СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНКСИОЛИТИЧЕСКОЙ, НООТРОПНОЙ, ПРОТИВОСУДОРОЖНОЙ, АНТИДЕПРЕССИВНОЙ, ЦЕРЕБРОПРОТЕКТОРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ И СПОСОБНОСТЬЮ НОРМАЛИЗОВАТЬ ПРОЦЕССЫ ПЕРЕДАЧИ В СИНАПСАХ МОЗГА Российский патент 2008 года по МПК A61K36/30 A61P25/08 A61P25/28 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается применения средства растительного происхождения в качестве средства, обладающего анксиолитической, ноотропной, противосудорожной, церебропротекторной активностью и способностью нормализовать процессы передачи в синапсах мозга.

Экстракты некоторых лекарственных растений с незапамятных времен использовались для снижения стресса и для избавления от страха во многих различных культурах во всем мире, и ряд анксиолитических и седативных принципов выделен из высших растений и охарактеризован в новейшее время. И в самом деле такие соединения транквилизатора бензодиазепина, как диазепам ("VALIUM"), оксазепам ("SERAX") и лоразепам ("ATIVAN"), которые, как полагали, представляют собой наиболее существенные синтетические анксиолитические средства, оказывающие превосходные эффекты, теперь однозначно признаны встречающимися в природе соединениями растительного происхождения, обнаруженными в картофеле, соевых культурах, чечевице, кукурузе, пшенице, гречихе, рисе, овсе, ячмене и просе (см. Wildmann et al., J. Neural Transm. (1987) 70: 383-398; Wildmann, J. Biochem. Biophys. Res. Commun. (1988) 157: 1436-1443; Wildmann et al., Biochem. Pharmacol. (1988) 37: 3549-3559; Unseld et al., Biochem. Pharmacol. (1989) 38: 2473-2478; Klotz, U., Life Sci. (1991) 48: 209-215; Bringmann, G., J. Neural Transm. (1992) 88: 77-82).

До настоящего времени неизвестно средство, обладающее столь широким фармакологическим действием, а именно анксиолитической, ноотропной, противосудорожной, антидепрессивной, церебропротекторной активностью и обладающего способностью нормализовать процессы передачи в синапсах мозга.

Задачей настоящего изобретения является разработка средства, представляющего собой комплекс экстрактивных веществ, выделенных из растительного сырья, и проявляющего анксиолитическую, ноотропную, противосудорожную, антидепрессивную, церебропротекторную активность и, способностью нормализовать процессы передачи в синапсах мозга.

Данная задача решена следующим образом.

Предложено применение водного, или водно-спиртового, или углекислотного экстракта растения рода незабудки (Myosotis) в качестве средства, обладающего анксиолитической, ноотропной, противосудорожной, церебропротекторной активностью и способностью нормализовать процессы передачи в синапсах мозга.

Экстракт незабудки может быть использован в жидкой форме и в форме сухого экстракта.

Для подтверждения заявляемой активности были проведены исследования по влиянию заявляемого средства в сравнении с прототипом на устойчивость животных к действию судорожных ядов, на реакцию поведенческого отчаяния, на выработку и воспроизведение условного рефлекса при ее нарушении в результате блокады холинергической передачи в мозгу, на поведение крыс в условиях конфликтной ситуации, на ориентировочно-исследовательское поведение мышей с разным типом эмоционально-стрессового реагирования в условиях «открытого поля» и на выработку условного питьевого рефлекса со сложной пространственной ориентировкой. Заявляемое средство было исследовано в трех вариантах: 1) на основе сырья незабудки полевой (Myosotis arvensis. L) - заявляемое средство «Вариант 1» (далее по тексту В1), 2) незабудки лесной (Myosotis sylvatica L.) - заявляемое средство «Вариант 2» (далее по тексту В2), 3) незабудки болотной (Myosotis palustris L.) - заявляемое средство «ВариантЗ» (далее по тексту В3).

Заявляемое средство и прототипы во всех приводимых ниже примерах использованы в максимально эффективных дозах, установленных в предварительных экспериментах.

Пример №1. Изучение влияния препаратов на проявление действиясудорожных ядов

Наиболее близким к заявляемому средству по противосудорожному действию (прототип) является экстракт водяники черной (Empetrum nigrum, L.) [1]. Было исследовано влияние заявляемого средства В1 и прототипа на судорожную активность тиосемикарбазида и коразола. При проведении исследований заявляемое средство и прототип применяли курсами по 5 введений. Заявляемое средство вводили в дозе 1 мл/кг и экстракт водяники черной вводили в дозе 200 мг/кг. При исследовании противосудорожного действия по отношению к судорогам, вызываемым коразолом, через 1 час после 5-го введения препаратов мышам в хвостовую вену дробно по 0.02 мл/10 сек вводили коразол в виде 1% раствора на изотоническом растворе хлористого натрия. Регистрировали суммарный объем введенного раствора до появления клонико-тонического судорожного припадка, заканчивающегося смертью животного. Количество раствора коразола в дальнейшем пересчитывали на его дозу в мг/кг массы тела мыши [2].

Судорожный эффект тиосемикарбазида основан на способности нарушать синтез гамма-аминомасляной кислоты. Его введение приводит через некоторое время к развитию генерализованного судорожного припадка и гибели животного. Способность препаратов отсрочивать наступление судорог или предотвращать гибель животных хорошо характеризует противосудорожные свойства вещества и свидетельствует о его положительном влиянии на обмен ГАМК или усиление активности ГАМК-ергических систем. В наших экспериментах тиосемикарбазид вводился внутрибрюшинно на физиологическом растворе в дозе 26 мг/кг. Регистрировали время наступления судорожного припадка и время гибели животных. Исходным моментом считали время введения тиосемикарбазида [3].

Проведенные исследования (табл.1) показали, что прототип в 200 мг/кг существенно повысил латентное время наступления судорог, вызываемых тиосемикарбазидом, и на 25% снизил гибель мышей при применении этого судорожного яда в использованной дозе, в то время как в контрольной группе при действии тиосемикарбазида наблюдалась 100%-процентная смертность. Прототип на 39,9% повысил смертельную дозу коразола.

При применении заявляемого средства В1 произошло увеличение латентного времени наступления судорог после введения тиосемикарбазида на 147%, доля погибших животных снизилась до 42%. Заявляемое средство В1 вызвало увеличение смертельной дозы коразола на 83%.

Таблица 1Влияние заявляемого средства В1 с прототипом на судорожные эффекты тиосемикарбазида и коразолаПрепарат, группа, дозаТиосемикарбазид (n=12)Смертельная доза коразола (в мг/кг; ; n=16)Латентное время наступления судорог (мин)Количество судорогВремя гибели (мин)Доля погибших мышей в %Контроль39,1±2,48,3±1,143,7±5,7100106,7±4,0Прототип 200 мг/кг67,5±5,9*1,6±0,399,5±5,7*67*148,3±7,4*Заявляемое средство В1 1,0 мл/кг96,7±6,3*#1,2±0,5124,8±7,742*#195,3±9,9*#Примечание:* - различия статистически достоверны по отношению к показателям контрольной группы животных; # - различия достоверны по отношению к группе, получавшей прототип при Pt<0,05, Pu<0,05.

Заявляемое средство В1 превосходит прототип по своему противосудорожному действию как по отношению к судорогам, вызываемым коразолом, так и по отношению к судорогам, вызываемым тиосемикарбазидом.

Пример №2. Исследование влияния заявляемого средства В1 в сравнении с прототипом на реакцию поведенческого отчаяния.

Исследования проводились в условиях модели, предложенной Порсольтом [4]. Данный тест является одним из наиболее распространенных исследовательских приемов при изучении веществ с антидепрессантным типом действия [5]. Тест основан на наблюдении, что при помещении мышей и крыс в неизбегаемую стрессовую ситуацию, например в цилиндры, заполненные водой, после ряда активных попыток избавления животные замирают в характерной позе, называемой «реакцией поведенческого отчаяния». Длительность иммобилизации считается критерием депрессивного состояния животных [6]. В наших экспериментах мышей по одной помещали в стеклянные цилиндры диаметром 80 мм, заполненные водой на 60 мм. Регистрировали продолжительность иммобилизации в первые 6 минут и в последующие 10 минут отдельно. Считается, что сокращение времени иммобилизации в первые 6 минут может служить основанием для прогноза антидепрессивных свойств препаратов, в то время как изменение этого показателя в последующие 10 минут отражает психостимулирующую активность [7]. В качестве прототипа по данному виду активности был взят препарат гинсана (фирма "Pharmaton", Швейцария), созданный на основе стандартизованного экстракта женьшеня, обладающий атидепрессантной, психостимулирующей и ноотропной активностью. В частности, для него показано положительное влияние на обмен биогенных аминов мозга, что считается основой механизма фармакологической активности многих антидепрессантов [8, 9, 10].

Проведенные исследования показали, что прототип и заявляемое средство В1 увеличили латентное время первого эпизода иммобилизации, существенно снизили продолжительность иммобилизации в первый период исследования (с 1 по 6 минуты), уменьшили количество эпизодов иммобилизации как в первый, так и во второй (с 7 по 16 минуты) период исследования (табл.2). При этом заявляемое средство В1 существенно превосходило по активности прототип.

Таблица 2Влияние заявляемого средства В1 в сравнении с прототипом на количество эпизодов, латентное время и продолжительность (в секундах) иммобилизации и в опытах на мышах в условиях теста «поведенческого отчаяния» (; n=12)Группа наблюдения (количество животных)КонтрольЗаявляемое средство (В1) 1,0 мл/кгПрототип 100 мг/кгЛатентное время первого эпизода иммобилизации2,2±0,417,4±2,1*# Р<0,0132,9±4,1* Р<0,01Продолжительность иммобилизации с 3 по 6 минуту154,8±5,186,5±6,8*# Р<0,05122,2±6,5* Р<0,05Количество эпизодов иммобилизации с 3 по 6 минуту4,2±0,41,4±0,3*2,2±0,3* Р<0,05Продолжительность иммобилизации с 7 по 16 минуту228,0±7,9130,3±8,2*# Р<0,05171,6±9,5* Р<0,01Количество эпизодов иммобилизации с 7 по 16 минуту7,0±0,92,8±0,33,7±0,5* Р<0,05Примечание:* - различия статистически достоверны по отношению к показателям контрольной группы животных; # - различия достоверны по отношению к группе, получавшей прототип при Pt<0,05, Pu<0,05.

Пример №3. Исследование влияния заявляемого средства (В1) в сравнении с прототипом на процессы памяти при нарушении передачи сигналов в холинергических синапсах.

Нарушение процесса запоминания и воспроизведения навыка при нарушении холинергических механизмов высшей нервной деятельности, вызываемых введением скополамина, является одним из наиболее распространенных методических приемов в исследовании механизмов памяти [12]. Фармакологические манипуляции холиноактивными средствами дают неоднозначные результаты [13]. Однако современные исследователи придают большое значение таким изысканиям, так как нарушения регуляции когнитивных функций со стороны холинергической системы являются одним из основных предполагаемых звеньев в механизме развития болезни Альцгеймера, а коррекция данных нарушений агонистами холинергической системы дает положительные результаты в лечении данного заболевания [14, 15].

Амнестическое действие скополамина достигалась его введением в дозе 2,5 мг/кг подкожно за 20 минут до выработки рефлекса, через 1 час после последнего введения препаратов (животным интактного контроля вводили эквивалентное количество физиологического раствора). Строго через 20 минут после инъекции скополамина у мышей вырабатывался условный рефлекс пассивного избегания. Прототипом в данном эксперименте также служил препарат Гинсана.

Методика условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) основана на подавлении врожденного рефлекса предпочтения темного пространства, имеющегося у грызунов [16]. Экспериментальная установка представляла собой камеру, состоящую из двух отсеков: большого - освещенного и малого - темного. Животное помещалось в светлый отсек и вскоре (через 10-20 секунд) в силу врожденного рефлекса предпочтения темного пространства переходило в малый отсек, после чего дверка, соединяющая оба отсека, перекрывалась и на пол темного отсека, состоящего из параллельных чередующихся электродов, подавали электрический ток импульсами продолжительностью 50 Mc, частотой 5 Гц и амплитудой 50 мА. Через 10 секунд дверку открывали и животное могло выскочить в светлый отсек с обычным полом. В результате описанной процедуры у животных вырабатывался условный рефлекс избегания темного пространства. При проверке воспроизводимости рефлекса животных помещали в светлый отсек в угол, противоположный от входа в темный отсек, и наблюдали в течение 3-х минут. Регистрировали время первого захода в темный отсек (латентное время захода), суммарное время пребывания в темном отсеке. Выработанным рефлекс считался, если в течение всех 3-х минут наблюдения животное ни разу не посетило темный отсек. О качестве рефлекса судили по доле животных с наличием рефлекса. Проверка рефлекса осуществлялась через 24 часа после выработки. Введение заявляемого средства и прототипа проводили курсом в течение 4-х дней, предшествовавших экспериментальному воздействию один раз в день зондом в желудок, и 5-й раз за 1 час до выработки условного рефлекса.

Проведенные исследования (табл.3) показали, что скополамин существенно нарушил воспроизведение УРПИ. Заявляемое средство В1 полностью восстановило рефлекс, выработанный на фоне скополамина. При этом качество его воспроизведения было лучше, чем на интактном фоне. Однако этот факт носит относительный характер. Несмотря на статистически значимые различия, они не имели существенного значения. Прототип также вызвал улучшение воспроизведения рефлекса, однако по активности он существенно уступал заявляемому средству.

Таблица 3Влияние заявляемого средства В1 в сравнении с прототипом на сохранность условного рефлекса пассивного избегания беспородных мышей-самцов на фоне действия скополамина (; n=12)ГруппыЛатентное
время захода в темную камеру при выработке рефлексаПроверка рефлексаЛатентное время рефлексаВремя в темном отсекеВремя в светлом отсекеКоличество заходовДоля животных с наличием рефлекса, %Интактный контроль23,1±3,2171,5±3,27,9±1,4172,1±2,80,2±0,291,7#Контроль - скополамин (2,5 мг/кг)64,3±8,2*97,1±5,784,8±9,1*96,2±11,3*3,4±0,4*16,7*Прототип, 100 мг/кг61,4±3,8*132,5±12,3*#34,4±7,2*#145,6±4,5*1,9±0,3*#58,3*#Заявляемое средство (В1) 1,0 мл/кг71,4±9,6*180,0±0*&#0±0&#180,0±0*&#0±0&#100&#Примечание:* - различия статистически достоверны по отношению к показателям контрольной группы животных; # - в группе " контроль - скополамин"; & - различия достоверны по отношению к группе, получавшей прототип при Pt<0,05, Pu<0,05.

Пример №4. Влияние заявляемого средства В1 в сравнении с прототипом на поведение в конфликтной ситуации

Использованная модель конфликтной ситуации по Vogel является одной из наиболее распространенных моделей невроза. Она позволяет с достаточной достоверностью предсказать противоневротические свойства препаратов [17, 18]. В наших экспериментах конфликтная ситуация моделировалась путем столкновения двух рефлексов: питьевого условного рефлекса и безусловного рефлекса избегания электроболевого раздражения. Для этого животных предварительно оставляли на двое суток без воды, затем в течение 4-х суток на 20 минут ежедневно помещали в пластиковую камеру размерами 30×40×20 см, в одной из торцевых стенок которой была устроена ниша с поилкой, где крыса могла напиться. Прототип и заявляемое средство вводили, начиная с первого дня обучения, в желудок за 1 час до помещения в камеру контрольным животным вводили воду. В день регистрации результатов через 1 час после очередного введения веществ крыс снова помещали в камеру и между металлическим полом камеры и электродом, опущенным в поилку, создавалась разность потенциалов так, что при попытке взятия воды животное получало удар током. Силу тока регулировали таким образом, чтобы она имела надпороговое значение, увеличивая ее при первом пробном тестировании на трех пробных животных до первых реакций избегания боли при касании языком воды. Количество взятий воды регистрировали автоматически по количеству замыканий цепи в момент касания языком воды. Количество подходов к поилке регистрировали также автоматически с помощью фотоэлемента. Об анксиолитической активности препарата судили по разнице в числе взятий воды, несмотря на удар током (наказуемое взятие воды), в контрольной и опытной группах. Дополнительными показателями, характеризующими условно-рефлекторную, эмоциональную и смещенную активность, служили число подходов к поилке, горизонтальные перемещения по клетке, груминг, число вертикальных стоек. Каждое животное наблюдали индивидуально в течение 20 минут.

В качестве прототипа в данных экспериментах был использован экстракт шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis, Georgi), для которого показана выраженная анксиолитическая активность [19].

В условиях конфликтной (табл.4) ситуации прототип и заявляемое средство В1 существенно повысили главный показатель анксиолитической активности - количество наказуемых взятий воды. При этом заявляемое средство В1 существенно превосходило прототип. В приведенных в таблице 4 данных можно отметить и другие признаки анксиолитического действия. Так, заявляемое средство В1 вызвало снижение груминга. Груминг является проявлением смещенной активности, которая, в свою очередь, отражает уровень психоэмоционального напряжения, сопутствующего поведению [20, 21]. Кроме того, заявляемое средство В1 повышало количество подходов к поилке по сравнению с контрольной группой и понижало их количество по сравнению с прототипом. Количество подходов свидетельствует о величине мотивации и одновременно о величине психоэмоционального напряжения, так как последние, в силу операционального принципа организации сложных форм поведения, определяют частоту переключения с одного вида деятельности на другой. Чем больше психоэмоциональное напряжение, связанное с деятельностью, тем чаше осуществляются переключения для его гашения. Большее число взятий воды в одном подходе в сочетании с большим количеством наказуемых взятий воды говорит о меньшем уровне психоэмоционального напряжения в группе животных, получавших прототип. При этом более низкий показатель количества взятий воды в одном подходе не противоречит сказанному, всего лишь отражает двухфазный характер влияния состояния тревоги на формирование мотивационных состояний. Таким образом, заявляемое средство В 1 обладает выраженным анксиолитическим действием и в этом качестве существенно превосходит прототип.

Таблица 4Влияние заявляемого средства В1 в сравнении с прототипом на показатели поведения крыс в условиях конфликтной ситуации (; n=10).ПоказателиГруппы наблюденияИнтактный контрольПрототип 50 мг/кгЗаявляемое средство (В1) 1,0 мл/кгГоризонтальная активность29,0±5,339,8±8,247,3±6,4Вертикальная активность8,5±1,821,2±3,1*19,7±4,2*Груминг28,1±5,039,3±7,714,6±2,5*#Болюсы2,4±0,51,4±0,32,2±0,6Время замирания491±43256±32,4*165±19*Подходы к поилке6,1±1,423,5±3,2*12,6±2,2*#Взятия воды236±17421±31*618±49*#Общая двигательная активность74,1±7,3114,5±9,9*108,9±8,1*Примечание:* - различия статистически достоверны по отношению к показателям контрольной группы животных; # - к показателям группы, получавшей прототип при Pt<0,05, Pu<0,05.

Пример №5. Влияние заявляемого средства В1 в сравнении с прототипом на ориентировочно-исследовательское поведение в открытом поле у мышей с разным типом эмоционально-стрессового реагирования.

Было изучено ориентировочно-исследовательское поведение у мышей с активным типом эмоционально-стрессового реагирования - линейные мыши С57В1/6 и у мышей с пассивным типом этой реакции - мыши линии Balb/C.

Известно, что в зависимости от индивидуальных, наследственных, конституциональных характеристик эмоционально-стрессовое воздействие по-разному влияет на отдельных особей. У одних стрессовый ответ сопровождается активацией деятельности и ее продуктивности, а у других эмоциональный стресс приводит к дезорганизации поведения или к пассивному отстранению от решения проблем. Генетическая гетерогенность популяции по эмоционально-стрессовой реакции и зависимость эффекта транквилизаторов от характера поведения выявляется и в эксперименте, особенно отчетливо в условиях методики открытого поля.

Транквилизаторы оказывают отчетливый анксиолитический эффект у животных с пассивным типом поведения, выражающийся в устранении состояния застывания (freezing), страха, испуга и в активации поведения. В противоположность этому у мышей с активным типом поведения транквилизаторы вызывают седативный эффект. Высокую прогностическую значимость данная модель имеет не только при оценке классических транквилизаторов бензодиазепинового ряда, но и при изучении транквилизаторов нового поколения - атипичных препаратов с расслоением анксиолитического и седативного эффектов и избирательных, селективных анксиолитиков [17]. Кроме того, поведение животных в открытом поле отражает их реакцию на стресс новизны [23, 24], а также характер его преодоления в соответствии с существующими представлениями различных вариантах эмоционально-стрессового реагирования, от чего в конечном итоге зависят последствия пережитого стрессового воздействия [25].

Методика исследования ориентировочно-исследовательского поведения в открытом поле. Экспериментальная установка «открытое поле» представляла собой камеру размером 40×40×20 см с квадратным полом и стенками белого цвета [16, 22]. Ее пол, разделенный на 16 квадратов, имел в каждом квадрате круглое отверстие диаметром 3 см. Сверху камера освещалась электрической лампой накаливания мощностью 100 ватт, расположенной на высоте 1 м от пола. Мышь помещалась в один из ее углов и в течение 3-х минут раздельно в первую и две последующие минуты регистрировали количество перемещений с квадрата на квадрат (горизонтальная активность), количество вставаний на задние лапки (вертикальная активность), количество обследований отверстий (норковый рефлекс), количество умываний (груминг), количество актов дефекации по количеству фекальных шариков (болюсов) и вычислялся коэффициент асимметрии поведения в виде отношения количества горизонтальных перемещений к общей двигательной активности, выраженного в процентах. Результаты первой и двух последующих минут тестирования оценивались раздельно. Прототипом в данном эксперименте также служил экстракт шлемника байкальского.

При исследовании ориентировочно-исследовательского поведения у животных с разными типами эмоционально-стрессового реагирования в первую минуту исследования у мышей линии BALB/c при применении заявляемого средства В1 в дозе 1 мл/кг наблюдается выраженное увеличение двигательной активности (табл.5). В дозе 0,5 мл/кг оно было представлено только в виде тенденции. В группе животных, получавших прототип, также наблюдалось увеличение активности, но оно касалось только горизонтальной активности, в то время как при применении заявляемого средства В1 отмечалось достаточно равномерное увеличение всех показателей, чем оно выгодно отличалось от прототипа.

У мышей линии С57В1/6 в первую минуту наблюдения отмечалось дозозависимое выраженное снижение активности. Прототип при этом не оказал на поведение мышей данной линии существенного влияния.

Во второй период исследования (2 и 3 минуты наблюдения; табл.6) у мышей линии BALB/c заявляемое средство В1 в дозе 1,0 мл/кг вызвало значимое увеличение активности, хотя и не такое значимое, как в первый период наблюдения, и менее выраженное аналогичное действие в меньшей дозе. Прототип не оказал существенного влияния на поведение животных этой линии во второй период.

У мышей линии С57В1/6 прототип и заявляемое средство В1 в дозе 1,0 мл/кг оказали приблизительно равное угнетающее действие на поведение животных во второй период наблюдения, при этом прототип уступал заявляемому средству В1 по влиянию на норковый рефлекс. Заявляемое средство В1 в малой дозе проявило соответственно меньшее действие.

Растормаживание поведения в первый период наблюдения у мышей линии BALB/c и подавление его в первый период наблюдения у мышей линии С57В1/6 характеризует прежде всего анксиолитические свойства препаратов, в то время как снижение поведения во второй период исследования говорит о наличии седативных свойств. Таким образом, проведенные исследования позволяют сделать вывод о том, что заявляемое средство В 1 обладает выраженными анксиолитическими свойствами и в этом отношении превосходит прототип. При этом оно обладает равными с прототипом седативными свойствами.

Таблица 5Влияние заявляемого средства В1 в сравнении с прототипом на ориентировочно-исследовательское поведение в «открытом поле» мышей BALB/c и С57В1/6 в первую минуту исследования (; n=10)ПрепаратСуммарная двигательная активностьГоризонтальная активностьВертикальная активностьНорковый рефлексДефекацияГрумингКоэффициент асимметрииЭмоциональная реакция до «ОП»BALB/cКонтроль17,5±1,19,3±0,70,17±0,178,0±1,00±00±053,7±3,43,6±0,4Заявляемое средство В1 1,0 мл/кг29,7±1,6*15,3±1,2*0±014,1±0,6* #0±00,29±0,1851,2±1,62,4±0,3*Заявляемое средство В1 0,5 мл/кг22,8±3,012,0±1,90±010,8±1,30±00±051,5±2,52,9±0,4Прототип50 мг/кг26,7±2,3*16,6±1,3*0±09,8±1,6*0±00,33±0,1261,5±4,62,7±0,3*С57В1/6Контроль34,8±3,225,2±2,72,8±0,46,8±0,60±00±071,6±1,65,6±0,5Заявляемое средство В1 1,0 мл/кг9,3±2,3*#5,2±1,3* #0,7±0,3*#2,6±0,8*#0,14±0,140,5±0,2*#58,9±3,9*2,6±0,4Заявляемое средство В1 0,5 мл/кг16,6±2,6*9,8±2,12±1,08,6±1,80±00,34±0,07*60,0±7,83,2±0,3Прототип 50 мг/кг33,2±3,822,14±3,22,7±0,74,1±1,00±00,12±0,0467,3±5,12,9±0,4Примечание: * - различия статистически достоверны по отношению к показателям контрольной группы животных; # - к показателям группы, получавшей прототип при Pt<0,05, Pu<0,05.

Таблица 6Влияние заявляемого средства в сравнении с прототипом на ориентировочно-исследовательское поведение в «открытом поле» мышей BALB/c и С57В1/6 во вторую и третью минуты исследования (; n=10)ПрепаратСуммарная двигательная активностьГоризонтальная активностьВертикальная активностьНорковый рефлексДефекацияГрумингКоэффициент асимметрииЭмоциональная реакция после «ОП»BALB/cКонтроль34,2±3,217,3±1,30,7±0,415,0±1,70±01,17±0,1751,4±2,06,2±0,8Заявляемое средство В1 1,0 мл/кг54,1±4,6*#26,2±2,9*1,2±0,3*25,8±2,9*0±00,71±0,1848,4±3,73,5±0,7*Заявляемое средство В10,5 мл/кг40,1±2,918,8±3,40,3±0,120,1±2,20,4±0,30,4±0,345,7±5,33,0±0,9*Прототип 50 мг/кг38,5±4,019,7±3,31,3±0,316,8±2,10±00,45±0,1349,7±5,04,2±0,7*С57В1/6Контроль68,0±7,343,8±5,410,3±2,213,2±1,00,51±0,320,17±0,1763,7±3,09,8±0,9Заявляемое средство В1 1,0 мл/кг31,4±7,6*19,8±5,1*5,71±1,5*5,14±1,5*0,43±0,20,2±0,163,9±3,23,7±0,8*Заявляемое средство В1 0,5 мл/кг50,3±5,231,4±4,45,3±0,712,1±1,50,57±0,20,86±0,3461,1±3,25,6±0,6*Прототип 50 мг/кг37,0±2,4*19,0±1,94*2,4±0,4*14,1±1,70,34±0,120,56±0,3151,0±3,4*4,7±0,4*Примечание:* - различия статистически достоверны по отношению к показателям контрольной группы животных; # - к показателям группы, получавшей прототип при Pt<0,05, Pu<0,05.

Пример №6. Изучение влияния заявляемого средства В1 и прототипа на выработку и воспроизведение сложного условного питьевого рефлекса

Изучение влияния прототипа и заявляемого средства В1 на условно-рефлекторную деятельность проводилось на модели условного питьевого рефлекса в сложном трехзвенном Т-образном лабиринте [26]. В качестве прототипа в данном исследовании был выбран препарат на основе экстракта корня женьшеня - «Гинсана» ("Pharmaton" Швейцария). Положительное влияние этого препарата на процессы обучения широко известно [8,9].

Опыты выполнялись на крысах на фоне водной депривации. Выработку питьевого рефлекса выполняли у здоровых животных.

Лабиринт представлял собой установку, состоящую из одной стартовой камеры и двух систем коридоров, каждая из которых включала в себя по 3 Т-образных колена, спирально соединенных между собой и заканчивающихся целевыми камерами. Процедура обучения выглядела следующим образом: предварительно крыс оставляли без воды на одни сутки. Затем в течение 2-х дней каждую крысу дважды в день на 20 минут с интервалом в 1 час индивидуально помещали в лабиринт, где беспорядочно были расставлены 6 поилок (первый этап обучения). На третий день животное помещалось в стартовую камеру лабиринта, при этом все поилки из последнего были убраны. Крыса начинала искать поилку, выходила из стартовой камеры и делала первый поворот в правую или левую часть лабиринта. Направление первого поворота фиксировалось и считалось предпочтительным направлением поворота для данного животного. Немедленно вслед за этим в целевую камеру, находящуюся в половине лабиринта противоположной, той в которую крыса повернула в первый раз, ставилась поилка. При всех последующих побежках поилка ставилась для данной крысы именно в эту целевую камеру. Это делалось для того, чтобы при становлении условного рефлекса исключить влияние предпочтительного направления поворота на процесс обучения. Каждое животное тестировалось в лабиринте таким образом в течение 15 минут, если оно не находило поилку раньше. Если животное не находило поилку в течение 15 минут, его помещали в целевую камеру, чтобы крыса могла напиться. В тот же день животное через 1 час совершало вторую побежку. Таким образом, каждая крыса обучалась в течение 8 дней, совершая 16 побежек. Крысы, отказавшиеся искать поилку в течение первых 4-х побежек, из дальнейших экспериментов исключались.

Оценка условнорефлекторной деятельности производилась по времени достижения поилки, количеству ошибок (заходы в неправильные рукава лабиринта и тупики), количеству вертикальных стоек и грумингу. Выделялись также периоды полной неподвижности продолжительностью более 15 секунд. Они расценивались как фризинговые реакции и их общая продолжительность регистрировалась в качестве самостоятельного показателя. О качестве обучения судили по сокращению времени достижения поилки, продолжительности фризинговых реакций и количества ошибок. Груминг и вертикальные стойки характеризовали смещенную и ориентировочно-исследовательскую активность соответственно. Отказ от поиска поилки после двух успешных ее нахождений, отказ от питья после успешного обнаружения поилки считались проявлением невротической реакции [27] и оценивались как самостоятельный показатель по величине отношения числа невротических реакций, наблюдавшихся за время обучения, считая после 2-й побежки, к общему числу побежек без двух первых. Невротическими реакциями считались также длительные (более 5 минут) непрерывные фризинговые эпизоды. Для дополнительной оценки условнорефлекторной деятельности оценивался индекс двигательной активности, направленной на достижение поилки, и представлявший собой количество горизонтальных перемещений по лабиринту в единицу времени (ИДА в таблице) и отношение количества горизонтальных перемещений, совершенных животным до достижения поилки, ко времени достижения поилки в минутах.

Об эффекте препаратов судили по усредненной разнице показателей 7-10-й побежек между контрольными и опытными группами, так как именно в этот период наблюдалась максимальная разница между контрольной группой и группами, получавшими заявляемое средство В1 и прототип.

Проведенные исследования показали (табл.7), что заявляемое средство В1 существенно улучшало процедуру выработки условного рефлекса. Уменьшилось количество ошибок, резко сократилось время достижения поилки, продолжительность фризинговых эпизодов, количество невротических реакций, возрос индекс двигательной активности. Прототип уступал заявляемому средству по ряду параметров. Значимые различия наблюдались по времени достижения поилки, количеству невротических реакций и продолжительности фризинговых эпизодов. В значительной мере худшие результаты условнорефлекторной деятельности при применении прототипа вызваны существенным увеличением груминга, что является характерным свойством препаратов женьшеня в условиях данной методики. Груминг является смещенной активностью и, конечно, должен рассматриваться как нежелательное явление. Заявляемый препарат лишен этого качества.

Были исследованы также биологически активные свойства двух других представителей рода незабудки (Miosotis) - незабудки болотной (Myosotis palustris L.) и незабудки лесной (Myosotis sylvatica L.) Заявляемое средство - варианты 2 и 3 - В2 и В3.

Таблица 7Влияние заявляемого средства В1 в сравнении с прототипом на усредненные показатели второго этапа обучения (7-10 побежки) при выработке питьевого рефлекса у крыс (; n=10)ГруппыВертикальная активностьГрумингДефекацияКоличество ошибокВремя достижения поилки, секВремя замирания, секКоличество невротических реакцийИДАКонтроль11,2±1,79,3±2,00,2±0,122,8±3,5466,8±27,3197,5±21,20,43±0,099,2±1,4Заявляемое средство В1 1,0 мл/кг8,9±1,44,1±0,9*#0±012,4±3,9*124,8±17,1*#12,6±1,6*#0,12±0,03* #16,4±2,5*Прототип 100 мг/кг13,3±2,019,6±3,4*0,05±0,0518,5±2,7*259,5±16,2*49,4±9,6*0,26±0,04*11,6±1,5*Примечание: * - различия статистически достоверны по отношению к показателям контрольной группы животных; # - к показателям группы, получавшей прототип при Pt<0,05, Pu<0,05.

Пример №7. Исследование влияния препарата из сырья незабудки болотной (Myosotis palustris L.) - заявляемое средство В2 - на выработку условного рефлекса и поведение в конфликтной ситуации.

Для исследования был взят экстракт (высушенная и измельченная смесь надземной и подземной частей) незабудки болотной (Myosotis palustris L.).

Эксперименты проводились по методикам, описанным в примерах 4 и 6. Данные исследований приведены в таблицах 8 и 9. Приведенные данные показывают, что заявляемое средство В2 в обеих методиках превосходит прототип. Сравнение данных таблиц 4 и 7, в которых приведены данные биологической активности заявляемого средства В1, показывает, что заявляемое средство В2 не уступает по активности заявляемому средству В1 по главным показателям влияния на условнорефлекторную деятельность (время достижения поилки, время замирания, груминг и количество невротических реакций) и поведение в конфликтной ситуации (количество наказуемых взятий воды, груминг и время замирания).

Таблица 8Влияние заявляемого средства (В2 и В3) в сравнении с гинсаной (прототип) на усредненные показатели второго этапа обучения (3-6 побежки) при выработке питьевого рефлекса у нормальных животных и после длительного введения токсических доз кофеина и алкоголя (; n=10)ГруппыВертикальная активностьГрумингКоличество ошибокВремя достижения поилки, секВремя замирания, секКоличество невротических реакцийИДАКонтроль6,4±1,75,8±0,96,6±1,1295,4±32,4155,3±12,90,32±0,077,3±1,1Заявляемое средство (В2) 1,0 мл/кг3,4±0,7*2,9±0,4*#2,3±0,8*72,0±9,5*#32,6±7,4*0,05±0,02*#13,8±0,8*#Заявляемое средство (В3) 1,0 мл/кг2,3±0,4*#1,8±0,5*#2,0±0,6*64,3±11,8*#44,3±12,1*0,04±0,01*#12,2±1,7*#Прототип 100 мг/кг4,1±1,1*10,6±1,13,1±0,5*116,0±14,1*18,9±6,7*0,12±0,03*8,9±0,5*Примечание: * - различия статистически достоверны по отношению к показателям контрольной группы животных; # - к показателям группы, получавшей прототип при Pt<0,05, Pu<0,05.

Таблица 9Влияние заявляемого средства (В2 и В3) в сравнении с прототипом на показатели поведения крыс в условиях конфликтной ситуации (; n=10).ПоказателиГруппы наблюденияКонтрольПрототип 50 мг/кгЗаявляемое средство (В2) 1,0 мл/кгЗаявляемое средство (В3) 1,0 мл/кгГоризонтальная активность45,7±3,956,4±7,178,2±5,1*#82,6±9,1*#Вертикальная активность7,9±2,218,9±1,5*16,3±2,1*19,4±2,8*Груминг21,0±3,326,1±3,27,9±1,8* #12,3±1,5*#Болюсы3,1±0,72,7±0,71,9±0,71,4±0,2Время замирания568±54316±29*142±18*#197±29*#Подходы к поилке8,5±2,015,5±2,8*19,9±3,3*#21,6±3,8*#Количество наказуемых взятий воды192±40461±57*665±69*#703±97*#Общая двигательная активность86,2±10,4119,6±12,7*124,2±13,6*137,3±19,6*Примечание: * - различия статистически достоверны по отношению к показателям контрольной группы животных; # - к показателям группы, получавшей прототип при Pt<0,05, Pu<0,05.

Пример №8. Исследование влияния препарата из сырья незабудки лесной (Myosotis sylvatica L.) - заявляемое средство В3 - на выработку условного рефлекса и поведение в конфликтной ситуации.

Для исследования был взят экстракт (высушенная и измельченная смесь надземной и подземной частей) - в таблицах обозначен как заявляемое средство «Вариант 3».

Эксперименты проводились по методикам, описанным в примерах 4 и 6. Данные исследований приведены в таблицах 8 и 9. Приведенные данные показывают, что заявляемое средство В3 в обеих методиках превосходит прототип. Сравнение данных таблиц 4 и 7, в которых приведены данные биологической активности заявляемого средства В1, показывает, что заявляемое средство ВЗ не уступает по активности заявляемому средству В1 по главным показателям влияния на условнорефлекторную деятельность (время достижения поилки, время замирания, груминг и количество невротических реакций) и поведение в конфликтной ситуации (количество наказуемых взятий воды, груминг и время замирания).

Таким образом, приведенные примеры говорят, что биологически активные вещества водного или водно-спиртового или углекислотного экстракта растения рода незабудки (Myosotis) в равной мере обладают описываемыми активностями.

Во всех экспериментах данные обрабатывались статистически с использованием паметрического критерия Стьюдента-Фишера (Pt) и непараметрического критерия Вилкоксона (Pu) [28].

В результате проведенных исследований было показано, что заявляемое средство обладает:

1. Противосудорожным действием, оно способно предупреждать судороги, вызываемые введением тиосемикарбазида и коразола.

2. Ноотропным действием - способностью улучшать обучаемость и память.

3. Активно при нарушениях памяти, вызываемых скополамином, можно говорить о том, что оно будет активно при старческих нарушениях памяти, в частности при болезни Альцгеймера, так как при этой патологии существенное место в механизме развития заболевания занимают нарушения холинергической регуляции процессов памяти.

4. Является эффективным корректором нарушений синаптической передачи в ГАМК-ергических синапсах и в холинореактивных структурах, поэтому можно говорить, что его применение способствует улучшению деятельности медиаторных систем мозга.

5. Средство проявляет выраженную анксиолитическую активность на двух моделях - в условиях конфликтной ситуации и у мышей с различными типами стрессового реагирования.

6. Средство улучшает высшую нервную деятельность животных в условиях повреждений, вызываемых перевозбуждением центральных нервных структур, в результате введения коразола и тиосемикарбазида. Кроме того, оно существенно улучшило поведение животных в условиях стресса новизны, каковым является ориентировочно-исследовательское поведение в «открытом поле». Поэтому можно говорить о наличии у него церебропротекторных свойств.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ханин Г.З. Противосудорожный препарат из водяники черной: Автореф. дисс. кан.мед.наук. - Томск, 1988.

2. Orloff M.J., Williams H.J., Pfeiffer P.C. Timed intravenous infusion of metrasol and strychnine for testing anticonvulsant drugs. // Proc. Soc. Exp. Biol. (N.-Y.), 1949. - V.70. - P. 254-257.

3. Вихляев Ю.И., Воронина Т.А., Гарибова Т.Л. и др. Феназепам. - Киев: Наукова Думка, 1982. - 452 С.

4. Porzolt R.D., Bertini A., Jare M. Pharmacological model of depression. // Arch. Jut. Pharmacodyn. - 1977. - V. 229. - P. 327.

5. Андреева Н.И. Методические указания по изучению антидепрессантной активности фармакологических веществ. // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - M., 2000. - С.121 - 125.

6. Borsini F., Meli A. Is the forced swimming test a suitable model for revealing antidepressant activity? // Psychopharmacology. - 1988. - V. 94. - №2. - P. 147-160.

7. Каркищенко Н.Н., Хайтин М.И. Сравнительное исследование некоторых показателей антидепрессивной активности калия оротата и пирацетама. // Фармакол. и токсикол. - 1985. - №2. - С.32-35.

8. Petkov V.D., Mosharrof A.H. Effect of standardized extract from ginseng on the exploratory behaviour in rats. - Comptes rendus de l' Académic des Sciences.-1987. - T. 40. - N 12. - P.113-116.

9. Petkov V. Effect of Ginseng on the brain biogenic monoamines and 3',5'-AMP system. // Arzneimittel-Forschung / Drug research. - 1978. - Vol.28. - № 3.-P. 388-393.

10. Машковкий М.Д., Андреева Н.И., Полежаева А.И. Фармакология антидепрессантов. - М.: Медицина, 1983. - 240 С.

11. Машковский М.Д. Лекарственные средства. 15-е изд, перераб., испр. и доп. - М.: «Издательство Новая Волна», 2005. - 1200 С.

12. Шабанов П.Д., Бородкин Ю.С. Нарушения памяти и их коррекция. - Л.: Наука, 1989. - 127 С.

13. Winkler J., Ramirez G.A., Thal L.J., Waite J. J. Nerve Growth Factor (NGF) Augments Cortical and Hippocampal Cholinergic Functioning after p75NGF Receptor-Mediated Deafferentation But Impairs Inhibitory Avoidance and Induces Fear-Related Behaviors. // The Journal of Neuroscience. - 2000. - Vol.20. - №2. - P.834-844.

14. Воронина Т.А., Островская Р.У. Методические указания по изучению ноотропной активности фармакологических веществ. // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., 2000. - С.153 - 158.

15. Cummings J.L, Kaufer D. Neuropsychiatric aspects of Alzheimer's disease: The cholinergic hypothesis revisited. - Neurology. - 1996. - Vol.647. - P.876-883.

16. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Дж. П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. / пер. с англ. Под ред. проф. А.С.Батуева). - М.: Высшая школа, 1991. - 398 С.

17. Воронина Т.А., Середенин С.Б. Методические указания по изучению транквилизирующего (анксиолитического) действия фармакологических веществ. // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., 2000. - С.126-130.

18. Клыгуль Т.А., Кривопалов В.А. Установка с автоматической регистрацией поведения крыс для оценки действия малых транквилизаторов. // Фарм. и токс. - 1966. - №2. - С.241-244.

19. Шлемник байкальский: Фитохимия и фармакологические свойства. / Е.Д.Гольдберг, А.М.Дыгай, В.И.Литвиненко, Т.П.Попова и др. - Томск: Изд-во Том. ун-та, 1994. - 224 С.

20. Мак-Фарленд Д. Поведение животных. Психобиология, этология и эволюция. Пер. с англ. - М.: Мир, 1988. - 520 С.

21. Маркель А.Л., Галактионов Ю.К., Ефимов В.Н. Факторный анализ поведения крыс в тесте открытого поля. // Журн. Высш. Нервн. Деят., 1988. - Т. 38. - №5. - С.855-864.

22. Walsh R.N., Cummins R.A. The open-field test: a critical review. // Psychol. Bull. - 1976, V.83. - P. 482-504.

23. Dulawa S.C., Grandy D.K., Low M.J., Paulus M.P. and Geyer M.A. Dopamine D4 Receptor-Knock-Out Mice Exhibit Reduced Exploration of Novel Stimuli // The Journal of Neuroscience. - 1999. - Vol.19. - № 21. - P.9550-9556.

24. Birikh К. R., Sklan E.H., Shoham S., Soreq H. Interaction of "readthrough" acetylcholinesterase with RACK1 and PKCβII correlates with intensified fear-induced conflict behavior // PNAS. - 2003. - Vol.100 №1. - P.283 -288.

25. Китаев-Смык Л. А. Психология стресса. - М.: Наука. - 1983.- 368 С.

26. Азарашвили А.А. Исследование механизмов памяти с помощью физиологически активных соединений. - М.: Наука. - 1981. - 1983 С.

27. Крушинский Л.В. Биологические основы рассудочной деятельности. - М.: Изд-во Московского ун-та, 1986. - 276 С.

28. Зайцев Г.Е. Математическая статистика в экспериментальной ботанике. - М.: Наука. - 1984. - 425 С.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается применения средства растительного происхождения в качестве средства, обладающего анксиолитической, ноотропной, противосудорожной, церебропротекторной активностью и способностью нормализовать процессы передачи в синапсах мозга. Предложено применение водного или водно-спиртового или углекислотного экстракта растения рода незабудки (Myosotis) в качестве средства, обладающего анксиолитической, ноотропной, противосудорожной, церебропротекторной активностью и способностью нормализовать процессы передачи в синапсах мозга. Экстракт незабудки может быть использован в жидкой форме и в форме сухого экстракта. Средство обладает широким спектром терапевтического действия по заявленному фармакологическому назначению. 2 з.п. ф-лы, 9 табл.

1. Применение водного или водно-спиртового или углекислотного экстракта растения рода незабудки (Myosotis) в качестве средства, обладающего анксиолитической, ноотропной, противосудорожной, церебропротекторной активностью и способностью нормализовать процессы передачи в синапсах мозга.2. Применение по п.1, отличающееся тем, что экстракт незабудки используют в жидкой форме.3. Применение по п.1, отличающееся тем, что экстракт незабудки используют в форме сухого экстракта.