СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ В СЕМЕНАХ ЛЬНА МЕТОДОМ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ Российский патент 2009 года по МПК G01N33/02 

Изобретение относится к способу оценки качества масличной культуры - льна, применяемого в медицинской, косметической, кондитерской отраслях и комбикормовой промышленности.

Известный способ оценки качества льна [ГОСТ 10582 - 76 «Семена льна масличного. Промышленное сырье. Технические условия»] является методом определения кислотного числа жира [ГОСТ Р 52466-2005. Зерно и продукты его переработки. Метод определения кислотного числа жира. М.: Стандартинформ, 2006], который характеризует количество свободных жирных кислот, образованных при реакции окисления.

Недостатками данного способа оценки качества семян льна являются невозможность определения главных инициаторов реакции цепного окисления липидов - свободных радикалов, которые обычными методами химического анализа не могут быть определены из-за их неустойчивости в биохимических системах, а также длительность проведения испытаний и высокий расхода дорогостоящих реактивов.

Наиболее близким по технической сущности и достигнутому эффекту является способ количественной оценки свободных радикалов в пшеничных зародышах методом хемилюминесценции [Патент РФ №2284027, МПК⁵¹ G01N 21/76, (2006.01)], предусматривающий приготовление экстракта пшеничных зародышей, для получения которого смешивали измельченный исследуемый образец с фосфатным буфером с рН=7,5, далее с сульфатом железа (II) и перекисью водорода, и определение интенсивности хемилюминесценции, светосуммы и тангенса угла наклона кинетической кривой. Метод хемилюминесценции перекисью водорода с сульфатом железа (II), применяющийся в количественной оценке свободных радикалов для выявления перекисного окисления липидов в пшеничных зародышах, основан на том, что в представленной системе происходит каталитическое разложение перекиси с ионами металла с переходной валентностью - двухвалентным железом по реакции Фентона; образующиеся при этом свободные радикалы (R^•, OH^•,^{RO•, RO₂ •, О₂ •) вступают в процесс инициации свободно-радикального окисления в исследуемом субстрате (пшеничных зародышей), рекомбинация радикалов RO₂ • приводит к образованию неустойчивого тетроксида, распадающегося с выделением кванта света.}

Недостатком этого способа является то, что его невозможно использовать для анализа семян льна.

Технической задачей изобретения является разработка способа количественной оценки свободных радикалов в семенах льна методом хемилюминесценции, позволяющего своевременно обнаружить процессы, вызывающие порчу семян льна при хранении.

Способ количественной оценки свободных радикалов в семенах льна методом хемилюминесценции характеризуется тем, что в качестве объекта исследования используют экстракт семян льна, для получения которого лен измельчают до размера частиц 0,01-0,5 мм, перемешивают с фосфатным буфером с рН=7,5 в соотношении 1:10 в течение 1 часа 30 минут, после чего отделяют центрифугированием при частоте вращения ротора 6000 мин^-1 в течение 30 минут фильтрат, представляющий собой экстракт льна, и анализируют его, для чего в измерительную кювету вносят 0,1 мл экстракта, 0,4 мл фосфатного буфера (рН=7,5), 0,4 мл раствора сульфата железа (II), 0,2 мл перекиси водорода, при этом считают, что тангенс угла наклона кинетической кривой характеризует ингибирующую способность самого продукта, и чем выше максимальное значение интенсивности хемилюминесценции, тем больше свободных радикалов в семенах льна.

Технический результат заключается в своевременном обнаружении процессов, вызывающих порчу семян льна при хранении методом хемилюминесценции.

На чертеже представлена типичная кинетическая кривая развития хемилюминесценции для семян льна, сопровождающей процесс свободно-радикального перекисного окисления липидов.

Способ осуществляют следующим образом. При приготовлении исследуемого образца лен измельчают до размера частиц 0,01-0,5 мм, затем просеивают через сито и смешивают с фосфатным буфером (рН=7,5) в соотношении 1:10 и встряхивают в течение 1 часа 30 мин. Затем центрифугируют в течение 30 минут при частоте вращения ротора 6000 мин^-1. Фильтрат, представляющий собой экстракт семян льна, анализируют на биохемилюминометре БХЛ-07. Для этого в измерительную кювету вносят 0,1 мл исследуемого образца, 0,4 мл фосфатного буфера (рН=7,5), 0,4 мл раствора сульфата железа (II). Затем быстро вносят 0,2 мл перекиси водорода и переводят кювету в измерительное положение. В течение 40 секунд регистрируют показания хемилюминесценции. На информационной карте высвечивается чертеже, где показаны максимальное значение интенсивности хемилюминесценции (I_max), светосумма S(t) и тангенс угла (α) наклона кинетической кривой.

Для оценки свободно-радикального окисления в пробе наиболее значимыми являются параметры I_max - максимальное значение интенсивности хемилюминесценции (мВ) - характеризует перекисные процессы в продукте. Чем выше показатель I_max, тем больше свободных радикалов в продукте и интенсивнее перекисное окисление липидов. Параметр tg α - тангенс угла наклона кинетической кривой - характеризует ингибирующую способность самого продукта. Чем больше этот показатель, тем выше ингибирующая способность продукта. Параметр S - светосумма (мВ·сек) - площадь под кинетической кривой развития хемилюминесценции, коррелирует с показателями I_max и tg α.

Способ поясняется следующим примером.

Пример

Семена льна с влажностью 12,1% заложили на опытное хранение при температуре 15°С и относительной влажности воздуха 75%. Каждые 10 дней проверяли показатель кислотного числа продукта по стандартной методике и показатели хемилюминесценции, определяющиеся по методике следующим образом: при приготовлении исследуемого образца лен измельчают до размера частиц 0,01-0,5 мм, затем просеивают через сито и смешивают с фосфатным буфером (рН=7,5) в соотношении 1:10 и встряхивают в течение 1 часа 30 мин. Затем центрифугируют в течение 30 минут при частоте вращения ротора 6000 мин^-1. Фильтрат, представляющий собой экстракт семян льна, анализируют на биохемилюминометре БХЛ-07. Для этого в измерительную кювету вносят 0,1 мл исследуемого образца, 0,4 мл фосфатного буфера (рН=7,5), 0,4 мл раствора сульфата железа (II). Затем быстро вносят 0,2 мл перекиси водорода и переводят кювету в измерительное положение. В течение 40 секунд регистрируют показания хемилюминесценции. На информационной карте высвечивается чертеже, где показаны максимальное значение интенсивности хемилюминесценции (I_max), светосумма S(t) и тангенс угла (α) наклона кинетической кривой.

Каждый опыт проводили в 4-5-кратной повторности. Результаты исследований представлены в таблице.

Время хранения, сутПоказатели качестваКислотное число, мг КОН/гI_max,(мВ)tg αS,(мВ·сек)Начало0,31,2820,73212,552100,951,5430,63413,795202,262,1510,52114,325304,472,8420,43218,297407,543,9310,35420,324508,634,7230,29525,126

При изучении изменения традиционного показателя качества семян льна установлено, что кислотное число постоянно росло, и к концу второго месяца его значение увеличилось в холодильнике на 8,33 мг КОН/г. Причем в течение первого месяца наблюдался интенсивный рост кислотного числа, т.е. за первые 30 суток значение кислотного числа увеличилось на 4,17 мг КОН/г, за следующие 20 суток - на 4,16 мг КОН/г.

Заложенный на хранение продукт исследовали на приборе биохемилюминометре БХЛ-07 для определения интенсивности перекисного окисления в семенах льна и их ингибирующей способности. При хранении семян льна интенсивность перекисного окисления (I_max) на начало составила 1,282 мВ, за полтора месяца хранения она увеличилась до 4,723 мВ. Ингибирующая способность продукта (tg α) за тот же период хранения снизилась с 0,732 до 0,295. Значение S увеличилось с 12,552 до 25,126 мВ·сек. За первые 30 суток хранения значение I_max увеличилось на 1,560 мВ, в то время как ингибирующая способность tg α снизилась на 0,300, а значение S выросло на 5,745 мВ·сек; в период с 30 суток по 60 сутки интенсивность перекисного окисления выросла на 1,881 мВ, значение S - на 6,829 мВ·сек, a tg α уменьшился на 0,137.

Таким образом, предложенный способ количественной оценки свободных радикалов в семенах льна методом хемилюминесценции является более точным, экспрессным и позволяет своевременно обнаружить процессы, вызывающие порчу продукта при хранении.

Изобретение относится к масложировой промышленности. В качестве объекта исследования используют экстракт семян льна, для получения которого лен измельчают до размера частиц 0,01-0,5 мм, перемешивают с фосфатным буфером с рН=7,5 в соотношении 1:10 в течение 1 часа 30 минут, после чего отделяют центрифугированием при частоте вращения ротора 6000 мин^-1 в течение 30 минут фильтрат, представляющий собой экстракт льна. Анализируют экстракт, для чего в измерительную кювету вносят 0,1 мл экстракта, 0,4 мл фосфатного буфера (рН=7,5), 0,4 мл раствора сульфата железа (II), 0,2 мл перекиси водорода, при этом считают, что тангенс угла наклона кинетической кривой характеризует ингибирующую способность самого продукта, и чем выше максимальное значение интенсивности хемилюминесценции, тем больше свободных радикалов в семенах льна. Изобретение позволяет разработать более точный и экспрессный способ, который способствует своевременному обнаружению процессов, вызывающих порчу семян льна при хранении. 1 ил., 1 табл.

Способ количественной оценки свободных радикалов в семенах льна методом хемилюминесценции, характеризующийся тем, что в качестве объекта исследования используют экстракт семян льна, для получения которого лен измельчают до размера частиц 0,01-0,5 мм, перемешивают с фосфатным буфером с рН=7,5 в соотношении 1:10 в течение 1 ч 30 мин, после чего отделяют центрифугированием при частоте вращения ротора 6000 мин^-1 в течение 30 мин фильтрат, представляющий собой экстракт льна, и анализируют его, для чего в измерительную кювету вносят 0,1 мл экстракта, 0,4 мл фосфатного буфера (рН=7,5), 0,4 мл раствора сульфата железа (II), 0,2 мл перекиси водорода, при этом считают, что тангенс угла наклона кинетической кривой характеризует ингибирующую способность самого продукта, и чем выше максимальное значение интенсивности хемилюминесценции, тем больше свободных радикалов в семенах льна.