СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ В ПШЕНИЧНЫХ ЗАРОДЫШАХ МЕТОДОМ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ Российский патент 2006 года по МПК G01N21/76 

Изобретение относится к способу оценки качества пшеничных зародышей, применяемых в медицинской, косметической, кондитерской отраслях промышленности, продуктах детского и диетического питания.

Известным способом оценки качества пшеничных зародышей (ТУ 9295-027-00932169-2000 "Хлопья зародыша пшеничного") является метод определения кислотного числа (ГОСТ Р 52110-2003. Масла растительные. Методы определения кислотного числа. М.: Изд-во стандартов, 2003), который характеризует количество продуктов, образованных при реакции окисления.

Недостатками данного способа оценки качества зародышевого продукта являются невозможность определения главных инициаторов реакции цепного окисления липидов - свободных радикалов, которые обычными методами химического анализа не могут быть определены из-за их неустойчивости в биохимических системах, а также длительность проведения испытаний и высокий расход дорогостоящих реактивов.

Наиболее близким по технической сущности и достигнутому эффекту является способ определения интенсивности процесса перекисного окисления липидов методом индуцированной хемилюминесценции ["Определение интенсивности свободнорадикальных процессов у здоровых и больных людей" (Биохемилюминесценция // Сб. под ред. Журавлева А.И. - М.: Наука. - 1983. - С.3-30)], предусматривающий смешивание исследуемого образца с фосфатным буфером с рН 7,5, сульфатом железа (II) и перекисью водорода и определение интенсивности хемилюминесценции, светосуммы и тангенса угла наклона кинетической кривой. Метод индуцирования хемилюминесценции перекисью водорода с сульфатом железа (II), применяющийся в клинической биохимической лаборатории для выявления нарушений перекисного окисления липидов в организме при оценке патологического состояния больных в медицине, основан на том, что в представленной системе происходит каталитическое разложение перекиси с ионами металла с переходной валентностью - двухвалентным железом по реакции Фентона; образующиеся при этом свободные радикалы (R^•, ОН^•, RO^•, RO₂ ^•, O₂ ^•) вступают в процесс инициации свободнорадикального окисления в исследуемом биологическом субстрате (моче, слюне, крови), рекомбинация радикалов RO₂ ^• приводит к образованию неустойчивого тетроксида, распадающегося с выделением кванта света.

Недостатком этого способа является то, что его невозможно использовать для анализа качества растительных тканей, в частности пшеничных зародышей.

Технической задачей изобретения является разработка способа количественной оценки свободных радикалов в пшеничных зародышах методом хемилюминесценции для определения качества пшеничных зародышей.

Техническая задача достигается тем, что в способе количественной оценки свободных радикалов в пшеничных зародышах методом хемилюминесценции, включающем смешивание исследуемого образца с реагентами и определение интенсивности хемилюминесценции, светосуммы и тангенса угла наклона кинетической кривой, новым является то, что в качестве исследуемого образца используют экстракт пшеничных зародышей, для получения которого пшеничные зародыши измельчают до размера частиц 0,01-1,00 мм, перемешивают с фосфатным буфером с рН 7,5 в соотношении 1:10 в течение 30 минут, после чего отделяют фильтрат, представляющий собой экстракт пшеничных зародышей, центрифугированием при частоте вращения ротора 5000 мин^-1 в течение 20 минут и анализируют, для чего в измерительную кювету вносят 0,1 мл экстракта, 0,4 мл фосфатного буфера (рН 7,5), 0,4 мл раствора сульфата железа (II).

Технический результат заключается в том, что разработанный способ количественной оценки свободных радикалов в пшеничных зародышах методом хемилюминесценции применяют для определения качества пшеничных зародышей.

Способ осуществляют следующим образом. При приготовлении исследуемого образца пшеничные зародыши измельчают до размера частиц 0,01-1,00 мм, затем измельченные пшеничные зародыши смешивают с фосфатным буфером (рН 7,5) в соотношении 1:10 и встряхивают в течение 30 минут. Затем центрифугируют в течение 20 минут при частоте вращения ротора 5000 мин^-1. Фильтрат, представляющий собой экстракт пшеничных зародышей, анализируют на биохемилюминометре БХЛ-06. Для этого в измерительную кювету вносят 0,1 мл исследуемого образца, 0,4 мл фосфатного буфера (рН 7,5), 0,4 мл раствора сульфата железа (II). Затем быстро вносят 0,2 мл Н₂О₂ и переводят кювету в измерительное положение. В течение 40 секунд регистрируют показания хемилюминесценции. На информационной карте высвечивается максимальное значение интенсивности хемилюминесценции, светосумма и тангенс угла наклона кинетической кривой.

На чертеже представлена типичная кинетическая кривая развития хемилюминесценции, сопровождающей процесс свободнорадикального перекисного окисления липидов мембран.

Она включает следующие стадии: "быструю вспышку" хемилюминесценции (I) и латентный период (II). Параметр I_max - максимальное значение интенсивности хемилюминесценции характеризует перекисные процессы в продукте. Чем выше показатель I_max, тем больше свободных радикалов в продукте и интенсивнее перекисное окисление липидов. Параметр tgα - тангенс угла наклона кинетической кривой характеризует ингибирующую способность самого продукта. Чем больше этот показатель, тем выше ингибирующая способность продукта. Параметр S - светосумма - площадь под кинетической кривой развития хемилюминесценции коррелирует с показателями I_max и tgα.

Пример. Продукт с влажностью 8,2% и содержанием липидов 10,2% заложили на опытное хранение при температуре 15°С и относительной влажности воздуха 75%. Каждые 15 дней проверяли показатель кислотное число продукта по стандартной методике и показатели хемилюминесценции. Каждый опыт проводили в 4-5 кратной повторности. Результаты исследований представлены в таблице.

Время хранения, сутПоказатели качестваКислотное число, мг КОН/гI_maxtgαSНачало5,553,2922,34637,161513,903,7882,08644,453021,854,6851,66252,354529,805,4281,19662,126040,056,5340,89475,167544,256,9860,78680,039047,057,5240,57785,22

При изучении изменения традиционного показателя качества пшеничных зародышей установлено, что кислотное число постоянно росло и к концу третьего месяца его значение увеличилось на 41,5 мг КОН/г. Причем в течение первых двух месяцев наблюдался интенсивный рост кислотного числа, т.е. за первые 30 суток значение кислотного числа увеличилось на 16,3 мг КОН/г, за вторые 30 суток - на 18,2 мг КОН/г, а за последние - только на 7 мг КОН/г.

Заложенный на хранение продукт исследовали на приборе БХЛ-06 для определения интенсивности перекисного окисления в пшеничных зародышах и их ингибирующей способности. При хранении пшеничных зародышей интенсивность перекисного окисления (I_max) на начало составила 3,292, за три месяца хранения она увеличилась до 7,594. Ингибирующая способность продукта (tgα) за тот же период хранения снизилась с 2,346 до 0,577. Значение S увеличилось с 37,16 до 85,22. За первые 30 суток хранения значение I_max увеличилось на 1,393, в то время как ингибирующая способность tgα снизилась на 0,684, а значение S выросло на 15,19; в период с 30 суток по 60 сутки интенсивность перекисного окисления выросла на 1,849, значение S - на 22,84, а tgα уменьшился на 0,768; за последние 30 суток разница ΔI_max между 90 и 60 сутками составила 0,99, ΔS - 10,06, а значение tgα снизилось на 0,317.

Таким образом, предложенный способ количественной оценки свободных радикалов в пшеничных зародышах методом хемилюминесценции позволяет адекватно оценить качество пшеничных зародышей.

Изобретение относится к измерительной технике. В способе в качестве исследуемого образца используют экстракт пшеничных зародышей, для получения которого пшеничные зародыши измельчают до размера частиц 0,01-1,00 мм, перемешивают с фосфатным буфером с рН7,5 в соотношении 1:10 в течение 30 минут, после чего отделяют фильтрат, представляющий собой экстракт пшеничных зародышей, центрифугированием при частоте вращения ротора 5000 мин^-1 в течение 20 минут и анализируют, для чего в измерительную кювету вносят 0,1 мл экстракта, 0,4 мл фосфатного буфера (рН7,5), 0,4 мл раствора сульфата железа (II). Технический результат - обеспечение возможности определения качества пшеничных зародышей. 1 ил.

Способ количественной оценки свободных радикалов в пшеничных зародышах методом хемилюминесценции, включающий смешивание исследуемого образца с реагентами и определение интенсивности хемилюминесценции, светосуммы и тангенса угла наклона кинетической кривой, отличающийся тем, что в качестве исследуемого образца используют экстракт пшеничных зародышей, для получения которого пшеничные зародыши измельчают до размера частиц 0,01-1,00 мм, перемешивают с фосфатным буфером с рН=7,5 в соотношении 1:10 в течение 30 мин, после чего отделяют фильтрат, представляющий собой экстракт пшеничных зародышей, центрифугированием при частоте вращения ротора 5000 мин^-1 в течение 20 мин и анализируют, для чего в измерительную кювету вносят 0,1 мл экстракта, 0,4 мл фосфатного буфера (рН=7,5), 0,4 мл раствора сульфата железа (II), при этом считают, что тангенс угла наклона кинетической кривой характеризует ингибирующую способность самого продукта и чем выше максимальное значение интенсивности хемилюминесценции, тем больше свободных радикалов в продукте.