СРЕДСТВО, ПОВЫШАЮЩЕЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКУЮ СОПРОТИВЛЯЕМОСТЬ ОРГАНИЗМА К БАКТЕРИАЛЬНЫМ ЭНДОТОКСИНАМ Российский патент 2009 года по МПК A61K36/04 A61P31/00 

Изобретение относится к области создания средств растительного происхождения, повышающих неспецифическую сопротивляемость (резистентность) организма к действию эндотоксинов грамотрицательных бактерий, инициирующих развитие эндотоксинемии.

Эндотоксинемия, эндотоксический шок, сепсис представляют собой наиболее серьезную проблему инфекционной патологии человека и являются результатом тяжелого осложнения грамотрицательных инфекций. Связь между грамотрицательными бактериями такими, как Escherichia coli, Proteus, Pseudomonas, Enterobacter, Moraxella, Salmonella и сепсисом и эндотоксинемией выявлялась в течение многих лет. Было установлено, что от сепсиса ежегодно умирают 1400 пациентов во всем мире [The Barcelona declaration Health care professionals set sepsis in their sight. Infectious Diseases in Children. 2002. V.12. P.15]. У 79% пациентов больных сепсисом проявляется эндотоксинемия.

Эндотоксинемия и септический шок - комплексный синдром, обозначающий прежде всего проникновение в тело, кровь, стерильные ткани, спинномозговую жидкость, бронхиальную слизь, мочу патогенных или условно-патогенных бактерий [Cavaillon J-M. J.Endotoxin Research 2006. V.12. N 3. Р.151-169]. Возникают эти осложнения в результате накопления в организме хозяина эндотоксинов - липополисахаридов (ЛПС), которые, высвобождаясь из клеток бактериального патогена, действуют практически на все системы организма высших животных и являются индуктором целого каскада патофизиологических реакций с вовлечением в них различных биологических медиаторов и систем макроорганизма, приводя к различным патологическим эффектам, ухудшающим состояние и в значительной мере определяющим тяжесть клинического состояния больного [Jacobs E. Handbook of endotoxin, 1985. V.2. P.1-10].

Бактериальный эндотоксин - ЛПС - является основным структурным компонентом наружной мембраны грамотрицательных бактерий. Эндотоксины различных бактериальных групп различаются по структуре, но при этом все они построены по подобному структурному принципу. Химическая структура ЛПС из E.coli типична для всех эндотоксинов, и его молекулы включают три различные по составу и принципу построения, связанные между собой области: гидрофобный липид А, "кор" и O-специфический полисахарид. Липидный компонент является наиболее консервативным участком молекулы ЛПС и является носителем его токсических свойств [Rietschel Curr.Top.Microbiol.Immunol. 1996, V.216. P.39-81]. Патогенная активность ЛПС при его избытке, когда возможности защитных сил организма истощены, проявляется в острых и вялотекущих воспалительных процессах. Лечение в этих случаях только антибиотиками становится недостаточным, а иногда и вредным. Это позволяет рассматривать средства, направленные на повышение неспецифической резистентности организма к действию бактериальных эндотоксинов как чрезвычайно важные в системе профилактики и лечения инфекционных осложнений.

При выборе препаратов антибактериального действия важно отсутствие у них побочных эффектов на макроорганизм. Такому требованию отвечают природные вещества, способные усиливать сопротивляемость организма к действию эндотоксинов и восстанавливать работу его иммунной системы.

Установлено, что фосфолипиды, в том числе и природные, являются активным средством подавления эндотоксинемии [RU 2174839 С2, 27.03.2007]. Показано, что при введении в организм фармацевтической композиции, в состав которой входит фосфолипид, наблюдается подавление токсичности, вызванной эндотоксинами, и происходит удаление эндотоксинов из организма при различных отравлениях.

Известно, что β-глюкан, выделенный из оболочки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, при введении внутрибрюшинно экспериментальным мышам, вызывает прямое усиление неспецифической резистентности организма к инфекциям, обусловленным грамотрицательными бактериями (E.coli, P.aerruginosa, Klebsiella pneumonia. Bordello bronchiseptica) [Beahr R. Allerg.Immunol. 1989. V.35. P. 59-64].

Описано действие β-глюкана из зеленой травы Astragalus membranaceus на организм новорожденных поросят на фоне ЛПС. Показано, что под действием этого полисахарида в концентрации 500 мгк/кг происходит снижение содержания кортикостероидов в крови, что свидетельствует о повышении адаптационной возможности организма поросят в условиях эндотоксинемии [Мао XF et al., J. Anim. ScL, 2005,V.12,P.2777-2782].

Ранее нами было установлено, что полисахарид хитозан обладает свойством повышать неспецифическую сопротивляемость организма мышей к действию ЛПС из E.coli [Э.И. Хасина, Ермак и др. Ж. «Эфферентная терапия», 2006, том. 12, №4, с.32-35]. Препарат хитозана вводили внутрижелудочно в виде 1% геля в дозе 100 мг/кг в течение 5 дней до однократной внутрибрюшинной инъекции ЛПС в дозе 1 мг/кг. Хитозан препятствовал инволюции вилочковой железы (тимуса), гипертрофии надпочечников, изменению уровня тиреоидных гормонов и кортикостерона в сыворотке крови, активации гликогенолиза, гликолиза, пероксидации липидов в печени, вызываемых ЛПС E.coli.

В доступной нам литературе нет сведений о влиянии каррагинанов на неспецифическую резистентность организма в условиях интоксикации ЛПС.

Задачей изобретения является расширение арсенала природных лекарственных средств, повышающих неспецифическую сопротивляемость (резистентность) организма к действию бактериальных эндотоксинов.

Задача решена новым средством, повышающим при пероральном применении неспецифическую резистентность организма к бактериальным эндотоксинам, характеризующееся тем, что оно представляет собой смесь k- и λ-каррагинанов в соотношении 3:1, полученную из красной водоросли Chondrus armatus экстракцией водой при температуре 90°С и последующим осаждением этанолом, которая состоит из 33,7% галактозы и 21,5% 3, 6-ангидрогалактозы, содержит 21% сульфатов и 2% белка, имеет интенсивные полосы поглощения в ИК-спектре при 1227, 928 и 846 см^-1, слабые при 820 см^-1 и молекулярную массу в пределах 500,0-550,0 кДа.

Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в создании нового средства, используемого перорально, повышающего устойчивость организма к воздействию эндотоксинов грамотрицательных бактериальных, на примере ЛПС E.coli.

В отличие от хитозана каррагинаны являются общепризнанными пищевыми добавками. Использование каррагинана в пищевых продуктах основано на признании его как "безопасного". Согласно Кодексу пищевой химии, принятому в США, коммерческие образцы пищевого каррагинана должны соответствовать определенным требованиям, главным из которых является молекулярная масса - она не должна быть менее 100 кДа, и количество сульфатных групп - 20-40%. В 1984 г. Объединенный комитет экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам подтвердил безопасность использования каррагинанов в пищу [WHO Food Additives series №19, Toxicological evaluation of certain food-additives contamination, 1984]. В 1999-2000 гг. утверждение об использовании каррагинана было расширено и включало дополнительное использование каррагинана в пищевой и медицинской практике [Food and Drug: 21 C.F.R. 133.178, 133.179, 136. 110, 139.121, 150.141, 150.161, 176.170.2000; Food and Drugs: New Drugs 21. C.F.R. 310.545. 1999]. К настоящему времени установлены структуры около 20 так называемых «идеализированных типов» каррагинанов, различающихся моносахаридным составом, количеством и местоположением сульфатных групп. Каррагинаны разных структурных типов отличаются по физико-химическим характеристикам, физиологической активности и находят различное применение. Структурный тип каррагинана определяется видовой принадлежностью водоросли и условиями ее обитания.

Предлагаемое средство, состоящее из смеси каррагинанов двух структурных типов k- и λ, полностью соответствуют требованиям, предъявляемым к пищевым добавкам и лекарственным средствам, используемым перорально. Получают заявляемое средство простым способом из красной водоросли Chondrus armatus, принадлежащей к виду Chondrus, семейства Gigartinaceae, наиболее распространенном в морях Дальнего Востока (Японское море. Охотское море).

Экспериментально установлено, что заявляемое средство повышает неспецифическую сопротивляемость организма мышей к действию липополисахарида из Е.coli, который имеет структуру, типичную для эндотоксинов грамотрицательных бактерий. В условиях эндотоксинемии, вызванной этим ЛПС, его действие заключается в следующем: средство препятствует инволюции тимуса, гипертрофии надпочечников, изменению уровня тиреоидных гормонов и кортикостерона в сыворотке крови, активации гликогенолиза, гликолиза, пероксидации липидов в печени.

Получение заявляемого средства.

Свежесобранную в Заливе Петра Великого (Японское море), на глубине 10-15 м в августе водоросль Chondrus armatus промывают проточной водой для удаления растворимых солей, обрабатывают ацетоном для удаления пигментов и сушат на воздухе. Высушенную водоросль измельчают и заливают водой (в соотношении 1:30). Экстракцию полисахаридов проводят в течение 4 часов при температуре 90°С при постоянном перемешивании. Полученный экстракт фильтруют, а затем центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 мин. Полисахариды осаждают тройным объемом этанола, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием 4000 об/мин и лиофильно высушивают. Получают целевой продукт с выходом 40% (от веса сухой водоросли).

Препарат, полученный из красной водоросли Chondrus armatus, имеет следующие физико-химические характеристики:

- порошок белого цвета, хорошо растворим в воде;

- нерастворим в хлороформе, ацетоне, эфире, метиловом спирте, этиловом спирте;

- молекулярная масса 500,0-550,0 кДа (определена вискозиметрическим методом и аналитическим центрифугированием).

Вязкость измеряли в модифицированном вискозиметре Убеллоде (СКБ "Пущине", Россия) с диаметром капилляра 0,3 мм в диапазоне концентраций 0,1-1 мг/мл в 0,15 М растворе NaCl. Измерения проводили при температуре 25°С с точностью измерения времени ±0,1 с. Значение характеристической вязкости для смеси каррагинанов вычисляли методом наименьших квадратов путем экстраполяции графика зависимости ln η_отн/С на бесконечное разбавление. Средневесовая молекулярная масса была рассчитана по уравнению Марка-Хаувинка-Куна: [η]=КМ^α, где [η] - характеристическая вязкость, а К и α - эмпирические константы, значения которых по литературным данным для данной системы полимер - растворитель, составляют К=3·10³ и α=0.95 [Rochas С.et al., Carbohydr. Polym., 1990, V.23, P.255-266];

средневесовую молекулярную массу образца с помощью аналитического центрифугирования (500000 дальтон) определяли методом неустановившегося равновесия по Арчибальду [Боуэн. Введение в ультрацентрифугирование. 1978. С.120-126]. В первой части опыта использовали односекторную ячейку с вкладышем 12 мм. Скорость вращения ротора составляла 12000 об/мин. Съемку проводили сразу после достижения ротором постоянной скорости. Вторую часть опыта проводили в границе образующей ячейке. Молекулярный вес рассчитывали для области мениска по известной формуле: М=RT (dC/dX) m F/(1-υρ)X_mC_m,

где, R - газовая постоянная; Т - абсолютная температура, К;

и - парциальный удельный объем, см³/ г;

ρ - плотность растворителя, г/см³;

С_m - эквивалент концентрации растворенного вещества у мениска;

- содержание сульфатов - 21%. Определение сульфатных групп проводили восстановительным методом [Кошелева Л.П., Глебко Л.И., Химия природн. соед., 1977, №4, С.500-502];

- содержание моносахаридов: 33,7% галактозы и 21,5% 3,6-ангидрогалактозы.

Образцы полисахаридов (5 мг) подвергали гидролизу 2 М трифторуксусной кислотой при 100°С (4 ч). Моносахаридный состав определяли в виде ацетатов полиолов помощью ГЖХ на хроматографе 6850 ("Agilent", Германия), оборудованном капиллярной колонкой HP-5MS (30 м × 0,25 мм) с 5%-ным Phenyl Methyl Siloxane ("Agilent", Германия), с пламенно-ионизационным детектором, при температуре 175-225°С (скорость изменения температуры 3°С в 1 мин) [Englyst H.N., and Cumming J.H., Analyst. 1984. Vol.109. P. 937-942]. Содержание 3,6-ангидрогалактозы определяли методом полного восстановительного гидролиза [Усов А.И., Элашвили М.Я. Биоорган.химия 1991. №17. С.839-848].

- ИК-спектр, см^-1: 1227 (S=0), 928 (C-O-C), 846 (C-O-S).

ИК-спектры полисахаридов в пленке регистрировали на спектрофотометре с Фурье-преобразованием Vector 22 ("Bruker", Германия) с разрешением 4 см^-1.

На чертеже представлен ИК-спектр заявляемого средства.

Острую токсичность исследовали на имбредных мышах. Заявляемое средство не токсично при его внутрибрюшинном введении в дозах от 100 до 200 γ/мышь.

Исследование in vivo на действие заявляемого средства при ЛПС-индуцируемой эндотоксинемии.

Влияние средства на резистентность животных к ЛПС-интоксикации изучалось с учетом изменений биохимических и патоморфологических показателей наиболее адекватно реагирующих на любой действующий стресс-фактор, в том числе бактериальный эндотоксин.

Для изучения действия смеси k- и λ-каррагинанов на специфическую резистентность организма к токсическому действию бактериального эндотосксина -ЛПС из E.coli использовали половозрелых беспородных мышей-самцов массой 20-25 г по 14 животных в каждой группе (кровь и печень объединяли от двух животных в одну пробу в связи с их малыми количествами, соответственно в каждой группе было по 7 наблюдений). В эксперименте животные были разбиты на три группы: первую группу составляли контрольные животные, которым вводили физиологический раствор; вторую - животные, которым водился ЛПС, а третью - животные, которым предварительно перорально вводилась смесь k- и λ-каррагинанов, а затем ЛПС.

Бактериальную интоксикацию мышей (вторая и третья группы животных) вызывали однократным внутрибрюшинным введением коммерческого препарата ЛПС грамотрицательных бактерий E.coli в дозе 1 мг/кг (Serovar 055:В5, Sigma, USA). В течение 5 суток до введения ЛПС мыши третьей группы получали смесь k- и λ-каррагинанов внутрижелудочно, один раз в сутки в дозе 100 мг/кг в виде 1% геля. Декапитацию мышей осуществляли через сутки после введения ЛПС. Содержание и эвтаназия животных соответствовали требованиям Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609 EEC.

В сыворотке крови определяли кортикостерон (КС) спектрофлюрометрическим методом, активность аланинаминотрансферазы (АЛТ) с помощью тест-систем "Трансфераза-АЛТ-Ново" (ЗАО "Вектор-Вест", Россия), тироксин (Т₄) и трийодтиронин (Т₃) - тест-систем "Т₄-ИФА-Вест-стрип" и "Т₃-ИФА-Вест-стрип" (ЗАО "Вектор-Вест", Россия). В печени определяли содержание белка с помощью реактива Фолина, гликогена - антроновым методом, малонового диальдегида (МДА) с помощью тиобарбитуровой кислоты, лактата и активность глюатиопредуктазы (ГлР, КФ 1.6.4.2) ферментативным методом с использованием никотинамидов НАД и НАДФ Н. Достоверность различий между группами оценивали при помощи t-критерия Стьюдента с использованием программы для статистической обработки данных Statistica for Windows r.5.1 b (StatSoft Inc.). Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 Влияние смеси k- и λ-каррагинанов на некоторые показатели стресс-реакции мышей при интоксикации ЛПС E.coli (M±m) Показатели Группы животных Норма (физиологический раствор) действие ЛПС Действие ЛПС+смесь k- и λ-каррагинанов Масса органов Тимус, мг/100 г 130,2±5,2 90,4±3,9* 110,2±4,0^** Надпочечники, мг/100 г 15,4±0,31 16,0±0,52* 14,3±0,62^** Сыворотка крови КС, мкмоль/л 0,30±0,02 0,41±0,03 0,35±0,02 АЛТ, моль/(лхч) 0,86±0,05 1,30±0,09* 0,89±0,06^** Т₃, нмоль/л 1,28±0,07 0,92±0,06* 1,17±0,07^** Т₄, нмоль/л 50,8±4,2 38,8±3,3* 45,4±3,4 Печень Гликоген, мкмоль/г 215,3±10,8 146,6±8.2* 178,5±10,2 Лактат, мкмоль/г 1,48±0,07 1,97±0,11* 1,65±0,10^** МДА, нмоль/г белка ткани 5,2±0,28 7,1±0,53* 6,4±0,38 ГлР, нмоль/(мг белка·мин) 45,8±2,6 32,0±1,6* 43,1±3,1^** Примечание: *р<0,05 - норма и ЛПС, **р<0,05 ЛПС и ЛПС + смесь k- и λ-каррагинанов

ЛПС E.coli, введенный парентерально мышам, вызывал значительные изменения в биохимических показателях, являющихся маркерами стресс-реакции животных на эндотоксин. Данные эксперимента свидетельствуют о снижении относительной массы тимуса на 31%, повышении массы надпочечников на 17%, повышении в сыворотке крови уровня глюкокортикоида КС на 37%. Одновременно с этим отмечали значительное снижение содержания в сыворотке крови мышей тиреоидных гормонов: Т₃ - на 28%, Т₄ - на 24%.

Параллельно с этим выявлены достоверные изменения таких энергосубстратов в печени, как гликоген и лактат. ЛПС достоверно снижал уровень гликогена на 32% и повышал содержание лактата на 33%. Кроме того, эндотоксин индуцировал окислительный процесс в организме мышей, на что указывает повышение уровня МДА на 36% и снижение активности фермента антиоксидантной защиты ГлР на 30% в печени. Увеличение в сыворотке крови активности АДТ на 31% свидетельствует о том, что ЛПС вызывал цитолитический процесс в печени.

Предварительно введенная мышам смесь k- и λ-каррагинанов существенно меняла степень стресса животных, значительно повышая адаптивные возможности организма. Средство препятствовало гипертрофии надпочечников и инволюции тимуса: их относительная масса отличалась от нормы на 7 и 15%, в то время как у не получивших препарат животных она составляла 17 и 31% соответственно. Содержание КС в сыворотке крови отличалось от нормы только на 17%, в группе ЛПС - на 37%, гормонов Т₃ и Т₄ на 9 и 11% соответственно, в контроле - на 28 и 24%.

В результате действия смеси k- и λ-каррагинанов метаболизм в печени подвергался меньшим изменениям, чем в группе ЛПС. Так, отличия в содержании гликогена, лактата, МДА и активности ГлР от нормы составляли 17, 11, 23 и 6% соответственно, в группе ЛПС - 32, 33, 36 и 30%.

Полученные данные свидетельствуют о повышении устойчивости организма животных к воздействию ЛПС с помощью заявляемого средства.

Таким образом, предлагаемое средство, вводимое перорально, оказывает лечебно-профилактический эффект на макроорганизм при бактериальной эндотоксинемии.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к средству, повышающему неспецифическую сопротивляемость организма к бактериальным эндотоксинам. Средство, повышающее неспецифическую сопротивляемость организма к бактериальным эндотоксинам, характеризующееся тем, что оно представляет собой смесь k- и λ-каррагинанов, полученную из красной водоросли Chondrus armatus экстракцией водой и последующим осаждением этанолом, которая состоит из определенного количества галактозы и 6-ангидрогалактозы, содержит сульфаты и белок. Вышеописанное средство эффективно повышает неспецифическую сопротивляемость организма к бактериальным эндотоксинам. 1 ил., 1 табл.

Средство, повышающее неспецифическую сопротивляемость организма к бактериальным эндотоксинам, характеризующееся тем, что оно представляет собой смесь k- и λ-каррагинанов в соотношении 3:1, полученную из красной водоросли Chondrus armatus экстракцией водой при температуре 90°С и последующим осаждением этанолом, которая состоит из 33,7% галактозы и 21,5% 3,6-ангидрогалактозы, содержит 21% сульфатов и 2% белка, имеет интенсивные полосы поглощения в ИК-спектре при 1227, 928 и 846 см^-1, слабые при 820 см^-1 и молекулярную массу в пределах 500,0-550,0 кДа.