ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЭМОЦИОНАЛЬНЫХ ДИСФУНКЦИЙ Российский патент 2009 года по МПК A61K31/726 A61K31/727 A61K31/737 A61P25/22 A61P25/24 A61P25/18 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение касается новых применений в фармакологии гликозаминогликанов, в частности тех, которые имеют среднюю молекулярную массу 2400 (±200) D.

СОСТОЯНИЕ ТЕХНИКИ

Эмоциональные расстройства относятся к области психических заболеваний, таких как депрессии, страх, психотические и маниакальные синдромы, и в основном выражаются в форме аномальной реакции на окружающее, начиная от агрессивности до состояния спутанности сознания и апатии.

Эмоциональные расстройства подвергаются фармакологическому лечению различными способами в зависимости от первопричины. Униполярные аффективные расстройства лечат трициклическими антидепрессантами, такими как имипрамин, или гетероциклическими антидепрессантами, такими как селективные ингибиторы поглощения серотонина типа флуоксетина, или моноаминоксидазными ингибиторами, такими как фенелзин (лекарственные средства этого типа предпочтительно включены в фармакологическое руководство "The pharmacological basis of therapeutics", Chapter 19, X edition 2001).

В отличие от предыдущего, биполярные аффективные расстройства лечат литием, вальпроевой кислотой или другими лекарственными средствами антиконвульсивного действия (лекарственные средства этого типа предпочтительно включены в Chapter 20 вышеупомянутого фармакологического руководства).

Первичные расстройства, связанные с возникновением тревожного состояния, такие как генерализованные симптомы при состоянии тревоги и обсессивно-компульсивные синдромы, лечат с использованием класса продуктов, уже упомянутых, или с помощью бензодиазепина и/или буспирона.

Однако все описанные состояния имеют родственные симптомокомплексы и определены в Diagnsotic and Statistical Manual of Mental Disorders (Manuale diagnostico dei statistico dei distuurbi mentali, DMS-IV-R).

Лечение всех этих состояний весьма рекомендуется, и считается, что приблизительно 75% пациентов получают значительную пользу от лечения.

Фармакотерапия эмоциональных расстройств, однако, сопровождается рядом побочных эффектов, в том числе, среди прочих, изменением нормального состояния сознания.

Полагают, что определенные эмоциональные расстройства, такие как агрессивность, спутанность сознания и неспособность адаптироваться к новой окружающей обстановке, происходят из-за изменения внеклеточного матрикса (ЕСМ) в мозгу как подвижности, так и объема, с последующим воздействием на мозговые синапсы и на уровень интрацеребральной передачи (также в виде объема передачи).

Следовательно, продукты, способные модифицировать подвижность и объем ЕСМ, могут быть полезны для улучшения интрацеребральной передачи.

Кроме того, известно, что гликозаминогликаны имеют повышающий тревожное состояние эффект при интрацеребральном инъецировании.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящее время неожиданно было найдено in vivo, что гликозаминогликаны со средней молекулярной массой 2400 (±200) D способны корректировать эмоциональные дисфункции, не изменяя нормального состояния сознания, благодаря их способности предотвращать или уменьшать изменение внеклеточного матрикса (ЕСМ) в мозгу.

Следовательно, фракция гликозаминогликанов, имеющая среднюю молекулярную массу 2400 (±200) D, может быть использована для приготовления фармацевтических композиций, подходящих для лечения эмоциональных дисфункций.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следовательно, настоящее изобретение касается применения фракции гликозаминогликанов со средней молекулярной массой 2400 (±200) D для приготовления фармацевтических композиций, способных предотвращать или уменьшать патологические изменения внеклеточного матрикса в мозгу. Эти композиции можно, поэтому, использовать для лечения эмоциональных дисфункций и, в частности, депрессии, тревожных состояний, неврозов страха, ажитации и спутанности сознания.

Как хорошо известно, гликозаминогликаны (GAG) представляют собой имеющиеся в избытке в теле человека гетерополисахариды и образованы повторяющимися звеньями дисахаридов, которые в свою очередь сформированы из одного или двух модифицированных сахаров N-ацетилгалактозамина или N-ацетилглюкозамина и из уроновой кислоты, например глюкуроната или идуроната.

Настоящее изобретение касается, в частности, фракций гликозаминогликанов со средней молекулярной массой 2400 (±200) D.

Предпочтительно GAG настоящего изобретения получают из гиалуронатов, дерматансульфатов, хондроитинсульфатов, гепарина и гепарансульфатов или кератансульфатов.

Указанные фракции можно получить деполимеризацией соответствующего(их) гликозаминогликана(ов) различными способами, включающими облучение гликозаминогликана(ов) гамма-излучением с последующей гель-фильтрацией или ультрафильтрацией. Способы получения гликозаминогликанов в соответствии с настоящим изобретение хорошо известны в данной области техники.

В соответствии с особенно предпочтительным примером осуществления настоящего изобретения фракции GAG настоящего изобретения получают из гепарина, например в соответствии со способом, приведенным в ЕР 1181024.

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для фармакологического исследования фракции гликозаминогликанов согласно изобретению в качестве экспериментальной модели использовали крысу для получения следующих оценок:

1) реакция на окружающую обстановку в исследовании “открытая область” или OF-тест;

2) обучение в водном лабиринте в исследовании “водный лабиринт Морриса”, MWM-тест;

3) выработка условного рефлекса во враждебной окружающей обстановке в исследовании “выработка зависящего от среды условного рефлекса страха”, CDFC-тест.

МАТЕРИАЛЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ

В экспериментах использовали тринадцать Brown Norway (BN) крыс, полученных от Harlan Sprague-Dawley Inc. (Indianapolis In.), массой 300-350 г в возрасте 11 месяцев.

В течение двух недель перед началом любой обработки или биологического теста животные адаптировались к новой окружающей обстановке. Распределение животных для обработки лекарственным средством (7 животных) или только наполнителем (6 животных) было случайным. Животных содержали в отдельных клетках и оценивали в соответствии с Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) в окружающей обстановке с регулируемой температурой (22-26°С) и с циркадным ритмом освещения в 12 часов (начало освещения в 7:00). Животные получали пищу и воду без ограничения. Все оценки поведения проводили в звуконепроницаемой окружающей обстановке возле жилых помещений и между 09:00 и 13:00 часами. В конце эксперимента, то есть после 42-44 дней обработки исследуемым продуктом или наполнителем, животных умерщвляли с использованием высокой дозы (100 мг/кг внутрибрюшинно) пентобарбитала натрия. Все методики утверждены Institutional Animal Care and Use Committee (IAUC) of the Loyala University Medical Center (IACUC).

Фракция гликозаминогликанов со средней молекулярной массой 2400 (±200) D (идентифицируемая далее в виде символа С3) была получена деполимеризацией гепарина с использованием гамма-излучения и последующим фракционированием, чтобы получить нужную молекулярную массу, как описано в ЕР 118024, и представляла собой водорастворимый порошок белого цвета. Порошок растворяли в питьевой воде в такой концентрации, чтобы животные получали ежедневно 25 мг/кг в период 42-44 дня. Потребление воды отдельными животными измеряли в первые две недели адаптации. В процессе эксперимента питьевую воду, содержащую С3, обновляли каждые 3-4 дня.

Подразделенная на недели методика эксперимента для анализа поведения показана в следующей схеме.

Неделя Методика 1 Прибытие животных и адаптация в отдельных клетках 2 Начало измерения количества потребляемой воды 3 Начало введения С3 (25 мг/кг) или наполнителя 5 OF-тест, открытая область - 12 минут 6-7 Водный лабиринт Морриса (MWM) Накопление (6 дней) Полное изменение (3 дня) 8 Выработка зависящего от среды условного рефлекса страха (CDFC) Адаптация (2 дня) Выработка условного рефлекса (3 дня) 9 Умерщвление животных

Через две недели (одна для адаптации и одна для оценки потребления воды) животных подвергали последовательно трем тестам: OF, MWM, CDFC.

OF (открытая область)

Поведение, проявляющееся под воздействием новой окружающей обстановки (12 минут), обеспечивает измерение реакции боязни всего нового (страх новой окружающей обстановки) и исследовательской реакции OF-тест проводили на платформе с размерами 100 см × 100 см × 40 см высотой. Стенки были изготовлены из лакированной клееной фанеры. Пол, окрашенный белой краской, разделен на 25 квадратов (25 см × 25 см), размеченных тонкой черной линией. В углах, находящихся на краях квадрата, образованного девятью центральными квадратами платформы, выполнены четыре отверстия диаметром 3,5 см.

Платформу размещали в звуконепроницаемом помещении с освещением отраженным светом.

Животных размещали в центре платформы и наблюдали в течение 12 минут.

Поведение животных регистрировали на видеокассете. Оценивали следующие поведенческие элементы: 1) время, в секундах, затраченное, чтобы покинуть центр квадрата (измерение страха или первоначального “замирания в позе”), и время, чтобы войти в один из квадратов вдоль стенки (тигмотаксис); 2) число пройденных квадратов (горизонтальное исследование); 3) число подъемов, то есть как много раз крыса вставала на задние лапы (вертикальное исследование); 4) число раз, когда крыса всовывала нос в одно из отверстий в полу.

После каждого сеанса OF промывали 70%-ным раствором этанола, чтобы удалить любые обонятельные раздражители, связанные с отдельным животным.

MWM (водный лабиринт Морриса)

Обучение и пространственную память можно было оценивать с использованием водного лабиринта, в котором измеряли способность животного обучаться и вспоминать место размещения платформы, что позволяло ему вылезти из воды. Дополнительно, тест позволял оценить состояние возбуждения или успокаивания животного.

Лабиринт был сконструирован из пластмассового цилиндра (152 см диаметром и 74 см высотой), окрашенного в белый цвет, заполненного водой на высоту 56 см и разделенного на квадранты. На половине расстояния между центром и кромкой на 1,5 см ниже поверхности воды была установлена платформа площадью 9 см². В воду добавляли порошковое молоко, чтобы сделать ее непрозрачной, и поддерживали температуру воды в диапазоне 22-26°С. Контрольные точки снаружи лабиринта поддерживали постоянными. Поведение каждого животного записывали на видео (SMART Video Tracking System, San Diego Instruments, San Diego, CA). Видеокамера, соединенная с компьютером, была размещена над центром лабиринта. Компьютер рассчитывал: 1) длину пути (см), проходимого животным, чтобы достичь приподнятой платформы; 2) паузу (с) и расстояние (см), проходимое в каждом квадранте; 3) задержку (с) для нахождения платформы и залезания на нее.

Животных подвергали тестам 4 раза в день. В каждом тесте животных размещали на краю лабиринта. Платформу всегда размещали в одном месте (квадрант 1) в первые 8 дней (обучение) и перемещали в другое положение (квадрант 3) для теста “полное изменение”, проводимого в следующие три дня 7-9.

В первом тесте животных помещали в квадрант 2 возле квадранта с платформой, то есть квадрантом 1. В процессе следующих трех тестов в этот день животных размещали в соседних квадрантах, двигаясь по часовой стрелке. Тест продолжался до тех пор, пока животное не достигало платформы, или максимально до 60 с. Если животное не успевало достичь платформы за 60 с, его осторожно переносили на платформу и не тревожили в течение 60 с. Каждое животное оставляли на платформе в течение 60 с и повторяли тест непосредственно после этого После прохождения четырех тестов животных осторожно сушили с помощью полотенца и помещали обратно в их клетки.

CDFC (выработка зависящего от среды условного рефлекса страха)

В этом тесте измеряли способность животного обучаться и вспоминать условный раздражитель (CS), парный безусловному раздражителю неблагоприятной природы (UCS).

Тест, осуществляемый в течение пяти последовательных дней, позволяет анализировать способность животного обучаться и вспоминать связь между событиями (“основа”) - условный раздражитель (CS или свет) и безусловный раздражитель (UCS умеренный электрошок) - и окружающей обстановкой (“фон”).

Животные проходили адаптацию в первой окружающей среде (среда А) в течение двух последовательных дней.

На третий день поведение животных анализировали во время использования трех последовательных раздражителей, состоящих из света и последующего электрошока (временное пропускание тока средней интенсивности под лапами, но достаточной для причинения боли), которые представляли условный раздражитель (CS) и безусловный раздражитель (UCS) соответственно; эти раздражители вызывали состояние страха, который проявлялся в феномене “замирание” (животное замирало в характерной позе), что позволяло точно измерить уровень страха. Эта последовательность раздражителей фактически представляет события, названные “основой”, которые проводили в среде А.

На четвертый день животных помещали обратно в среду А без применения CS и UCS раздражителей. Это давало возможность анализировать поведение животных в “фоне” (т.е. в среде, в которой ранее происходили события CS-UCS). Предыдущие эксперименты показывали, что поражения гипокампа вызывают общую неспособность вспомнить, что “фон” связан с выработкой условного рефлекса, т.е. с “основой”. Полное отсутствие замирания в позе на четвертый день служит признаком дисфункции памяти, т.е. животное не может вспомнить среду, в которой происходили события.

На пятый день животное помещали в другую среду (среда В) и использовали только световой раздражитель (CS), чтобы определить, вспомнит ли животное, что этот раздражитель представляет событие неблагоприятной природы независимо от окружающей обстановки (раздражитель типа USC в этой сеансе не использовали). Способность животного реагировать замиранием в позе в этой другой среде указывает, что животное осознает отрицательное значение светового раздражителя, за которым следовал вызывающий болезненное состояние раздражитель.

Среды А и В представлены небольшими камерами с длиной 48 см, глубиной 25 см и высотой 28 см. Эксперимент продолжался 8 минут.

В среде А пол представлял собой решетку из металлических трубок диаметром 2,5 мм, расположенных на расстоянии 10 мм друг от друга (от центра до центра). Стенки камеры все выполнены из Plexiglas™, передняя стенка прозрачная, задняя стенка черная и остальные стенки белые. Для получения светового раздражителя использовали лампу мощностью 7,5 Вт, которую располагали в центре одной из боковых стенок камеры на расстоянии 14 см от задней стенки камеры.

Выработку “основного” условного рефлекса на третий день проводили следующим образом. После интервала в 2 минуты включали свет (CS) и через 20 с применяли электрошок к лапам животного (“шок стопы”) через металлическую решетку продолжительностью 2 с при силе переменного тока 0,8 мА, поданного от генератора Grason-Stadler, модель E1064 GS. Животных подвергали двум другим сеансам CS и UCS, каждый с интервалом в 2 минуты, что выражалось в 3 парных CS-UCS. Все сеансы регистрировали на видео и оценивали позднее.

Продолжительность “замирания в позе” в четырех сеансах (всего 2×4 мин = 8 мин/день) измеряли в секундах на основании видеозаписи с использованием секундомера с остановом.

На четвертый день снова использовали среду А, но животных не подвергали действию каких-либо раздражителей и, следовательно, тест служил для оценки реакции только на “фон”, т.е. памяти на враждебную окружающую обстановку. Замирание в позе измеряли как на третий день.

На пятый день использовали среду В. Размеры камеры были идентичны размерам камеры среды А. Однако решетка и задняя стенка были заменены панелями из клееной фанеры. Камеру очищали с использованием PetZyme™ (который удаляет цвет и запах) сразу после каждого сеанса. PetZyme™ был источником обонятельного раздражителя, отличающегося от такового, вызываемого 70%-ным раствором этанола, использованным в среде А в дни от 1 до 5. После интервала в 2 минуты применяли CS (свет в течение 20 с) три раза с перерывом 2 минуты. UCS не использовали. Следовательно, пятый день служил для измерения выработки “основного” условного рефлекса, т.е. связи между окружающей обстановкой и враждебными воздействиями. Замирание в позе измеряли как на третий день.

Статистический анализ данных основан на расчете средних значений и стандартного отклонения (SE), тогда как сравнение между двумя группами осуществляли с использованием непараметрической статистики (Mann-Whitney "U" тест).

Результаты

Количество жидкости, потребляемой ежедневно животными, составляло 35,7±1,1 мл, и С3 не влияло на потребление.

Открытая область

1) Время, чтобы оставить центр (секунды): среднее ± SE (стандартное отклонение)

(горизонтальное исследование)

Контроль 25,0±8,0

С3 12,6±2,5

U тест: р<0,05

2) Общее количество пройденных квадратов: среднее ± SE

Контроль 56,5±3,4

С3 76±8,4

U тест: р<0,05

Эти результаты показывают, что использование С3 для обработки уменьшает страх окружающей обстановки и вследствие этого повышает исследовательское положение животного.

MWM (водный лабиринт Морриса)

Что касается этого теста, не наблюдалось заслуживающей внимания разницы между обработанными животными и контрольными животными. Оказалось, что профиль накопления и профиль “полного изменения” накладываются один на другой (данные не сообщаются). Так как оценка этого теста основана и на длине пути, и на времени достижения платформы, можно утверждать, что С3 не изменяет обучения или подвижности и, следовательно, не оказывает какого-либо стимулирующего действия. Другими словами, животные, обработанные С3, не проявляли ни успокаивания, ни возбуждения.

CDFC (Выработка зависящего от среды условного рефлекса страха)

1) Время замирания в позе (секунды): среднее ± SE в 4 сеансах на третий день

Сеансы Время замирания в позе   С3 Контроль 1 6±2,7 5±1,1 2 30±5,0* 48±3,7 3 61±8,5* 88±1,8 4 77±9,0* 86±6,4 *U тест: р<0,05

Результаты показывают, что С3 значительно уменьшает замирание в позе во всех сеансах, где применяли условный и безусловный раздражители (CS и UCS), что указывает воздействие на “основу”, состоящее в уменьшении паники при встрече с враждебной окружающей обстановкой.

2) Как указывается в способе, на четвертый день CDFC животных помещали в испытательную камеру на период 8 минут, в котором сеансы в 2 минуты каждый не предусматривали каких-либо раздражителей.

В этих условиях, однако, животное проявляет тенденцию связывать окружающую обстановку (фон) с памятью о враждебных событиях (основа) и, следовательно, развивается состояние страха.

Результаты показаны в следующей таблице.

Время замирания в позе (секунды): среднее ± SE в 4 сеансах на четвертый день

Сеансы Время замирания в позе   С3 Контроль 1 23±7,6* 60±9,5 2 76±11,2 94±9,1 3 69±9,9 80±6,5 4 70±6,4 84±9,2 *U тест: р<0,05

Средние значения у животных, обработанных С3 в первом сеансе, значительно меньше, чем у контрольных животных, основной индикатор более контролируемого страха при встрече с враждебной окружающей обстановкой. В последних сеансах разница между группами становится меньше, и увеличение времени замирания в позе опускается до значений, которые несущественно различаются между двумя группами, указывая, что в обеих группах все еще существует память о враждебной окружающей обстановке.

3) Результаты пятого дня, т.е. когда изменяли окружающую среду и использовали только световой раздражитель, но не вызывающий болезненного состояния раздражитель (таким образом, в отсутствие решетки), представлены в следующей таблице.

Время застывания в позе (секунды): среднее ± SE в сеансах на пятый день

Сеансы Время замирания в позе   С3 Контроль 1 18±6,2 12±4,0 2 90±4,0 74±5,3 3 110±4,5 80±12,0* 4 110±4,2 106±6,2 *U тест: р<0,05

Результаты показывают, что такое поведение, как замирание в позе, аналогично в двух группах, т.е. происходит непрерывное увеличение в обеих группах. В группе, обработанной С3, происходит ослабление замирания в позе, которое значительно отличается от нуля на шестой минуте, а также в основном гораздо меньше в целом сеансе.

Выводы

Обработка С3 в дозе 25 мг/кг/день в течение 42-44 дней приводит к следующим результатам.

1) Уменьшение эмоциональной реакции в OF и увеличение исследовательского поведения.

2) Уменьшение замирания в позе во время CDFC в период накопления (день 3), ослабление его при воздействии только враждебной обстановки, хотя без формирования враждебности (день 4) и окончательное ослабление при воздействии в аналогичной новой среде и с неполным раздражителем (день 5). Все эти три элемента и в частности относящиеся к периоду накопления, являются однозначными индикаторами лучшей адаптации к окружающей обстановке и ее возможной враждебности.

3) Отсутствие ухудшения обучения и пространственной памяти в условии и в фазах (обучение и полное изменение), что может быть оценено с помощью водного лабиринта.

4) Отсутствие стимулирующих или депрессивных воздействий на центральную нервную систему (CNS), которое может быть выявлено изменением двигательной активности.

Следовательно, полученные результаты демонстрируют, что С3 улучшает эмоциональную реакцию на окружающую обстановку без возбуждающего или депрессивного воздействия на центральную нервную систему (CNS).

Гликозаминогликаны со средней молекулярной массой 2400 (±200) D могут быть, следовательно, использованы для приготовления фармацевтических композиций, которые подходят для лечения эмоциональных дисфункций.

Указанные композиции содержат фармацевтически эффективное количество действующего начала вместе с фармацевтически приемлемыми разбавителями или наполнителями и могут быть в форме, которая пригодна для подкожного, внутримышечного, внутривенного и перорального введения.

Примерами фармацевтически приемлемых разбавителей или наполнителей являются, например, физиологический раствор, коллоидальный диоксид кремния.

Указанные композиции обычно содержат гликозаминогликаны в количестве от 10 мг до 100 мг.

Лечение эмоциональных дисфункций предусматривает введение приблизительно от 10 мг до 400 мг/день действующего начала пациенту.

В частности, введение 10-50 мг/день предпочтительно для подкожного, внутримышечного и внутривенного введения, в то время как введение 50-100 мг/день предпочтительно в случае перорального введения.

Предложено применение фракции гликозаминогликанов, имеющих среднюю молекулярную массу 2400 (±200)D, полученную деполимеризацией гликозаминогликана, выбранного из гепарансульфата и гепарина для приготовления фармацевтических композиций для лечения эмоциональных дисфункций, выбранных из депрессивного расстройства, тревожного состояния, невроза страха, ажитации, спутанности сознания, и способ лечения эмоциональных дисфункций. Показано, что заявленные соединения уменьшали эмоциональную реакцию и увеличивали исследовательское поведение, приводили к лучшей адаптации к окружающей обстановке и ее возможной враждебности. При этом отсутствовало возбуждающее или депрессивное действие на центральную нервную систему. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Применение фракции гликозаминогликанов, имеющих среднюю молекулярную массу 2400 (±200)D, полученной деполимеризацией гликозаминогликана, выбранного из группы, состоящей из гепарансульфата и гепарина для приготовления фармацевтических композиций для лечения эмоциональных дисфункций, выбранных из группы, состоящей из депрессивного расстройства, тревожного состояния, невроза страха, ажитации, спутанности сознания.

2. Применение по п.1, в котором указанную фракцию гликозаминогликанов получают деполимеризацией гепарина.

3. Применение по пп.1-2, в котором указанные фармацевтические композиции содержат 10-100 мг указанной фракции гликозаминогликанов, имеющих среднюю молекулярную массу 2400 (±200)D.

4. Способ лечения пациентов с эмоциональными дисфункциями, предусматривающий введение от 10 до 400 мг/день фракции гликозаминогликанов, имеющих среднюю молекулярную массу 2400 (±200)D.

5. Способ по п.4, в котором от 10 до 50 мг/день указанной фракции гликозаминогликанов вводят пациенту подкожно, внутримышечно или внутривенно.

6. Способ по п.4, в котором от 50 до 100 мг/день указанной фракции гликозаминогликанов вводят пациенту перорально.