СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЛАСТОЦИСТ ОТ ДОЖДЕВЫХ ЧЕРВЕЙ Российский патент 2009 года по МПК A01K67/33 

Способ относится к ветеринарии и может быть использован при извлечении бластоцист для получения гетерогенных бластомерных стволовых клеток при лечении коров и овец с гинекологическими болезнями.

Известен способ получения бластоцист, он заключается в том, что у коров-доноров на пятый день после оплодотворения вымывали из матки с помощью двухканального катетера жидкостью 199 [1, 2].

Недостатком этого способа является его трудоемкость и при введении вымывного катетера на 5-6-й день в канал шейки матки коровам возникает кровотечение в результате травмирования поперечных складок. Извлечение зигот вымыванием приходится производить несколько раз и зиготы зачастую собираются не только с жидкостью 199, но и со сгустками крови, что невозможно отделить даже фильтрацией.

Известен также способ получения зигот, включающий взятие фолликулярных овоцитов из графового пузырька яичника. Для созревания их помещают в среду Хэнкса (с добавлением плодовой сыворотки крови, углекислого натрия, антибиотиков и фильтрация через миллиопоровый фильтр). Полученные яйцеклетки подвергали оплодотворению, запуская к ним сперматозоиды через 20-24 часа, после этого происходило оплодотворение [3].

Недостатком этого способа является то, что миллиопоровые фильтры не всегда позволяют проводить очистку вымытого содержимого из матки от эритроцитов эпителиальных клеток, от вытекающей лициносодержащей слизи, поэтому только удается отмыть только до 30% полноценных яйцеклеток, обладающих оплодотворяющей способностью.

Известен также способ и принят как прототип, когда производится у плодов взятие крови со стволовыми клетками из пуповины, предварительно фиксируя ее пинцетом [4], собирая ее в емкость (пенициллиновый флакон).

Недостатком этого способа является трудоемкость выполнения процедур, имеется возможность смешивания крови со слизью "Урахуса" с амниотической, аллантоизной жидкостями. Пинцет, фиксирующий пуповинные сосуды, имеющий плоские бранши, не всегда равномерно при фиксации сосудов пуповины регулирует, передавливая, поток крови, что приводит к травмированию пуповины, смешиванию с воздухом и неравномерному вытеканию крови из артериальных и венозных сосудов.

Задачей, на решение которой направлено заявленное изобретение, является упрощение технологии получения бластоцист (бластомерных стволовых клеток) от дождевых червей для дальнейшей их криоконсервации и их использовании при лечении животных гетерогенными стволовыми клетками.

Технический результат достигается тем, что в способе получения бластоцист, наполненных бластомерными стволовыми клетками (от дождевых червей), из полового пояска с учетом того, что дождевые черви гермафродиты, поэтому оплодотворение яйцеклеток и образование бластоцист и зигот создается в течение нескольких часов, и выход происходит в области полового пояска. Поэтому плоскими браншами пинцета надавливание на кольцеобразный половой поясок приводит к раздавливанию, травмированию и гибели бластоцист и травмированию поверхности тела червей, вызывая стрессовые факторы, что останавливает спермогенез, овогенез, оплодотворение. Поэтому бластоцисты приходится получать не через 2-3 мин, а через 10 минут. Получение бластоцист производится путем легкого надавливания полукруглой сетчатой формы браншами пинцета по всей окружности полового пояска. Легкие сдавливания тела дождевого червя в области полового пояска не создают стрессовых факторов и травмирования потому что бранши пинцета полукруглой сетчатой формы. Это дает возможность беспрерывному происхождению образования бластоцист и получению полноценных доз бластоцист, заполненных бластомерными стволовыми клетками. Цель достигается тем, что способ взятия бластоцист выполняется массажированием полового пояска дождевого червя полукруглыми сетчатой формы браншами, крепящимися к браншам пинцета, имеющего присоску с емкостью для сбора бластоцист (фиг.2).

Поставленный анализ с прототипом показывает, что заявленный способ отличается выполнением:

1) упрощением технологии получения бластоцист от дождевых червей массажированием полового пояска полукруглыми сетчатой формы браншами пинцета, что исключает травмирование полового пояска и болевые, тактильные, стрессовые факторы.

2) Пинцет имеет вакуумную присоску с емкостью для сбора получаемых бластоцист, находящихся в стадии бластомерного деления.

3) Емкость для собранных бластоцист градуирована и из криоустойчивого светопроводного материала, пригодная для длительного хранения бластоцист в жидком азоте (-196°С)

Способ получения бластоцист от дождевых червей осуществляется с помощью устройства, изображенного на фиг.1.

На фиг.1 (пинцет) изображено устройство для получения бластоцист: сетчатые полукруглые бранши 1, фиксаторы для присоски 2, рукоятка 3.

На фиг.2 (присоска с емкостью для собранных бластоцист) изображены: корпус 4, изгиб корпуса 5, емкость для бластоцист 6, резиновая груша 7, ограничители 8.

Способ получения бластоцист у дождевых червей состоит из свободного движения червей по деревянной столешнице. Предлагаемым пинцетом охватываем половой поясок червя, одновременно сдавливая бранши пинцета, и легким надавливанием на резиновую грушу вакуумного устройства с емкостью набираем выделившуюся сливкообразную жидкость из полового пояска дождевого червя.

Результаты получения бластоцист от дождевых червей отражены в таблице.

Таблица
Эффективность различных способов получения бластоцист от дождевых червейСпособ массажирования полового пояскаБластоцист (всего)Результаты микроскопирования в 3-х полях зрения в первые 2 минуты после взятия полноценных бластоцистчисло%Пинцетом
Сбор глазной пипеткой181055,5Пинцетом с вакуумной присоской с емкостью для замораживания и с полукруглыми сетчатыми браншами211780,9

Из таблицы видно, что после взятия бластоцист у дождевых червей предлагаемым способом в полях зрения с мгновенно делящимися бластомерами было обнаружено на 25,4% бластоцист больше, чем в контрольной группе, когда дождевые черви, находясь в стадии плодоношения, не подвергались стрессовым фактором при взятии бластоцист. Но и в опытной группе было собрано вакуумированием в емкость на 70% больше, чем в контрольной группе испытуемых способов.

В стадии плодоношения дождевые черви не подвергались стрессовым факторам при взятии бластоцист. Но и в опытной группе было собрано вакуумированием в емкость на 70% больше, чем в контрольной группе испытуемых способов.

Использованная литература

1. Bartles k. Sekton J. Jowa State Univers Veterin fssue, 1973. 35.2.56-58.

2. Chang M, nature 1951, 168, 697.

3. Broxmeyer HE, Douglas GW, Hngoc G, Cooper S, Bard J, English D, et al. Human umbilical a potentional sourse of transplantable hematopoietic stem/progenitor cells. Proc Nati Acad Sci US 1989; 86: 3828-32.

4. Broxmeyer HE, Gluckman E, Auerbach A, Douglas GW, Fridman H, Cooper S, et al. Human cord blood: a clinicallyuseful sourse jf transplantable hematopoietic stem/progenitor cells Cell Cloning 1990; 8 Suppi 1:76-91.

5. Волчков. "Закономерность поражения и восстановление стволовых клеток кроветворной ткани при старении облучении биологических объектов" Автореферат доктора медицинских наук шифр 030001. Ленинград, 1991, с.229.

Способ относится к области ветеринарии. Способ включает предварительное фиксирование пинцетом органа у животного с последующим извлечением жидкости с наличием бластоцист. При этом взятие бластоцист выполняют массажированием полового пояска червей полукруглыми сетчатыми браншами пинцета, на котором зафиксирована присоска с градуированной емкостью для сбора бластоцист, выполненная из криоустойчивого светопроводного материала, пригодная для длительного хранения бластоцист в жидком азоте (-196°С). Способ нетрудоемок, позволяет исключить стрессовые, болевые и тактильные факторы у дождевых червей при взятии жизнеспособных бластоцист. 2 ил., 1 табл.

Способ получения бластоцист от дождевых червей путем предварительного фиксирования пинцетом органа у животного, последующим извлечением жидкости с наличием бластоцист, отличающийся тем, что взятие бластоцист выполняют массажированием полового пояска червей полукруглыми сетчатыми браншами пинцета, на котором зафиксирована присоска с градуированной емкостью для сбора бластоцист, выполненная из криоустойчивого светопроводного материала, пригодная для длительного хранения бластоцист в жидком азоте (-196°С).