Изобретение относится к генетической инженерии и касается способа получения рекомбинантного белка дифтерийный токсин интерлейкин 2 (ДТИЛ2) в клетках бактерий E. coli.
Известен способ создания переадресованных токсинов на основе гена дифтерийного токсина коринефага β и генов полипептидных гормонов, таких как меланоцитостимулирующего гормона (МСГ) или интерлейкина 2 [1]
Конструирование генов слитых белков описано в данном патенте только для ДТ-aМСГ и ДТ-bМСГ c использованием сборки гена ДТ из отдельных нуклеотидных последовательностей, кодирующих А и В фрагменты дифтерийного токсина.
Известен способ конструирования гена слитого белка ДТИЛ2, состоящий в клонировании синтетического гена ИЛ2, полученного по опубликованной последовательности ИЛ2 [2] в единичном Рае сайте гена ДТ.
Однако низкая экспрессия гена слитого белка под контролем собственного промотора дифтерийного токсина и высокая степень его протеолитической деградации не позволяют эффективно нарабатывать данный полипептид в клетках Е. сoli.
Задача изобретения получение слитого белка ДТИЛ2, обладающего антигенными детерминантами дифтерийного токсина и интерлейкина 2.
Отличием предлагаемого изобретения является то, что ген слитого белка сконструирован на основе гена дифтерийного токсина из коринефага w и природного гена зрелого интерлейкина 2 человека. Соединение рамок считывания произвели с использованием Есо RI сайта гена ДТ, встраивания Ваm HI линкера, обработки эндонуклеазой рестрикции Bam HI и последующего лигирования фрагмента ДНК (фиг. 3) в векторной плазмиде. Дополнительное отличие созданной плазмиды состоит в том, что ген ДТИЛ2 в рДТИ23 находится под контролем индуцибельного промотора лактозного оперона из плазмиды pVС18, что позволяет увеличить уровень экспрессии этого белка в десятки раз по сравнению с ранее описанным [3] АДФ-рибозалирующая активность полученного химерного токсина соответствует активности исходного дифтерийного токсина.
Плазмида рДТИ23, кодирующая слитый белок дифтерийный токсин-интерлейкин 2, имеет молекулярную массу 3,2 Мd (размер 4,7 т.п.о.) и состоит из следующих элементов:
фрагмент Sma I SalGI ДНК плазмиды рVC18, размер которого 2,6 т.п.о.
фрагмент Есо 24.I SalGI, кодирующий синтез слитого белка дифтерийный токсин-интерлейкин 2.
Фрагменты содержат следующие гены:
ген bla, кодирующий синтез b-лактомазы,
ген слитого белка ДТИЛ2.
Способ конструирования плазмиды рДТИ23, кодирующей синтез слитого белка ДТИЛ2, заключается в том, что фрагмент (2,3 т.п.о.) ДНК плазмиды рДТ555 после полного гидролиза рестриктазами ЕсоRI и Bam HI и достройки концов до тупых клонируют в плазмиде рАА1213 по затупленному ЕсоRI сайту; полученную плазмиду рДТИЛ34 рестриктируют ферментом Есо72.I и в тупоконечный разрыв встраивают Ваm HI линкер, после обработки которого эндонуклеазой рестрикции выделяют фрагмент ДНК размером 7,3 кв, проводят его лигирование и трансформацию бактерий выделенной рекомбинантной плазмидой, а ген слитого белка ДТИЛ2 выделяют с помощью полного гидролиза рестриктазами Есо24.I и SalGI, выступающие 3' концы удаляют обработкой Т4-полимеразой, затем фрагмент клонируют по SmaI SalGI сайтам в плазмиде pVC18.
Для решения задачи используют штамм бактерий Escherichia coli JM109 (рДТИ23) ВКМ СR 341Д продуцент слитого белка ДТИЛ2.
Культурально-морфологические особенности предлагаемого штамма
Клетки прямые, палочковидной формы 1,2 1,6 • 2,0 6,0, мкм, грамотрицательные, неспороносные.
Культуральные признаки
Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясо-пептонном агаре, L-агаре колонии гладкие, круглые, блестящие, желтовато-белые, край ровный, непрозрачные.
При росте культуры в мясо-пептонном бульоне и LB-среде образуется ровная интенсивная муть.
Физиолого-биохимические признаки
Клетки растут в пределах от 4 до 45oC при оптимуме рН 7,2 7,4.
В качестве источника углерода используют многие углеводы, в том числе d-глюкозу, d- фруктозу, арабинозу, трегалозу. Клетки не усваивают ацетат, аданит, галактозу.
Источником азота служит преимущественно органическая форма в виде пептона и аминокислот.
Клетки желатину не разжижают, индол не образуют.
Уреазная активность не обнаруживается.
Устойчивость к антибиотикам
Проявляют устойчивость к ампициллину (до 800 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды рДТИ23.
Пример 1.
Способ получения плазмиды рДИ23.
Исходными плазмидами для конструирования плазмиды рДТИ23 являются плазмида рДТ555 (фиг. 1) с клонированным в ней геном дифтерийного токсина из Соr. diphteriae (w + tox) и плазмида рАА1213 (фиг. 2), несущая ген зрелого интерлейкина 2 человека, любезно представленная Э.Я. Греном (Институт органического синтеза АН Латвии).
ДНК плазмид рДТ555 и рАА1213 выделяют по методу [4] Концентрацию плазмидной ДНК определяют спектрофотометрически (коэффициент экстинкции e260 260 0,02 отп. ед./мкг. Полученные препараты плазмид рДТ555 и рАА1213 используют для конструирования плазмиды рДТИ23. Конструирование проводят в несколько этапов в следующей последовательности (фиг. 3): 6 мкг плазмидной ДНК рДТ555 инкубируют с эндонуклеазой рестрикции ЕсоRI (15 ед.) в буфере 3 (0,5 М трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl). Реакцию проводят при 37oC в течение одного часа. Полноту рестрикции определяют электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле. Полученную после первой рестрикции плазмидную ДНК рДТ555 переосаждают этанолом и проводят рестрикцию Ваm HI (12 ед.) в буфере 3, после чего снова проверяют полноту рестрикции электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле. В результате двойной рестрикции ферментами EcoRI и Bam HI из плазмиды рДТ555 выщепляется фрагмент размером 2,3 кв, несущий ген дифтерийного токсина с собственным промотором и последовательностью, кодирующей сигнальный пептид. Фрагмент выделяют препаративным электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле. После завершения электрофореза гель окрашивают в 0,05%-ном растворе бромистого этидия и визуализируют фрагменты ДНК, облучая ультрафиолетовым светом (облучатель DESAGA, ФРГ) с длиной волны 340 нм. Полосу, соответствующую фрагменту ДНК, размером 2,3 кв, аккуратно вырезают скальпелем, помещают в диализный мешок с 0,4 мл буфера для электрофореза (10 мМ трис-ацетат, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) и подвергают электрофорезу в течение 1,5 часов, в результате которого ДНК перемещается из геля в буферный раствор. ДНК в буферном растворе очищают двукратной обработкой забуференным фенолом и эфиром. Затем переосаждают этанолом, после чего выступающие 5' концы фрагмента ДНК достраивают до тупых фрагментом Кленова ДНК полимеразы I в присутствии четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов.
4 кг плазмидной ДНК рАА1213 инкубируют с рестриктазой Есо RI (10 ед.) в буфере 3 в течение 1 2 часов. Проверяют полноту рестрикции электрофорезом в 0,8% -ном агарозном геле. ДНК плазмиды переосаждают спиртом и достраивают выступающие 5' концы линейной формы ДНК рАА1213 до тупых.
Соединение фрагмента ДНК плазмиды рДТ555 размером 2,3 кв и векторной ДНК (рАА1213) проводят в буфере для лигирования (10 мМ трис-НСl, рН 7,6, 10 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ, 0,0025 мМ АТФ) в присутствии РНК-лигазы (20 е.а.) и ДНК-лигазы (10 е. а. ). Для лигирования смешивают 3 мкг ДНК фрагмента плазмиды дДТ555 с 1 мкг плазмидной ДНК рАА1213. Реакцию лигирования проводят при 4oC в течение 16 часов. Качество лигирования проверяют электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле. Полученным препаратом ДНК трансформируют клетки бактерий Е. соli К12 штамма jM109 с применением хлористого кальция по методике [4] Из полученных ампициллин-резистентных(Apr) клонов Е. сoli выделяют плазмидную ДНК по методу Бирмбойма [5] и сравнивают подвижность выделенных плазмид в 0,8% -ном агарозном геле с подвижностью плазмиды рАА1213. Уменьшенная подвижность свидетельствует о наличии вставки фрагмента ДНК из плазмиды рДТ555. Плазмидную ДНК Арr клонов Е. сoli с уменьшенной подвижностью выделяют и подвергают рестрикционному анализу. Рестрикционный анализ плазмиды рДТИЛ34, представленный на фиг. 3, свидетельствует о том, что гены дифтерийного токсина и интерлейкина 2 расположены тандемно и направление транскрипции обоих генов совпадает.
Плазмида рДТИЛ34 послужила основой для соединения кодирующих последовательностей обоих генов (ДТ и ИЛ2) в одну транскрипционную единицу с одновременным удалением последовательности гена ДТ, кодирующей рецепторсвязывающий домен дифтерийного токсина. Данные литературы свидетельствуют, что рецепторсвязывающей активностью обладает С-концевая последовательность, состоящая из 50 а.о. расположенная дистальнее второй дисульфидной петли ДТ. Эта последовательность кодируется, начиная с 1640 нуклеотида (считая от 5' Hind III сайта гена ДТ), и далее. Конструирование основано на том, что в районе 1660 нуклеотида гена ДТ в плазмиде рДТИЛ34 расположен единичный сайт для рестриктазы Есо72.I, которая генерирует тупые концы. Для этого 5 мкг плазмидной ДНК рДИЛ34 обрабатывают эндонуклеазой рестрикции Есо72.I (15 е.а.) в буфере (10 мМ трис-НСl, рН 7,8, 150 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 100 мкг/мл альбумина) при 37oC в течение двух часов. Полноту рестрикции проверяют электрофорезом в 0,8%-ном агарозе. Полностью гидролизованную ДНК плазмиды рДТИЛ34 переосаждают этанолом. Далее 0,002 о.е. Ваm HI линкера CGGAATCG (НПО "Фермент", г. Вильнюс) встраивают с помощью ферментов ДНК-лигазы(10 е.а.) и РНК-лигазы (20 е.а.) в буфере 2 при 4oC в течение 16 часов. ДНК плазмиды после реакций лигирования переосаждают этанолом, растворяют в буфере 3, добавляют эндонуклеазу рестрикции Ваm HI (15 е.а.) и инкубируют 2 часа при 37oC. После проверки полноты расщепления в 0,8%-ном агарозном геле препаративным электрофорезом выделяют фрагмент ДНК размером 7,2 кв, как это уже было описано. Выделенный фрагмент ДНК обрабатывают ДНК-лигазой (10 е.а.) в буфере для лигирования при 4oC в течение 16 часов. Качество лигирования проверяют электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле. Полученными лигатами трансформируют клетки Е. соli штамма НВ101 c применением СаСl2 методики [4] Трансформанты отбирают на агаризованной L-среде, содержащей ампициллин (30 мкг/мл). Из Apr клонов по результатам иммуноблотинга с применением антидифтерийных и антиинтерлейкиновых антител отбирают те из них, которые синтезируют слитый белок дифтерийный токсин-интерлейкин 2 (фиг. 4). Молекулярная масса этого полипептида, содержащего антигенные детерминанты как ДТ, так и ИЛ2, составляет 70 кД, что хорошо совпадает с результатами подсчета, исходя из нуклеотидной последовательности. Таким образом была отобрана плазмидная рSF39, нуклеотидная последовательность которой была проверена в районе "стыка" генов ДТ и ИЛ2 методом химической деградации Максама-Гилберта. Нуклеотидная последовательность приведена ниже:
DT.GTG CAC CGG ATC CCA ATC.IL2
Учитывая данные по первичной структуре ДТ и ИЛ2, а также результаты секвенирования pSF39, можно сделать вывод, что слитый белок состоит из 650 а.с. из которых первые 25 N-концевых а.о. составляют сигнальный пептид ДТ. Ген слитого белка ДТИЛ2 находится в плазмиде рSF39 под контролем промотора гена ДТ, который в Е. соli направляет конститутивный синтез ДТ со средней эффективностью. Для повышения уровня синтеза ДТИЛ2 и регулирования этого процесса ген слитого белка был поставлен под контроль индуцибельного lac- промотора плазмиды pVС18. Для этого 5 мкг плазмиды инкубируют с рестриктазой Eco24.I (15 е. а. ) в буфере (10 мМ трис-НСl, рН 8,0, 10 мМ MgCl2, 1 мМ ДДТ, 100 мкг/мл альбумина) при 37oC в течение двух часов. Полноту рестрикции проверяют электрофорезом. ДНК рестриктированной плазмиды рSF39 переосаждают этанолом и удаляют выступающие 3' ОН концы полимеразой фага Т4 (10 е.а.) в буфере (0,033 М трис-ацетат, рН 7,9; 0,066 М уксуснокислый калий, 0,01 М уксуснокислый магний, 0,5 мМ ДТТ, 0,01 мкг/мл альбумина) при 37oC в течение 10 минут. После переосаждения этанолом ДНК плазмиды psF39 обрабатывают эндонуклеазой рестрикции salGI. Проверяют полноту рестрикции и выделяют препаративным электрофорезом фрагмент ДНК размером 2,1 кв, несущий ген слитого белка ДТИЛ2.
Плазмидную ДНК вектора pVC18 (5 мкг) обрабатывают последовательно нуклеазой рестрикции SmaI (15 ед.) в буфере (20 мМ трис-НСl, рН 7,4, 5 мМ МgCl2; 50 мМ КСl) при 37oC в течение 2 часов, а после проверки полноты рестрикции и переосаждения этанолом рестриктазой SalGI (15 ед.) в буфере 3 при 37oC в течение 2 часов. Большой фрагмент ДНК рVC18 выделяют препаративным электрофорезом. Соединение фрагментов ДНК плазмиды psF39 и рvC18 проводят лигированием лигазой фага Т4 по описанной методике. Полученным препаратом трансформируют клетки Е. соli jM109. Из Apr-клонов отбирают те из них, которые содержат плазмиду рVC18 co вставкой фрагмента из pSF39 по уменьшенной подвижности плазмидной ДНК, как было описано ранее. Рекомбинантные плазмиды, содержащие вставку, подвергают рестрикционному анализу, а затем проводят секвенирование 5'- и 3'-концов гена слитого белка методом Сэнгера. Как показывают результаты этих экспериментов, отобранная рекомбинантная плазмида рДТИ23 полностью удовлетворяет карте, представленной на фиг. 5, и имеет следующую структуру начала гена:
Таким образом, в плазмиде рДТИ23 ген слитого белка ДТИЛ2 находится под контролем индуцибельного lac-промотора. Экспрессия белка ДТИЛ2 в клетках Е. соli jM109 (рДТИ23) достигается только после индукции изопропил-β-D-тиогалактозидом (ИПТГ).
Пример 2.
Индукция синтеза слитого белка в клетках Е. соli jM109 (рДТИ23).
Клетки бактерий E. coli jM109 (рДТИ23) выращивают в 5 мл LB-среды с ампициллином (30 мкг/мл) при 37oC в течение 16 часов. Далее ночную культуру разводят в 15 раз средой LB c ампициллином, подращивают при 37oC при интенсивном качании (180 об/мин) в течение двух часов, после чего добавляют ИПТГ до конечной концентрации 0,001 М и продолжают подращивать при то же режиме [6] Далее клетки собирают центрифугированием (3000 g, 10 мин) и лизируют методом замораживания-оттаивания в присутствии лизоцима 2 мг/мл ФБРТ (10 мМ К Na фосфатный буфер, рН 7,2 7,4, 0,15 М NaCl, 0,05% Твин 20). После второго замораживания оттаивания центрифугируют (10000 g, 15 мин), отбирают супернатант. Наличие слитого белка в супернатанте определяют иммуноферментным анализом с использованием лошадиных антител к дифтерийному токсину и моноклональных антител к интерлейкину 2, как было описано ранее.
Литература
1. Williams D.P. Parker K. Bacha P. Bishai W. Borowski M. Genbauffe F. Strom T.B. Murphy J.R. Diphtheria toxin receptor binding domain substitution with interleukin-2: genetic construction and properties of a diphteria toxin-related interleukin-2 fusion protein // Protein engineering. - 1987. Vol.1. P.493-498.
2. Bishai W.R. Rappuoli R. Murphy J.R. High-level expression of a proteolytically sensitive diphtheria toxin fragment in Escherichia coli // J. of Bacteriology. 1987. Vol. 169. P.5140-5151.
3. Шемякин И.Г. Анисимова В.А. Митрофанова Г.Н. Конструирование и экспрессия гибридных белков дифтерийный токсин-интерлейкин 2 // Молекулярная биология. 1992, т.26, с.1088-1098.
4. Матиатис Т. Фрич Э. Сэмбрук В. Методы генетической инженерии: молекулярное клонирование. Пер. с анг. М. Мир, 1984.
5. Birnboim H.C. Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // NAR. 1978. Vol.7. P.1513-1516.
6. Kapralek F. Jecmen P. Sedlacek J. Fabry M. Zadrazil S. Fermentation conditions for high-level expression or the tac-promoter-controlled calf prochymosin cDNA in Escherichia coli HB101 // Biotechnology and Bioengineering. 1991. Vol.37. P.71-79.
Использование: биотехнология, медико-биологические исследования Т-клеток. Сущность: получение рекомбинантной плазмидной ДНК рДИ23, определяющий синтез слитого белка дифтерийный токсин-интерлейкин 2 (ДТИЛ2) и штамма бактерий Escherichia coli, содержащего указанную плазмидную ДНК. Рекомбинантная плазмидная ДНК рДТИ23 имеет размер 4,7 т.п.о., ген ДТИЛ2 находится в ней под контролем индуцибельного промотора лактозного оперона из плазмиды рVС18, что позволяет увеличить уровень экспрессии белка в десятки раз. Для получения плазмиды рДТИ23 соединяют рамки считывания гена дифтерийного токсина (ДТ) из коринефага ω и природного гена зрелого интерлейкина 2 человека при использовании Eco RI-сайта гена ДТ, встраивания Bam HI-линкера, обработки эндонуклеазой рестрикции Bam HI и последующего лигирования фрагмента ДНК в векторной плазмиде. Штамм Е. соli хорошо растет на простых питательных средах, проявляет устойчивость к ампициллину и продуцирует слитый белок ДТИЛ2 после индукции изопропил-b-D-тиогалактозидом. 3 с.п. ф-лы, 5 ил.
1 1. Рекомбинатная плазмидная ДНК рДТИ 23 размером 4,7 т.п.о. и мол.м. 3,1 МДа, определяющая синтез слитого белка дифтерийный токсин-интерлейкин 2 человека (ДТИЛ2), содержащая Sma I SalG I - фрагмент плазмиды pUC18 размером 2,6 т.п.о. Eco 24.1 SalG I - фрагмент плазмиды pSF39 размером 2,1 т.п.о. соответствующий гену слитого белка ДТИЛ2; генетический маркер: bla-ген, обеспечивающий устойчивость к ампициллину.2 2. Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК рДТИ 23, определяющей синтез слитого белка дифтерийный токсин-интерлейкин 2 человека (ДТИЛ2), заключающийся в том, что плазмиду рДТ555 полностью гидролизуют рестриктазами EcoRI и BamHI, выделяют фрагмент ДНК размером 2,3 т.п.о. соответствующий гену дифтерийного токсина (ДТ) с собственным промотором и последовательностью сигнального пептида, 5'-концы указанного фрагмента достраивают до тупых с помощью ДНК-полимеразы I Кленова, соединяют его с векторной ДНК рАА1213 по EcoRI-сайту с получением плазмиды рДТИЛ34, данную плазмиду расщепляют рестриктазой Eco 72.1 и в тупоконечный разрыв встраивают BamHI-линкер, затем плазмиду рДТИЛ34 расщепляют эндонуклеазой BamHI и выделяют фрагмент ДНК размером 7,2 т.п.о. осуществляют его лигирование, полученными лигатами трансформируют клетки бактерий Escherichia coli и отбирают плазмиду psF39, содержащую ген слитого белка ДТИЛ2 под контролем промотора гена ДТ, далее расщепляют плазмиду pSF39 рестриктазой Eco 24.1 с удалением выступающих 3'-OH-концов и затем рестриктазой SalGI выделяют фрагмент ДНК размером 2,1 т.п.о. соответствующий гену слитого белка ДТИЛ2, встраивают его по SmaI SalGI-сайту в плазмиду pUC18 и получают целевую плазмиду рДТИ 23, определяющую синтез слитого белка ДТИЛ2 под контролем индуцибельного промотора.2 3. Штамм бактерий Esherichia coli ВКМ CR-341Д, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК рДТИ 23, - продуцент слитого белка ДТИЛ2.
