СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНКСИОЛИТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ, НА ОСНОВЕ ГИДРИРОВАННЫХ ПИРИДО(4,3-b)ИНДОЛОВ (ВАРИАНТЫ), ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2008 года по МПК A61K31/437 A61P25/22 

Изобретение относится к области медицины, а именно к использованию химических соединений с целью создания лекарственных средств для лечения и предупреждения стрессов, тревоги, неврозов, навязчивых страхов и их последствий.

В настоящее время в связи с увеличением количества психотравмирующих, стрессирующих факторов, нарастающим ритмом жизни, интенсификацией труда, ростом потока информации, экологическими проблемами, природными катаклизмами и т.д. резко увеличивается число пациентов с невротическими и неврозоподобными состояниями, сопровождающимися тревогой, страхами, повышенной эмоциональной лабильностью, которые в психиатрии определяют как пограничные состояния, протекающие без грубых психических дефектов и дегенерации мозга. Нарушения эмоциональной сферы наблюдаются и при хронических соматических заболеваниях. В экономически развитых странах на долю невротических заболеваний в группе психических болезней приходится не менее 80%, а среди здорового населения неврозы наблюдаются у 10-12% (Арушанян Э.Б. Анксиолитические средства. Ставрополь: Ставропольская медицинская академия, 2001, 240 с.).

В настоящее время при стрессе, тревоге и страхах применяются анксиолитики - лекарства, уменьшающие данные патологии. Наибольшее применение имеют препараты бензодиазепинового ряда, среди которых эталонным препаратом является диазепам (седуксен, валиум). Однако препараты бензодиазепинового ряда, в том числе и диазепам, имеют значительные побочные эффекты. Уже в терапевтических дозах эти препараты вызывают седацию, миорелаксацию, нарушение памяти, риск возникновения лекарственной зависимости. (Регистр лекарственных средств России. Энциклопедия лекарств. - 14 вып., ред. Г.Л.Вышковский. - М., РЛС, 2006)

В связи с этим проводятся поиски анксиолитиков нового поколения, не обладающих побочными эффектами бензодиазепиновых транквилизаторов.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является расширение арсенала средств, которые могут быть использованы в качестве новых анксиолитиков - эффективных лекарств для лечения и предупреждения стрессов, тревоги, неврозов, навязчивых страхов и их последствий.

Поставленная задача решается применением гидрированных пиридо([4,3-b])индолов формулы (1) или формулы (2) в качестве анксиолитического средства.

В случае применения соединений формулы (1) R¹ выбирают из группы, содержащей СН₃-, СН₃CH₂- или PhCH₂;

R² выбирают из группы, содержащей Н, PhCH₂ или 6-СН₃-3-Py-(СН₂)₂-;

R³ выбирают из группы, содержащей Н, СН₃- или Br-.

Указанные соединения могут представлять собой соли с фармацевтически приемлемыми кислотами.

Одним из соединений, которое можно применять в качестве анксиолитического средства, может быть соединение формулы (1), в котором R¹ соответствует СН₃-, R² - Н-, а R³ - СН₃-.

В случае применения соединений формулы (2) R¹ выбирают из группы, содержащей СН₃-, СН₃СН₂- или PhCH₃-;

R² выбирают из группы, содержащей Н-, PhCH₂- или 6-СН₃-3-Py-(СН₂)₂-, а

R³ выбирают из группы, содержащей Н-, СН₃- или Br-.

Указанные соединения могут представляют собой соли с фармацевтически приемлемыми кислотами.

Одним из соединений, которое можно применять в качестве анксиолитического средства и которое может применяться для лечения и предупреждения стрессов, тревоги, неврозов, навязчивых страхов и их последствий, может быть соединение формулы (2), в котором R¹ соответствует СН₃СН₂- или PhCH₂-, R² соответствует Н-, а R³ - Н-.

Или соединение формулы 2, где R¹ соответствует СН₃-, R² соответствует PhCH₂-, а R³ - СН₃-.

Или соединение формулы 2, где R¹ соответствует СН₃-, R² соответствует 6-СН₃-3-Py-(CH₂)₂-, а R² - H-.

Или соединение формулы 2, где R¹ соответствует СН₃-, R² соответствует 6-СН₃-3-Py-(СН₂)₂-, а R³ - СН₃-.

Или соединение формулы 2, где R¹ соответствует СН₃-, R² соответствует Н-, а R³ - Н- или СН₃-.

Или соединение формулы 2, где R¹ соответствует СН₃-, R² соответствует Н-, a R³ - Br-.

Любое из вышеуказанных соединений может применяться в качестве анксиолитического средства для лечения и предупреждения стрессов, тревоги, неврозов, навязчивых страхов и их последствий.

Гидрированные пиридо([4,3-b])индолоы формулы (1) или формулы (2) являются известными соединениями, широко применяемыми в фармакологической практике. Были проведены обширные исследования ряда известных соединений, представляющих производные тетра- и гексагидро-1Н-пиридо([4,3-b])индола (здесь и далее все соединения подпадают под формулы (1) и (2)) и проявляющих широкий спектр биологической активности. В ряду 2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо[4,3-b]индолов были обнаружены следующие виды активности: антигистаминная (OS-DE N1813229 от 6 декабря 1968, N1952800 от 20 октября 1969), центрально-депрессантная, противовоспалительная (USP N3718657 от 13 декабря 1970), нейролептическая (Herbert С.А., Planner S.S., Wehch W.N, Mol. Pharm., 1980, v.17. N I, p.38-42) и другие. Производные 2,3,4,4а,5,9b-гексагидро-1Н-пиридо[4,3-b]индола проявляют психотропную (Welch W.H, Herbert С.А., Weissman А., Кое К.В, J. Med. Chem, 1986, vol.29, N 10, р.2093-2099), антиагрессивную, антиаритмическую и другие виды активности.

Все указанные выше соединения являются известными из литературы и включают следующие конкретные соединения:

1. цис(±)2,8-диметил-2,3,4,4а,5,9b-гексагидро-1H-пиридо/4,3-b/индол и его дигидрохлорид;

2. 2-этил-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо/4,3-b/индол;

3. 2-бензил-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо/4,3-b/индол;

4. 2,8-диметил-5-бензил-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо/4,3-b/индол и его гидрохлорид;

5. 2-метил-5-/2-(6-метил-3-пиридил)этил-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо/4,3-b/индол и его моногидрат сесквисульфата;

6. 2,8-диметил-5-/2-(6-метил-3-пиридил)этил-2,3,4,5-тетрагидро-1H-пиридо/4,3-b/индол и его дигидрохлорид (димебон).

7. 2-метил-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо/4,3-b/индол;

8. 2,8-диметил-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо/4,3-b/индол и его метилиодид;

9. 2-метил-8-бром-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо/4,3-b/индол и его гидрохлорид.

О получении и нейролептических свойствах соединения 1 известно, например, из публикации: Яхонтов Л.Н. и Глушков Р.Г. Синтетические лекарственные средства. / Под ред. А.Г.Натрадзе. - М.: Медицина, 1983, стр.234-237. Получение соединений 2, 8 и 9, а также сведения о том, что они обладают свойствами антагонистов серотонина, описываются, например, C.J.Cattanach, A.Cohen & B/H/Brown in J. Chem. Soc. (ser.C), 1968, 1235-1243. Синтез соединения 3 описывается, в частности, в статье N.P.Buu-Hoi, O.Roussel, P.Jacquignon, J.Chem.Soc., 1964, N2, стр.708-711. Н.Ф.Кучерова и Н.К.Кочетков в "Общей химии", 1956, т.26, стр.3149-3154 описывают синтез соединения 4, а о получении соединений 5 и 6 известно, например, из статьи А.Н.Кост, М.А.Юровской, Т.В.Мельниковой в "Химии гетероциклических соединений", 1973, N2, стр.207-212. В публикациях U.Horlein, Chem. Ber., 1954, Bd.87, hft. 4, 463-472 описывается синтез соединения 7. М.А.Юровская, И.Л. Родионов в "Химии гетероциклических соединений", 1981, N8, стр.1072-1078 описывают получение метилиодида соединения 8.

На основе производных тетра- и гексагидро-1Н-пиридо[4,3-b]индола выпускается несколько лекарственных препаратов: диазолин (mebhydroline), димебон, дорастин, карбидин (дикарбин), стобадин, гевотролин. Диазолин (2-метил-5-бензил-2,3,4,5-тетра-гидро-1-пиридо[4,3-b]индол)дигидрохлорид (Клюев М.А. Лекарственные средства, применяемые в медицинской практике СССР. - М.: Медицина 1991, стр.512) и димебон (дигидрохлорид 2,8-диметил-5-(2-(6-метил-пиридил-3)этил)-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо[4,3-b]индола) (Машковский М.Д. Лекарственные средства. В 2 ч., ч.1, 12-е изд. - М.: Медицина, 1993, с.383), а также его близкий аналог дорастин (2-метил-8-хлор-5-(2-(6-метил-3-пиридил)этил)-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо[4,3-b]индол)дигидрохлорид (USAN and USP dictionary of drugs names (United States Adopted Names 1961-1988, current U.S. Pharmacopeia and National Formular for Drygs, and other nonproprietary drug names), 1989, 26th Edition, p.196) известны как антигистаминные препараты. Карбидин (дикарбин) (дигидрохлорид цис(±)-2,8-диметил-2,3,4,4а,5,9b-гексагидро-1Н-пиридо[4,3-b]индола) является отечественным нейролептиком с антидепрессантным эффектом (Яхонтов Л.Н., Глушков Р.Г. Синтетические лекарственные средства. / Под ред. А.Г.Натрадзе. - М.: Медицина, 1983, с.234 - 237), а его (-)-изомер, стобадин, известен как антиаритмическое средство (Kitlova М., Gibela P., Drimal J., Bratisi. Lek. Listy, 1985, V.84, N5, p.542-546).

В последние годы было найдено, что производные гидрированных пиридо[4,3-b]индолов формулы (1) или (2), в частности димебон, способны действовать на два основных подтипа ионотропных глутаматных рецепторов ЦНС млекопитающих - АМРА- и NMDA-рецепторы, что позволяет использовать их в качестве средства для лечения Болезни Альцгеймера и геропротекторного средства. Димебон потенцирует трансмембранные токи, вызываемые активацией АМРА-рецепторов, и одновременно блокирует NMDA-рецепторы. (В.В.Григорьев, О.А.Драный, С.О.Бачурин. Сравнительное исследование механизма действия препаратов димебона и мемантина на АМРА- и NMDA-подтипы глутаматных рецепторов нейронов головного мозга крыс // Бюлл. Экспер. Биол. мед., 2003, №11, с.535-538)

Авторами изобретения неожиданно было найдено, что соединения формулы (1) и формулы (2) обладают анксиолитическим действием благодаря обнаружению у них новых свойств, которые не вытекают из химической структуры этих соединений и ранее известных свойств (в частности, положительных модуляторов АМРА-рецепторов или блокаторов NMDA-рецепторов) и могут быть использованы в качестве лекарственного анксиолитического средства.

Согласно изобретению фармакологическое средство, обладающее анксиолитическим действием, содержащее активное начало и фармацевтически приемлемый носитель в качестве активного начала, содержит эффективное количество гидрированного пиридо(4,3-b)индола формулы (1) или формулы (2).

Понятие «фармакологическое средство» подразумевает использование любой лекарственной формы, содержащей соединение формулы (1) или формулы (2), которые могли бы найти профилактическое или лечебное применение в медицине в качестве анксиолитического средства и применяться для лечения и предупреждения стрессов, тревоги, неврозов, навязчивых страхов и их последствий.

Понятие «эффективное количество», используемое в данной заявке, подразумевает использование того количества соединений формулы (1) или формулы (2), которое в соединение с его показателями активности и токсичности, а также на основании знаний специалиста должно быть эффективным в данной лекарственной форме.

Для получения фармакологического средства одно или несколько соединений формулы (1) или формулы (2) смешиваются как активный ингредиент с фармацевтически приемлемым носителем, известным в медицине согласно принятым в фармацевтике способам. В зависимости от лекарственной формы препарата носитель может иметь различные формы.

Согласно изобретению способ лечения и предупреждения стрессов, тревоги, неврозов, навязчивых страхов и их последствий заключается во введении пациенту фармакологического средства, содержащего эффективное количество гидрированного пиридо(4,3-b)индола формулы (1) или формулы (2), в дозе 0,1-10 мг/кг массы тела по крайней мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.

Данный диапазон доз фармакологического средства подтвержден нами приведенными ниже примерами с учетом рекомендаций по перерасчету доз для животных и человека, данных в книге «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (М.: Минздрав РФ. - 2005. - Стр.207).

Соединения формулы (1) или формулы (2) могут вводиться в виде общепринятых оральных композиций, таких как таблетки, таблетки с покрытием, желатиновые капсулы с твердым и мягким покрытием, эмульсии или суспензии. Примерами носителей, которые могут использоваться для изготовления таких композиций, являются лактоза, кукурузный крахмал или его производные, тальк, стеариновая кислота или ее соли и т.п. Приемлемыми носителями для желатиновых капсул с мягким покрытием являются, например, растительные масла, воски, жиры, полутвердые и жидкие полиолы и т.п. Кроме того, фармацевтические препараты могут содержать консерванты, солюбилизаторы, стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы, подсластители, красители, корригенты, соли для изменения осматического давления, буферы, покрывающие агенты или антиоксиданты. Они могут также содержать и другие вещества, обладающие ценными терапевтическими свойствами. Препаративные формы могут представлять собой обычную стандартную дозу и могут быть приготовлены известными в фармации способами.

Техническим результатом, который может быть получен при осуществлении изобретения, является излечение или существенное снижение уровня стрессов, тревоги, неврозов, навязчивых страхов и их последствий.

В таблице 1 приведены данные по числу наказуемых взятий воды - основной показатель поведения в конфликтной ситуации, характеризующий анксиолитическое действие димебона в тесте конфликтной ситуации по Vogel, в зависимости от дозы применения димебона.

В таблице 2 приведены данные по влиянию димебона на поведение крыс в условиях методики приподнятого крестообразного лабиринта, используемой для определения анксиолитического действия димебона.

В таблице 3 приведены данные по влиянию димебона на поведение крыс в стрессорной ситуации открытого поля.

В таблице 4 приведены данные по влиянию димебона на поведение мышей линии SAMP 10 с генетически детерминированным повышенным уровнем тревоги в условиях методики приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ) для двух групп мышей разного возраста - 3 мес и 11 мес.

Где * - Достоверность разницы с контролем при Р<0,05. (Р - вероятность различий между контрольной и опытной группами считается достоверной, если Р≤0,05.)

Знак ^# показывает достоверную разницу в признаках тревожности между молодыми и старыми мышами, у которых появились признаки стресса и тревожности.

Возможность осуществления изобретения с реализацией заявляемого назначения и получением технического результата подтверждается, но не исчерпывается следующими примерами.

Для оценки анксиолитического эффекта димебона были использованы базисные сертифицированные методики, рекомендуемые Фармакологическим комитетом МЗ РФ для исследования веществ, обладающих анксиолитическим действием (Воронина Т.А., Середенин С.Б. Методические указания по изучению транквилизирующего (анксиолитического) действия фармакологических веществ. - Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М. - Минздрав РФ. - 2005. - стр.253-262).

Пример 1. Анксиолитическое действие димебона - 3,6-диметил-9-(2-метилпиридил-5)-этил-1,2,3,4-тетрагидро-гамма-карболина дигидрохлорида - в тесте конфликтной ситуации.

Для оценки анксиолитического действия была использована базисная методика конфликтной ситуации по Vogel (Vogel J.R., Beer В., Clody D.E. A simple and reliable conflict procedure for testing antianxiety agents // Psychopharmacologia (Berlin). - 1971. - V.21, P.1-7; Молодавкин Г.М., Воронина Т.А. Многоканальная установка для поиска транквилизаторов и изучения механизмов их действия по методу конфликтной ситуации // Экспер. и клин фармакол. - 1995. - Т.58. - №2. - С.54-56; File S.E. Animal models of different anxiety states // In: GABAa receptors and anxiety: from neurobiology to treatment. - N.Y., Raven Press. - 1995. - P.93-113. Vogel J.R., Beer В., Clody D.E. A simple and reliable conflict procedure for testing antianxiety agents // Psychopharmacologia (Berlin). - 1971. - V.21 - P.1-7), которая является наиболее известным и широко применяемым тестом. Именно конфликтные ситуации наиболее часто приводят к стрессу и невротическим заболеваниям.

Опыты проводили на беспородных белых крысах-самцах массой 220-250 г. Экспериментальные животные до начала опыта случайным образом разделялись на группы не менее чем по 10 крыс в каждой. Конфликтная ситуация создавалась у крыс путем подавления болевым электрическим раздражителем питьевого рефлекса при потреблении животными воды из трубки-поилки. Таким образом, метод основан на столкновении двух мотиваций - питьевой и оборонительной - страха наказания при попытке удовлетворения питьевой потребности, когда наказующий фактор подавляет привычное для животного поведение, в результате чего создается ситуация невозможности осуществления необходимой мотивации и рассогласование желаемого и действительности, что подкрепляется стрессорной ситуацией, тревогой и страхом получения болевого раздражения. В создаваемой ситуации анксиолитический эффект препаратов заключается в преодолении тревоги и страха перед наказующим фактором и в восстановлении значимого для животного поведения, что выражается в увеличении числа наказуемых ответов - взятий воды, несмотря на получение при этом болевых раздражений.

Экспериментальная установка состоит из трех частей: 4-х экспериментальных камер, электронного блока и счетного устройства. Экспериментальная камера размерами 275×275×450 мм изготовлена из органического стекла. Она установлена на стандартный электродный пол, выполненный из прутиков нержавеющей стали диаметром 4 мм с расстоянием между ними 8-10 мм. К боковой стене каждой камеры прикреплена поилка - стеклянный сосуд с соском, изготовленным из нержавеющей стали. В приборе поилка установлена в общем объеме камеры, а не в затемненном отсеке. Сосок выходит на 2 см в камеру на высоте 5 см от пола. Это сделано по той причине, что животные, находясь в новой обстановке, в силу инстинкта стараются спрятаться в темном отсеке и могут находить поилку не в результате целенаправленного поиска для удовлетворения мотивации, а случайно. Электродный пол и сосок поилки присоединен к электронному блоку. Электронный блок содержит стабилизаторы тока (по одному на каждый канал, что обеспечивает возможность независимой регулировки тока в них), формирователи выходных сигналов для счетного устройства и формирователи задержки подачи наказующего тока на поилки в день эксперимента. Он обеспечивает регистрацию ненаказуемых взятий воды во время выработки навыка взятий воды (тренировки, без подачи тока на поилки), а также наказующий ток и сигналы наказуемых взятий воды во время эксперимента. Счетное устройство обеспечивает регистрацию ненаказуемых взятий воды во время тренировки и наказуемых взятий воды во время эксперимента. Регистрацию показателей производили с помощью персонального компьютера Pentium III (550 МГц) с помощью специального устройства, преобразующего выходные сигналы электронного блока конфликтной ситуации в стандартные импульсы, пригодные для ввода в последовательный порт компьютера, и программа (на языке Basic) записи событий и временных интервалов в дисковые файлы. В дальнейшем данные, накопленные в этих файлах, подвергали статистической обработке с помощью статистического пакета "Statistica"® для Windows®.

Опыт проводили в течение 3 дней. В первый день животных полностью лишали питья. На следующий день, т.е. после 24-часовой депривации, проводили выработку навыка взятия воды из поилки. Для этого животных на 5 мин помещали в экспериментальные камеры. Животные обследовали камеру, через некоторое время находили поилку и начинали пить. В этот день на поилку и пол камеры подавали слабый ток (50 мкА), не ощущаемый крысами, поэтому взятия воды были ненаказуемыми, и их число характеризовало выраженность питьевой мотивации. На третий день животных снова на 10 мин помещали в экспериментальные камеры, но на этот раз через 10 сек после первого взятия воды на соски поилок и электродный пол камер подавали постоянный ток силой 0,25 мА, так что каждое взятие воды становилось наказуемым, и поэтому животные испытывали сильный стресс.

Для удовлетворения жажды крысам надо было преодолеть тревогу и страх, развившиеся в результате наказания. Мерой выраженности анксиолитического эффекта препарата считали достоверное увеличение числа наказуемых взятий воды из поилок животными (т.е. взятий воды, несмотря на получение при этом болевого раздражения) в опытной группе по сравнению с контрольными в течение 10 минут регистрации.

Димебон - 3,6-диметил-9-(2-метил-пиридил-5)-этил-1,2,3,4-тетрагидро-гамма-карболина дигидрохлорид - вводили в дозах 0,05; 0,1; 2 и 5 мг/кг внутрибрюшинно за 40 минут до начала эксперимента. Препарат сравнения диазепам (седуксен ЗАО «Гедеон Рихтер-Рус») вводили в терапевтической дозе 2 мг/кг внутрибрюшинно за 40 минут до начала эксперимента. Крысам контрольной группы вводили внутрибрюшинно воду из расчета 0,2 мл/100 г массы.

Поведение контрольных животных после получения неожиданного болевого раздражения в обычной для них обстановке осуществления питьевого рефлекса характеризуется выраженным стрессом. В первый момент у животных наблюдается своеобразным напряжение, замирание и застывание, но затем, поскольку однократное болевое раздражение еще не имеет достаточного подкрепления, а неопределенность его получения в условиях стойкого питьевого рефлекса недостаточно высока, животное вторично делает попытку взятия воды и получает второе болевое раздражение. И с этого момента крыса начинает усваивать предлагаемую ей конфликтную ситуацию - необходимость удовлетворения чувства жажды сталкивается со страхом получения при этом болевого раздражения. Однако, несмотря на получение болевого раздражения, контрольные крысы подходят к поилке, пытаются удовлетворить жажду и получают при этом наказуемые взятия воды (средний показатель - 143,25) за 10 минут регистрации, что рассматривается как основной показатель поведения в конфликтной ситуации (таблица 1).

Установлено, что димебон оказывает отчетливое анксиолитическое действие на поведение животных в конфликтной ситуации. Под влиянием препарата наблюдается статистически достоверное повышение наказуемых взятий воды. Животные продолжают попытки взятия воды, несмотря на получение при этом болевых раздражений. Достоверный эффект наблюдается при использовании димебона в широком диапазоне доз от 0,1 до 5 мг/кг (таблица 1). Анксиолитический эффект димебона имеет дозозависимый характер - с увеличением дозы наблюдается усиление действия препарата.

Эталонный бензодиазепиновый анксиолитик диазепам в дозе 2 мг/кг, также как димебон в такой же дозе, оказывает достоверный анксиолитический эффект через 40 мин после введения (таблица 1). По глубине анксиолитического эффекта в конфликтной ситуации димебон не уступает диазепаму. Вместе с тем при использовании диазепама в терапевтической дозе 2 мг/кг наблюдается седация, уменьшение двигательной активности, нарушение координации движений.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что димебон в широком диапазоне доз (0,1-5,0 мг/кг) обладает выраженным дозозависимым анксиолитическим эффектом в условиях базисного теста конфликтной ситуации и по выраженности эффекта не уступает эталонному препарату - диазепаму. Преимуществом димебона перед диазепамом является отсутствие у него побочных эффектов седативного и миорелаксантного характера.

Пример 2. Анксиолитическое действие димебона в условиях методики приподнятого крестообразного лабиринта.

Для оценки анксиолитического действия димебона применялась также широко используемая для этих целей модель приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ). (Pellow S., et al. Validation of open: closed arm entries in elevated plus-maze as a nuasure of anxiety in the rat. Neurosci Meth J. 1985, №14, p.149-167; Воронина Т.А. и соавт. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М., Медицина. 2005, с.253-263) Модель основана на стрессе и страхе, возникающем у животного при реализации ориентировочно-исследовательского поведения и норкового рефлекса в сложных условиях приподнятого крестообразного лабиринта (новизна обстановки, страх высоты и освещенность).

ПКЛ для крыс представляет собой перекрещенные полоски размером 50×10 см. Два противоположных отсека имеют вертикальные стенки высотой 40 см (защищенные темные рукава), а два других (незащищенные открытые светлые рукава) - лишены защитных стенок. Лабиринт приподнят от пола на 50 см. В месте перекрестка плоскостей находится центральная платформа 10×10 см. Крыс помещали на центральную площадку хвостом к открытому светлому рукаву. Регистрировалось латентное время нахождения на центральной площадке, время, проведенное животными в открытых рукавах, число заходов в открытые и закрытые рукава. Общее время наблюдения для каждого животного составляло 5 мин. Основным критерием анксиолитического действия является показатель времени проведенного в открытых светлых рукавах установки. Число пересечений центральной платформы (число заходов в темный и светлый рукава лабиринта и их сумма) использовали для оценки влияния соединений на ориентировочно-исследовательское поведение и двигательную активность крыс.

Эксперименты проводились на белых беспородных крысах, самцах массой 240-280 г. Экспериментальные животные до начала опыта случайным образом разделялись на группы не менее чем по 10 крыс в каждой. Животным опытных групп внутрибрюшинно вводили димебон в дозах 0,1 и 2,0 мг/кг и препарат сравнения - диазепам в дозе 2 мг/кг. Крысам контрольной группы вводили внутрибрюшинно воду из расчета 0,2 мл/100 г массы. Регистрацию эффектов осуществляли через 40 минут после введения препаратов.

Димебон в дозе 0,1 мг/кг значительно, почти в 5 раз, увеличивал основной показатель поведения крыс в ПКЛ - время, проведенное на открытых, опасных рукавах лабиринта. При этом статистически достоверно увеличивалось также количество заходов в светлые рукава без существенного изменения латентного времени нахождения на центральной площадке и количества заходов в темные рукава лабиринта (таблица 2). Подобное изменение поведения крыс в условиях ПКЛ под действием димебона свидетельствует об его стресспротективном, противотревожном эффекте. Увеличение дозы димебона до 2 мг/кг приводило к еще более выраженному увеличению этих эффектов. Об этом свидетельствует значительное увеличение под действием препарата времени, проводимом животными на открытых рукавах лабиринта, и увеличение более чем в два раза количества заходов в них. Димебон в дозе 2 мг/кг не изменял латентного времени нахождения на центральной площадке и лишь незначительно увеличивал количество заходов в темные защищенные рукава лабиринта, так что увеличение общего числа переходов (в 2 раза при Р≤0,05) происходило, в основном, за счет увеличения заходов в светлые рукава лабиринта (табл.2). Подобная стратегия поведения крыс свидетельствует о том, что на фоне отчетливого антистрессового действия у крыс под влиянием димебона улучшается ориентровочно-исследовательское поведение.

Эталонный препарат диазепам в дозе 2 мг/кг, как и димебон, обладал анксиолитическим, значительно увеличивая основной показатель поведения - время, проведенное крысами в открытых рукавах лабиринта. Вместе с тем, на фоне диазепама у животных отмечалось статистически достоверное увеличение латентного времени пребывания крыс на центральной площадке и уменьшение общего числа переходов и количества заходов в темные рукава, что свидетельствует о нарушении ориентировочно-исследовательского поведения, о седативном, депримирующем эффекте препарата (табл.2).

Таким образом, димебон в диапазоне доз 0,1-2,0 мг/кг и в данном тесте обладает анксиолитическим действием и оптимизирует стратегию поведения животных в условиях методики приподнятого крестообразного лабиринта. Анксиолитическое действие эталонного препарата диазепама сопровождается выраженным седативным эффектом.

Пример 3. Анксиолитический эффект димебона при стрессе в тесте открытого поля.

Методика создания стресса в «открытом поле» основана на страхе новизны обстановки, открытого пространства и яркого освещения и используется в эксперименте для оценки анксиолитического действия препаратов (Воронина Т.А., Середенин С.Б. Методические указания по изучению транквилизирующего (анксиолитического) действия фармакологических веществ. - Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М. - Минздрав РФ. - 2005.- Стр.253-262; File S.E. Animal models of different anxiety states // In: GABAa receptors and anxiety: from neurobiology to treatment. - N.Y., Raven Press. - 1995. - P.93-113).

Установка открытого поля, используемая в настоящем исследовании, представляет собой квадратный ящик размером 1×1×1 м, с прозрачной крышкой. Пол камеры равномерно разделен линиями на 9 квадратов с 16 отверстиями диаметром 2,5 см. Предварительно крыс перед экспериментом в течение 10 минут выдерживали в темноте, после чего помещали на один из периферийных квадратов открытого поля. Наблюдение за животным производилось в течение 3-х минут. Фиксировали число пересеченных квадратов на периферии и в центре (отдельно), число вертикальных стоек, число обследований отверстий, количество выходов в центр открытого поля.

Основным показателем анксиолитического эффекта препаратов являлся показатель числа выходов крысы в центр освещенного поля. Уменьшение или увеличение числа горизонтальных или вертикальных перемещений отражает седативное или стимулирующее действие препарата, а число обследованных отверстий характеризует ориентировочно-исследовательское поведение крысы.

Эксперименты проводились на белых беспородных крысах, самцах массой 240-280 г. Экспериментальные животные до начала опыта случайным образом разделялись на группы не менее чем по 10 крыс в каждой. Животным опытных групп внутрибрюшинно вводили димебон и препарат сравнения - диазепам. Крысам контрольной группы вводили внутрибрюшинно воду из расчета 0,2 мл/100 г массы. Регистрацию эффектов осуществляли через 40 минут после введения препаратов.

В контрольной группе девять крыс из десяти не выходили в центр открытого поля, что свидетельствовало о выраженной стрессорной ситуации.

Установлено, что димебон в дозах 2 и 5 мг/кг увеличивал число выходов в центр открытого, освещенного поля, причем этот эффект усиливался с увеличением дозы препарата (таблица 3). Увеличение под влиянием димебона числа выходов в центр открытого, освещенного поля свидетельствует о выраженном анксиолитическом действии препарата. Наряду с этим, димебон в дозах 0,1, 2 и 5 мг/кг не вызывал уменьшения числа горизонтальных и вертикальных перемещений крыс в открытом поле и числа обследованных отверстий (таблица 3), что свидетельствует об отсутствие у препарата седативного и миорелаксантного эффектов.

Диазепам в дозе 2 мг/кг, также как и димебон, оказывал анксиолитическое действие в тесте открытого поля, что выражалось в увеличении числа выходов в центр освещенного поля. Однако, в отличие от димебона, диазепам в дозе 2 мг/кг достоверно угнетал горизонтальную и вертикальную двигательную активность в открытом поле и число обследованных отверстий, что характеризует седативный эффект препарата (таблица 3).

Таким образом, димебон в дозах 2 и 5 мг/кг обладает выраженным достоверным анксиолитическим действием в тесте открытого поля и по активности сходен с диазепамом. Существенным преимуществом димебона перед диазепамом является отсутствие у него в терапевтических дозах седативного, миорелаксантного действия. Следовательно, анксиолитический эффект димебона наблюдается без наслоения седативного и миорелаксантного действия в отличие от диазепама, у которого анксиолитический эффект сопровождается угнетением поведения.

Пример 4. Влияние димебона на поведение мышей с генетически детерминированным повышенным уровнем тревоги - Senescence-accelerated mouse Р10 (SAM P10) в условиях приподнятого крестообразного лабиринта

Одним из современных методов исследования анксиолитического эффекта препаратов является изучение их действия у мышей с исходно повышенным уровнем тревожности. В исследовании были использованы мыши линии SAM Р10 (Takeda T. et al. Senescence-Accelerated Mouse (SAM): A novel murine model of accelerated senescence. J. Amer. Geriatr. Soc. 1991, v.39, p.911-919) весом 26-31 г, у которых, наряду с другими изменениями, наблюдается генетически детерминированная тревога. У животных этой линии отмечается тревожность, стрессированность, нарушение циркадных ритмов, накопление в мозге β-амилоида, нарушение баланса нейромедиаторных систем и др. Эта симптоматика активно нарастает, начиная с 6-месячного возраста (ускоренное старение) (Miyamoto M. Characteristics of age-related behavioral changes in Senescence-Accelerated Mouse SAMPS and SAMP10. Exp. Gerontol. 1997, v.32, p.139-148; Shimada A. et al. Age-related deterioration in conditional avoidance task in the SAM-P/10 mouse, an animal model of spontaneous brain atrophy. Brain Res., 1993, v.608, p.266-272).

В исследовании были использованы мыши линии SAM P10 (Senescence-accelerated mouse P10) двух возрастных групп - 3-месячные и 11-месячные. Группа 11-месячных животных была поделена на три подгруппы: одна получала димебон в дозе 0,05 мг/кг, вторая - димебон в дозе 2 мг/кг, а третья группа 11-месячных мышей и мыши в возрасте 3 месяцев получали физиологический раствор. Все вещества вводили внутрибрюшинно за 40 минут до тестирования в объеме 0,1 мл на 10 г веса мыши. Исследование проводили в первую половину дня с 10 ч утра до 14 ч дня. Оценка уровня тревожности мышей проводилась в условиях методики приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ) (Pellow S., et al. Validation of open: closed arm entries in elevated plus-maze as a nuasure of anxiety in the rat. Neurosci Meth J. 1985, №14, p.149-167; Воронина Т.А. и соавт. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. M., Медицина. 2005, с.253-263). Приподнятый крестообразный лабиринт для мышей представляет собой перекрещенные полоски размером 5х45 см, два противоположных отсека имеют вертикальные стенки высотой 30 см (закрытые, темные рукава), а два других - открытые, светлые рукава. Лабиринт приподнят от пола на 30 см. В месте перекрестка плоскостей находится центральная платформа 5×5 см. Мышей помещали на центральную площадку хвостом к светлому рукаву. Регистрировалось латентное время нахождения мыши на центральной площадке лабиринта, время, проведенное животными в открытых рукавах, число заходов в светлые и темные рукава. Общее время наблюдения для каждого животного составляло 5 мин. В качестве основного показателя уровня тревожности мышей использовали время, проведенное мышами в открытых рукавах лабиринта.

Установлено, что у контрольных 11-месячных мышей SAM P10 в сравнении с контрольными 3-месячными животными линии SAM P10 наблюдалось значительное, более чем в 6 раз, уменьшение основного показателя - времени, проведенного в открытых светлых рукавах лабиринта, увеличение латентного времени и значительное, статистически достоверное, уменьшение количества заходов в темные и светлые рукава лабиринта (таблица 4). Подобное поведение мышей линии SAM P10 в возрасте 11 месяцев в условиях приподнятого крестообразного лабиринта свидетельствует о развитии у них синдрома тревожного состояния и стрессированности. Димебон в дозе 0,05 мг/кг у 11-месячных мышей линии SAM P10 увеличивал в 2 раза основной показатель поведения мышей в ПКЛ - время, проведенное в открытых, незащищенных рукавах лабиринта. Кроме того, препарат улучшал и другие показатели стрессированного поведения: увеличивал количество заходов в светлые рукава и общее число переходов (таблица 4). Полученные результаты свидетельствуют об анксиолитическом действии димебона.

При увеличении дозы димебона до 2 мг/кг его анксиолитический эффект существенно увеличивался. Так, под влиянием димебона у 11-месячных животных линии SAM P10 отмечалось более чем в 4 раза увеличение времени, проведенного мышами в опасных открытых рукавах лабиринта и количество заходов них, увеличивалась и сумма переходов при уменьшении латентного времени. Комплекс этих изменений поведения мышей на фоне димебона свидетельствует о выраженном антистрессорном и противотревожном действии препарата.

Таким образом, димебон обладает отчетливым анксиолитическим действием в опытах на мышах линии SAM P10 с генетически детерминированным высоким уровнем тревожности и стрессированности, которые ярко выявляются на модели приподнятого крестообразного лабиринта. Эффект димебона носит дозозависимый характер - с увеличением дозы от 0,05 до 2 мг/кг увеличивается позитивный анксиолитический эффект препарата.

Проведенные исследования позволяют заключить, что димебон в диапазоне доз от 0,05 до 5 мг/кг при внутрибрюшинном введении в опытах на животных обладает анксиолитическим действием. Эффект препарата выявляется на базисных экспериментальных моделях тревоги и стресса - конфликтной ситуации, приподнятого крестообразного лабиринта и открытого поля. Димебон эффективен как анксиолитик у мышей линии SAM P10 с генетически детерминированным повышенным уровнем стрессированности, тревожности и заторможенности. Существенным преимуществом димебона перед диазепамом является отсутствие у него в дозах с выраженным анксиолитическим эффектом депримирующего, седативного и миорелаксантного действия.

Димебон является анксиолитиком нового типа, обладающим антистрессорным, противотревожным и антифобическим действием, лишенным при этом побочных эффектов традиционных анксиолитиков (седация, миорелаксация, ухудшение памяти, лекарственная зависимость).

Димебон может найти применение в психиатрической практике для лечения и предупреждения стрессов, тревоги, неврозов, навязчивых страхов и их последствий, сопровождающимися тревогой, страхом, эмоциональным стрессом, напряженностью, астенией. Димебон может использоваться не только в психиатрии, но и в других областях медицины при различных заболеваниях, сопровождающихся эмоциональным стрессом, тревогой и страхами, паническими состояниями.

Димебон может использоваться при стрессе и тревоге, возникающих у здоровых людей при действии психотравмирующих факторов и в различных экстремальных ситуациях у лиц, деятельность которых связана с работой в чрезвычайных и осложненных условиях (работники спецслужб, военнослужащие, спасатели, спортсмены, альпинисты и др.).

Таблица 1. ВеществаДоза мг/кгЧисло наказуемых взятий водыКонтроль (дист. вода) 143,25±15,39Димебон0,05171,31±15,67Димебон0,1261,18±29,74*Димебон2,0354,25±32,49*Димебон5,0405,33±26,35*Диазепам2,0372,71±27,81*

Таблица 2.Группа животныхДозы в мг/кгЛат. время в секКол-во заходов в темные рукава в секКол-во заходов в светлые рукава в секВремя в светлых рукавах в секОбщее число переходовКонтроль 4,90±0,675,80±1,691,00±0,455,20±2,646,80±2,01Димебон0.13,43±0,535,86±1,531,86±1,0*20,00±7,75*7,71±2,25Димебон2.02,93±0,417,10±3,214,25±1,18*26,34±8,12*11,60±3,30*Диазепам2.07,68±2,0*2,20±0,47*2,12±1,08*25,6±6,87*4,32±1,01*

Предложено применение гидрированных пиридо(4,3-b)индолов формулы (1) или формулы (2) в качестве средства, обладающего анксиолитическим действием, фармакологическое средство на его основе и способ лечения и предупреждения стрессов, тревоги, неврозов, навязчивых страхов и их последствий. Показано, что заявленные соединения обладают выраженным анксиолитическим действием в конфликтной ситуации при отсутствии побочных эффектов седативного и миорелаксантного характера. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Применение гидрированных пиридо(4,3-b)индолов формулы (1) в качестве средства, обладающего анксиолитическим действием

в которой R¹ выбран из группы, содержащей СН₃-, СН₃СН₂ - или PhCH₂;

R² выбран из группы, содержащей: Н-, PhCH₂- или 6-СН₃-3-Ру-(СН₃)₂-R³ выбран из группы, содержащей Н-, СН₃- или Вг-.

в которой R¹ выбран из группы, содержащей СН₃-, СН₃СН₂ - или PhCH₃-

R² выбран из группы, содержащей Н-, PhCH₂- или 6-СН₃-З-Ру-(СН₂)₂-, а

R³ выбран из группы, содержащей Н-, СН₃- или Вг-.