СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ КРОВИ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии медицины и клинико-лабораторной диагностике, и может быть использовано для установления степени тяжести патологического процесса, прогнозирования его течения и для контроля за терапией антиоксидантными препаратами.

Известен способ определения перекисных соединений (авт. свидетельство СССР N 1749795 G 01 N 21/76), который заключается в том, что после добавления к исследуемому субстрату щелочного раствора люминола с растворенной в нем навеской гемина (катализатор распада перекисных соединений по свободно-радикальному механизму) осуществляют регистрацию хемилюминесценции (ХЛ) полученной смеси, а затем по величине ее интенсивности определяют перекисные соединения, оценивая их концентрацию в эквивалентах относительно перекиси водорода.

Однако этот способ требует большого (15 мл) объема исследуемой пробы, что ограничивает его применение с целью определения перекисных соединений в таких биологических жидкостях, как плазма и сыворотка крови пациента.

Кроме того, данный способ предполагает построение калибровочного графика, величина измеряемого сигнала ХЛ - концентрация перекиси водорода и проведение для этого достаточно трудоемких предварительный операций.

Известен также хемилюминесцентный способ исследования перекисного окисления в суспензии митохондрий (Суслова Т.Б., Оленев В.И., Владимиров Ю. А. Биофизика, 1969, - 14. - 750 или Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. - М., "Наука", 1972, 249 с.), который заключается в том, что осуществляют регистрацию свечения суспензии митохондрий из печени крысы в буферном растворе после добавления в смесь соли двухвалентного железа.

Однако этот способ трудоемок, пригоден только для экспериментальной медицины и не используется в клинической практике.

Наиболее близким аналогом к заявляемому способу является способ определения гиперлипопротеидемии (авт. свидетельство СССР N 1255925 G 01 N 33/49). Способ заключается в изменении интегральной интенсивности процессов перекисного окисления липидов сыворотки крови и их комплексов с помощью индуцированной ХЛ с последующим электрофоретическим выявлением гиперлипопротеидемий. При этом ХЛ инициируют 1% раствором гидроперекиси третичного бутила и 10 мМ раствором ионов двухвалентного железа. Для оценки интенсивности перекисного окисления липидов определяли уровень светосуммы. При определенных значениях этого показателя проводили электрофоретическое исследование.

Данный способ не обладает достаточной точностью, так как в процессе работы происходит окисление железа, находящегося в растворе, и происходит падение амплитуды пика ХЛ и, следовательно, величины светосуммы.

Кроме того, данный способ не предполагает определение амплитуды пика ХЛ, которая также является информативным показателем, характеризующим интенсивность процессов перекисного окисления липидов.

Задачей заявляемого способа является усовершенствование способа, свободного от названных недостатков.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе определения перекисного окисления липидов крови, включающем подготовку исследуемых проб крови пациента и реактивов: растворов сульфата железа, перекиси водорода, фосфатного буфера pH 7,5, смешивание проб с реактивами, регистрацию шумового сигнала и ХЛ полученной смеси с определением величины светосуммы ХЛ, в качестве исследуемой фракции крови используют цитратную бестромбоцитарную плазму крови пациента, подготовку раствора сульфата железа осуществляют растворением его в кипящей воде, центрифугируют раствор в герметично закрытой посуде с последующим перенесением супернатанта в другую пробирку и помещением последнего под слой химически инертного масла, для оценки интенсивности процессов перекисного окисления липидов крови определяют также величину амплитуды пика ХЛ.

Кроме того, сущностью изобретения являются варианты осуществления его в последовательности введения компонентов смеси: сначала в буферный раствор вводят исследуемую плазму, затем раствор сульфата железа и после включения регистрации сигнала свечения вводят раствор перекиси водорода.

Другим усовершенствованием заявляемого способа являются условия его проведения, а именно введение раствора перекиси водорода в кювету осуществляют в условиях темноты после помещения кюветы в светонепроницаемую измерительную камеру хемилюминометра дозатором, имеющим на наконечнике чехол из светоизолирующего материала и препятствующим доступу света в измерительную камеру до окончания исследования, т.к. дозатор остается в гнезде измерительной камеры до окончания реакции.

Кроме того заявляется режим приготовления фосфатного буфера к реакции ХЛ: проводят центрифугирование приготовленного фосфатного буфера с последующим перенесением супернатанта в другую посуду.

Заявляемый способ заключается в следующем. Проводят взятие крови пациента в количестве 1 - 1,5 мл и смешивают с 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9: 1. Полученную стабилизированную кровь центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин, затем полученную богатую тромбоцитами цитратную плазму крови пациента центрифугируют 20 мин при 5000 об/мин. Для исследования отбирают верхний слой - цитратную бестромбоцитарную плазму. Затем приготавливают реактивы, необходимые для проведения анализа.

1. 0,01 мМ раствор FeSO₄ готовят растворением навески 0,035 г в 12,5 мл кипящей (для удаления кислорода) дистиллированной воды. Полученный раствор центрифугируют при 1000 об/мин в герметично закрытой посуде, затем супернатант переносят в другую пробирку и помещают под слой химически инертного масла, например вазелинового, для предотвращения доступа кислорода. Раствор сульфата железа готовят непосредственно перед проведением анализа и не используют на следующий день.

2. Фосфатный буфер готовят растворением навесок KH₂PO₄ - 1,362 г и KCl - 3,9144 г в 500 мл дистиллированной воды. До необходимой величины pH 7,5 буфер доводят с помощью таблетированной формы KOH. Буфер хранят при +4^oC. Необходимое для одного дня работы количество буфера центрифугируют при 1000 об/мин, прозрачный супернатант переносят в другую посуду.

3. 2% раствор перекиси водорода готовят разведением 2 мл стандартного пергидроля 28 мл дистиллированной воды. Хранят при +4^oC в посуде темного стекла не более 2-х недель.

Способ осуществляют в следующей последовательности и при следующих режимах.

Исследование процессов перекисного окисления липидов проводят методом ХЛ. Перед исследованием каждой пробы проводят регистрацию шумового сигнала.

В кювету вносят 0,4 мл фосфатного буфера, 0,1 мл исследуемой плазмы пациента и 0,4 мл раствора сульфата железа. Кювету помещают в светозащищенную измерительную камеру хемилюминометра. Включают регистрацию сигнала свечения, после чего в условиях темноты в кювету вносят 0,2 мл раствора перекиси водорода дозатором, на наконечник которого надет чехол из светоизолирующего материала и который препятствует доступу света в измерительную камеру до окончания исследования, причем дозатор не вынимают из гнезда камеры до окончания реакции. Регистрацию сигнала свечения каждой пробы ведут в течение 60 с. При анализе кривой ХЛ определяют амплитуду пика ХЛ, по которым судят об интенсивности процессов перекисного окисления липидов плазмы крови. Определение повторяют 3 - 4 раза и вычисляют средние значения параметров ХЛ.

Способ апробирован в условиях Саратовского НИИ кардиологии и дал положительные результаты.

Технико-экономический эффект заявляемого способа заключается в повышении точности проводимых исследований крови, поскольку используют более стабильный в силу предотвращения окисления раствор сульфата железа, что обеспечивает высокую воспроизводимость результатов и повышает корректность измерения; исследование проводят в условиях темноты, что препятствует искажению сигнала за счет внешних источников света; снимают два параметра ХЛ, что увеличивает информативность и объективность способа.

Кроме того, использование цитратной бестромбоцитарной плазмы крови пациента переводит способ в разряд экономичных, целесообразных, щадящих способов исследования, повышает уровень культуры производства медицинских исследований и технологий, так как позволяет обойтись без специального взятия крови и совместить, например, данное исследование с коагулологическими, иммунологическими и другими исследованиями, объектом которых является плазма крови пациента.

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии и клинико-лабораторной диагностике. Способ включает подготовку исследуемых проб крови пациента и реактивов: растворов сульфата железа, перекиси водорода, фосфатного буфера рН 7,5, смешивание проб с реактивами, регистрацию шумового сигнала и хемилюминесценции (ХЛ) полученной смеси с определением величины светосуммы ХЛ; в качестве исследуемой фракции крови используют цитратную бестромбоцитарную плазму крови пациента; подготовку раствора сульфата железа осуществляют растворением его в кипящей воде; центрифугируют раствор в герметично закрытой посуде с последующим перенесением супернатанта в другую пробирку и помещением последнего под слой химически инертного масла; для оценки интенсивности процессов перекисного окисления липидов крови определяют также величину амплитуды пика ХЛ. Кроме того, последовательность введения компонентов смеси следующая; сначала в буферный раствор вводят исследуемую плазму, затем раствор сульфата железа и после включения регистрации сигнала свечения вводят раствор перекиси водорода; условия проведения способа: введение раствора перекиси водорода в кювету осуществляют в условиях темноты после помещения кюветы в светонепроницаемую измерительную камеру хемилюминометра дозатором, имеющим на наконечнике чехол из светоизолирующего материала, причем дозатор не вынимают из гнезда камеры до окончания реакции. Приготовление фосфатного буфера к реакции ХЛ проводят центрифугированием приготовленного буфера с последующим перенесением супернатанта в другую посуду. Способ обеспечивает повышение точности определения. 4 з.п. ф-лы.

1. Способ определения перекисного окисления липидов крови пациента, включающий подготовку исследуемых проб крови пациента и реактивов: растворов сульфата железа, перекиси водорода, фосфатного буфера pH 7,5, смешивание проб с реактивами, регистрацию шумового сигнала и хемилюминесценции (ХЛ) полученной смеси с определением величины светосуммы ХЛ, отличающийся тем, что в качестве исследуемой фракции крови используют цитратную бестромбоцитарную плазму пациента, подготовку раствора сульфата железа осуществляют растворением его в кипящей воде, центрифугируют раствор в герметично закрытой посуде с последующим перенесением супернатанта в другую пробирку и помещением последнего под слой химически инертного масла, для оценки интенсивности процессов перекисного окисления липидов крови определяют также величину амплитуды пика ХЛ. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что введение компонентов в реакцию осуществляют в следующей последовательности: в кювету с буферным раствором вводят исследуемую плазму, затем раствор сульфата железа и включают регистрацию сигнала свечения, после чего вводят раствор перекиси водорода. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что введение раствора перекиси водорода в кювету осуществляют в условиях темноты после помещения кюветы в светонепроницаемую измерительную камеру хемилюминометра. 4. Способ по п.1 или 3, отличающийся тем, что введение раствора перекиси водорода в кювету осуществляют дозатором, на наконечник которого надет чехол из светоизолирующего материала, и после внесения раствора перекиси водорода дозатор не вынимают из гнезда измерительной камеры до окончания исследования. 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что подготовку фосфатного буфера проводят центрифугированием с последующим перенесением супернатанта в другую посуду.