 [pDps] оценивают в модельных экспериментах по увеличению флюоресценции при температуре культивирования 26°С и 32°С. Для этого ночную культуру клеток подращивают в свежей среде LB с 50 мкг/мл ампициллина до среднелогарифмической стадии. Затем клетки промывают в среде М9 и аликвоты по 50 мкл вносят в лунки планшета, содержащие 20, 10, 5, 2.5, 1.25 мМ перекиси водорода в 50 мкл М9, соответственно. Эксперимент проводят в повторах и повторяют не менее трех раз. Флюоресценцию клеток измеряют на флюориметре Perkin Elmer VICTORS: время облучения - 0,1 с, длина волны облучения - 485 нм, длина волны эмиссии - 535 нм. Флюоресценцию клеток Escherichia coli JM109 [pDps], не подвергшихся воздействию перекиси водорода, рассматривают в качестве отрицательного контроля. Значения флюоресценции приводят на графике (Фиг.2). Клетки Escherichia coli JM109 [pDps] реагируют на присутствие перекиси водорода в концентрации 0.68 - 5 мМ с максимальным уровнем индукции через 50-70 мин.

Пример 4. Тестирование чувствительности созданного рекомбинантного штамма Escherichia coli JM109 [pDps] к воздействию фенола (токсически агент, повреждающий белки и мембраны клетки).

Ночную культуру клеток Escherichia coli JM109 [pDps] подращивают в свежей среде LB с 50 мкг/мл ампициллина до среднелогарифмической стадии. Затем клетки промывают в среде М9 и аликвоты по 50 мкл вносят в лунки планшета, содержащие 6.4, 3.2, и 1.6 мМ фенола (600, 300, 150 ppm, соответственно) в 50 мкл М9, соответственно. Эксперимент проводят в повторах и повторяют не менее трех раз. Флюоресценцию клеток измеряют на флюориметре Perkin Elmer VICTOR3: (0,1 с/485 нм/535 нм). Флюоресценцию клеток Escherichia coli JM109 [pDps], не подвергшихся воздействию фенола, рассматривают в качестве отрицательного контроля. Значения флюоресценции приводят на графике (Фиг.3). Реакция клеток Escherichia coli JM109 [pDps] на присутствие фенола достигает максимума через 20-40 мин, при этом уровень максимальной индукции развивается при концентрации фенола 3.2 mM (300 ppm).

Таким образом, впервые сконструирована рекомбинантная плазмида pDps-gfp, содержащая под контролем промотора гена dps Escherichia coli ген, кодирующий флюоресцентный белок green fluorescent protein GFPvaa, продукция которого увеличивается в присутствии в среде токсических агентов различной природы, приводящих к активации промотора гена dps, в частности, фенола и перекиси водорода; трансформация клеток Escherichia coli JM109 обусловливает получение рекомбинантного штамма Escherichia coli JM109 [pDps], способного к продукции флюоресцентного белка GFPvaa в присутствие токсических агентов, в частности фенола и перекиси водорода. Увеличение флюоресценции клеток полученного штамма свидетельствует об активации геносенсорной конструкции и, следовательно, о присутствии токсических агентов в среде.

Источники информации

1. D'Souza S.F. // Biosens. Bioelectron. 2001. V.16. P.337-353.

2. Zheng M, Wang X., Templeton L.J. et al. // J. Bacteriol. 2001. V.183. P.4562-4570.

3. Khil P.P., Camerini-Otero R.D. // Mol. Microbiol. 2002. V.44. P.89-105.

4. Hakkila K., Maksimow M., Karp M. et al. // Anal. Biochem. 2002. V.301. P.235-242.

5. Lu С., Albano C.R., Bentley W.E. et al. // Biotechnol. Bioeng. 2005. V.89. P.574-587.

6. Kirn B.C., Gu M.B. // Biosens. Bioelectron. 2003. V.18. P.1015-1021.

7. Justus Т., Thomas S.M. // Mutat. Res. 1998. V.398. P.131-141.

8. Behor O., Smulski D.R., Van Dyk Т.К. et al. // J. Biotechnol. 2002. V.94. P.125-132.

9. Tauriainen S., Virta M., Chang W. et al. // Anal. Biochem. 1999. V.272. P.191-198.

10. Ivask A., Virta M., Kahru A. // Soil Biol. Biochem. 2002. V.34. P.1439-1447.

11. Хлебодарова Т.М., Степаненко И.Л., Подколодный Н.Л. // Свидетельство РФ о регистрации базы данных GenSensor №2006620197. 2006.

12. Lomovskaya O.L., Kidwell J.P, Matin A. // J. Bacteriol. 1994. V.176. P.3928-3935.

13. Groat R.G., Schultz J.E., Zychlinsky E., Bockman A., Matin A. // J. Bacteriol. 1986. V.168. P.486-493.

14. Pomposiello P.J., Bennik M.H., Demple B. // J. Bacteriol. 2001. V.183. P.3890-3902.

15. Phadtare S., Kato I., Inouye M. // J. Bacteriol. 2002. V.184. P.6725-6729.

16. Tani Т.Н., Khodursky A., Blumenthal R.M., Brown P.O., Matthews R.G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V.99. V.13471-13476.

17. Ali Azam Т., Iwata A., Nishimura A., Ueda S., Ishihama A. // J. Bacteriol. 1999. V.181. P.6361-6370.

18. Schembri M.A., Kjaergaard K., Klemm P. // Mol. Microbiol. 2003. V.48. P.253-267.

19. Andersen J.B., Stemberg С. et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V.64. P.2240-2246.

20. Elowitz M., Leibler S. // Nature. 2000. V.403. P.335-338.

21. Frolov I.V., Kolykhalov A.A., Agapov E. et al. // Dokl. Akad. Nauk. 1992. V.326. P.738-741.

22. Bimboim H.C., Doly J. // Nucleic Acids Res. 1979. V.7. P.1513-23.

Изобретение относится к области биотехнологии, белковой и генной инженерии и может быть использовано для мониторинга окружающей среды. Рекомбинантный штамм Escherichia coli способен продуцировать флуоресцентный белок GFPvaa в присутствии токсических факторов и пригоден для определения в среде фенола и перекиси водорода. Применение изобретения позволяет расширить арсенал технических средств для регистрации присутствия в среде перекиси водорода и фенола. 5 ил.

Штамм бактерий Escherichia coli, депонированный в Коллекции культур микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» под регистрационным номером В-1147, для тестирования присутствия в среде фенола и перекиси водорода.