СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛЬНОГО ПАСТЕРЕЛЛЕЗНОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА Российский патент 2009 года по МПК A61K39/40 G01N33/569 G01N33/531 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии может быть использовано при разработке средств специфической диагностики, в частности для получения антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума.

Известен способ получения антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума путем обработки носителя антителами сывороток, полученных на антигены пастерелл (Применение РИГА для серологической идентификации пастерелл, Труды ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии, г.Покров, 1998, стр.365-366).

Недостатками известного диагностикума является низкое качество целевого продукта, характеризующееся его низкой чувствительностью и специфичностью.

Задачей заявленного технического решения является повышение качества целевого продукта за счет увеличения его чувствительности и специфичности.

Поставленная задача решается в способе получения антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума путем обработки носителя антителами сывороток, полученных на антигены пастерелл, отличающийся тем, что в качестве антигенов пастерелл используют капсульные антигены, полученные из культур пастерелл путем экстракции 2,0-2,5%-ным раствором хлористого натрия при 40-42°С в течение 30-40 мин, центрифугированием экстракта, отделением супернатанта и прогреванием его при 65-70°С в течение 15-30 мин с последующей стерилизующей фильтрацией.

Поставленная задача также решается в способе получения антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума тем, что в качестве антител сывороток используют гамма-глобулиновые фракции или иммуноглобулины класса G или М.

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие признаки, аналогичные заявляемым, т.е. предложение соответствует критерию «новизна».

Предложение осуществимо в лабораторных и промышленных условиях, направлено на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».

При разработке эритроцитарных антительных диагностикумов первостепенное значение имеет получение высокоактивных антител на наиболее важные иммуногенные компоненты бактериальной клетки пастерелл - капсульные антигены. В связи с этим разработка стабильных и специфичных пастереллезных эритроцитарных антительных диагностикумов, полученных в результате сенсибилизации носителя антителами сывороток, полученных в результате гипериммунизации животных высокоспецифичными капсульными антигенами пастерелл, является важнейшей задачей для индикации и серологической их идентификации. Нами впервые установлено, что экстракция пастереллезного капсульного антигена из культур пастерелл раствором хлористого натрия определенной концентрации при 40-42°С в течение 30-40 мин с последующим прогреванием его при 60-70°С в течение 15-30 мин, используемого для гипериммунизации животных и получению антител, позволяет получить неочевидный положительный эффект - повышение качества целевого продукта за счет, по-видимому, снижения степени присутствия серологически родственных компонентов различных серотипов пастерелл в составе капсульных антигенов, что приводит к увеличению выхода растворимых капсульных компонентов в экстракт и повышению чувствительности и специфичности антительного диагностикума, т.е. предложение соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Способ иллюстрируется на следующих примерах.

Пример 1.

Селекционированную 16 час бульонную культуру производственных штаммов пастерелл: Pasteurella multocida /Р. multocida/ серотипов A, B, D №1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica биотип А-1, засевают в матровые колбы с 1,5%-ным агаром Хоттингера, содержащим 10% сыворотки крови лошади, стерильной, не инактивированной, инкубируют при 37°С в течение 16 час. Выросшую бактериальную массу с помощью шпателя смывают с поверхности агара 2,0%-ным раствором хлористого натрия (рН 7,3), доводят 2,0%-ным раствором хлористого натрия (рН 7,3) концентрацию полученной суспензии до 40 млрд м.т. (по оптическому стандарту мутности) и проводят экстракцию пастереллезного капсульного антигена при 40°С в течение 30 мин, затем центрифугируют при 10000 об/мин в течение 30 мин и отделяют супернатант. Полученный супернатант прогревают при 70°С в течение 15 мин, центрифугируют при 15000 об/мин в течение 15 мин и проводят стерилизующую фильтрацию через миллипоровские фильтры с мембраной типа GS-0,22.

Полученный супернатант используют в качестве капсульных антигенов для получения моноспецифических гипериммунных сывороток известным методом М.А.Мисникова и др. (Труды Института Ленинградского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Л.Пастера, 1976, т.44, стр.34-37). Из полученных гипериммунных сывороток выделяют гамма-глобулиновые фракции известным методом (Иммунологические методы /под ред. X.Фримеля/. Изд-во «Мир», М., 1979, стр.264-291). Фракции гамма-глобулина прогревают в течение 1 часа при 56°С с последующим охлаждением до 0°С в течение 15 мин и используют в качестве антител для обработки носителя и приготовления антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума. Обработку носителя антителами проводят при смешивании равных объемов 2,5%-ной взвеси формалинизированных танинизированных эритроцитов лошади и фракций иммунного гамма-глобулина известным способом по методу Леви М.И. и др. (В кн.: «Мат-лы 3-й Международной конференции институтов вакцин и сывороток социалистических стран», М., 1965, стр.32).

Смесь прогревают в течение 2-х часов при 43°С с последующей обработкой 0,55%-ным раствором нейтрального формалина. Активность полученного антительного диагностикума определяют по предельному титру в РПГА (реакции пассивной геммаглютинации), используя набор специфических гомологичных капсульных антигенов пастерелл. Специфичность антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума проверяют в перекрестной РПГА с гомо- и гетерологичными капсульными антигенами пастерелл. Активность полученного диагностикума к Pasteurella multocida серотипов A, B, D и Pasteurella haemolytica составила 1:2400, 1:3200, 1:2400, 1:1800 соответственно. Титр антител в гетерологичной системе взаимодействия для полученных диагностикумов к Pasteurella multocida серотипов A, B, D и Pasteurella haemolytica равен 1:2, 1:4, 1:4 и 1:8 соответственно.

Пример 2.

Селекционированную 17 час бульонную культуру производственных штаммов пастерелл: Pasteurella multocida /Р. multocida/ серотипов A, B, D №1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica биотип А-1, засевают в колбы с 1,5%-ным агаром Хоттингера, содержащим 10% сыворотки крови лошади, стерильной, не инактивированной, инкубируют при 37°С в течение 16 час. Выросшую бактериальную массу экстрагируют с помощью шпателя с поверхности агара 2,5%-ным раствором хлористого натрия (рН 7,2) при 42°С в течение 40 мин, доводят концентрацию полученной суспензии до 40 млрд м.т. (по оптическому стандарту мутности). Бактериальную взвесь прогревают при 41°С в течение 30 мин, центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин и отделяют супернатант. Полученный супернатант прогревают при 70°С в течение 15 мин и проводят стерилизующую фильтрацию через миллипоровские фильтры с мембраной типа GS-0,22.

Полученный супернатант используют в качестве капсульных антигенов для получения моноспецифических гипериммунных сывороток известным методом М.А.Мисникова и др. (Труды Института Ленинградского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Л.Пастера, 1976, т.44, стр.34-37). Из полученных гипериммунных сывороток выделяют фракции иммуноглобулина класса G известным методом (Иммунологические методы /под ред. X.Фримеля/. Изд-во «Мир», М., 1979, стр.264-291). Фракции иммуноглобулина класса G прогревают в течение 1 часа при 56°С с последующим охлаждением до 0°С в течение 15 мин и используют в качестве антител для обработки носителя и приготовления антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума. Обработку носителя антителами проводят при смешивании равных объемов 2,5%-ной взвеси формалинизированных танинизированных эритроцитов лошади и фракций иммуноглобулина класса G известным способом по методу Леви М.И. и др. (В кн.: «Мат-лы 3-й Международной конференции институтов вакцин и сывороток социалистических стран», М., 1965, стр.32).

Смесь прогревают в течение 1,75 часов при 44°С с последующей обработкой 0,65%-ным раствором нейтрального формалина. Активность полученного антительного диагностикума определяют по предельному титру в РПГА (реакции пассивной геммаглютинации), используя набор специфических гомологичных капсульных антигенов пастерелл. Специфичность антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума проверяют в перекрестной РПГА с гомо- и гетерологичными капсульными антигенами пастерелл. Активность полученного диагностикума к Pasteurella multocida серотипов A, B, D и Pasteurella haemolytica составила 1:3200, 1:2800, 1:2800, 1:1600 соответственно. Титр антител в гетерологичной системе взаимодействия для полученных диагностикумов к Pasteurella multocida серотипов A, B, D и Pasteurella haemolytica равен 1:4, 1:4, 1:4 и 1:8 соответственно.

Пример 3.

Селекционированную 18 час бульонную культуру производственных штаммов пастерелл: Pasteurella multocida /Р. multocida/ серотипов A, B, D №1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica биотип А-1, засевают в колбы с 1,5%-ным агаром Хоттингера, содержащим 10% сыворотки крови лошади, стерильной, не инактивированной, инкубируют при 37°С в течение 16 час. Выросшую бактериальную массу экстрагируют с помощью шпателя с поверхности агара 2,5%-ным раствором хлористого натрия (рН 7,2) при 42°С в течение 40 мин, доводят концентрацию полученной суспензии до 40 млрд м.т.(по оптическому стандарту мутности). Бактериальную взвесь прогревают при 41°С в течение 30 мин, центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин и отделяют супернатант. Полученный супернатант прогревают при 70°С в течение 15 мин и проводят стерилизующую фильтрацию через миллипоровские фильтры с мембраной типа GS-0,22.

Полученный супернатант используют в качестве капсульных антигенов для получения моноспецифических гипериммунных сывороток известным методом М.А.Мисникова и др. (Труды Института Ленинградского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Л.Пастера, 1976, т.44, стр.34-37). Из полученных гипериммунных сывороток выделяют фракции иммуноглобулина класса М известным методом Иммунологические методы /под ред. X.Фримеля/. Изд-во «Мир», М., 1979, стр.264-291). Фракции иммуноглобулина класса М прогревают в течение 1 часа при 56°С с последующим охлаждением до 0°С в течение 15 мин и используют в качестве антител для обработки носителя и приготовления антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума. Обработку носителя антителами проводят при смешивании равных объемов 2,5%-ной взвеси формалинизированных танинизированных эритроцитов лошади и фракций иммуноглобулина класса М известным способом по методу Леви М.И. и др. (В кн.: «Мат-лы 3-й Международной конференции институтов вакцин и сывороток социалистических стран», М., 1965, стр.32).

Смесь прогревают в течение 1,5 часов при 45°С с последующей обработкой 0,6%-ным раствором нейтрального формалина. Активность полученного антительного диагностикума определяют по предельному титру в РПГА (реакции пассивной геммаглютинации), используя набор специфических гомологичных капсульных антигенов пастерелл. Специфичность антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума проверяют в перекрестной РПГА с гомо- и гетерологичными капсульными антигенами пастерелл. Активность полученного диагностикума к Pasteurella multocida серотипов A, B, D и Pasteurella haemolytica составила 1:2800, 1:2400, 1:2800, 1:1600 соответственно. Титр антител в гетерологичной системе взаимодействия для полученных диагностикумов к Pasteurella multocida серотипов A, B, D и Pasteurella haemolytica равен 1:2, 1:4, 1:8 и 1:6 соответственно.

Пример 4.

Селекционированную 16 час бульонную культуру производственных штаммов пастерелл: Pasteurella multocida /Р. multocida/ серотипов A, B, D №№1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica биотип А-1, засевают в колбы с 1,5%-ным агаром Хоттингера, содержащим 10% сыворотки крови лошади, стерильной, не инактивированной, инкубируют при 37°С в течение 16 час. Выросшую бактериальную массу экстрагируют с помощью шпателя с поверхности агара 2,25%-ным раствором хлористого натрия (рН 7,3) при 41°С в течение 35 мин, доводят концентрацию полученной суспензии до 40 млрд м.т.(по оптическому стандарту мутности). Бактериальную взвесь прогревают при 41°С в течение 30 мин, центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин и отделяют супернатант. Полученный супернатант прогревают при 67,5°С в течение 20 мин и проводят стерилизующую фильтрацию через миллипоровские фильтры с мембраной типа GS-0,22.

Полученный супернатант используют в качестве капсульных антигенов для получения моноспецифических гипериммунных сывороток известным методом М.А.Мисникова и др. (Труды Института Ленинградского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Л.Пастера, 1976, т.44, стр.34-37). Из полученных гипериммунных сывороток выделяют гамма-глобулиновые фракции известным методом (Иммунологические методы /под ред. X.Фримеля/. Изд-во «Мир», М., 1979, стр.264-291). Фракции гамма-глобулина прогревают в течение 1 часа при 56°С с последующим охлаждением до 0°С в течение 15 мин и используют в качестве антител для обработки носителя и приготовления антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума. Обработку носителя антителами проводят при смешивании равных объемов 2,5%-ной взвеси формалинизированных танинизированных эритроцитов лошади и фракций иммунного гамма-глобулина известным способом по методу Леви М.И. и др. (В кн.: «Мат-лы 3-й Международной конференции институтов вакцин и сывороток социалистических стран», М., 1965, стр.32).

Смесь прогревают в течение 2-х часов при 43°С с последующей обработкой 0,55%-ным раствором нейтрального формалина. Активность полученного антительного диагностикума определяют по предельному титру в РПГА (реакции пассивной геммаглютинации), используя набор специфических гомологичных капсульных антигенов пастерелл. Специфичность антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума проверяют в перекрестной РПГА с гомо- и гетерологичными капсульными антигенами пастерелл. Активность полученного диагностикума к Pasteurella multocida серотипов A, B, D и Pasteurella haemolytica составила 1:2800, 1:2400, 1:2800, 1:1600 соответственно. Титр антител в гетерологичной системе взаимодействия для полученных диагностикумов к Pasteurella multocida серотипов A, B, D и Pasteurella haemolytica равен 1:4, 1:8, 1:8 и 1:6 соответственно.

Пример 5.

Селекционированную 17 час бульонную культуру производственных штаммов пастерелл: Pasteurella multocida /Р. multocida/ серотипов A, B, D №1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica биотип А-1, засевают в колбы с 1,5%-ным агаром Хоттингера, содержащим 10% сыворотки крови лошади, стерильной, не инактивированной, инкубируют при 37°С в течение 16 час. Выросшую бактериальную массу экстрагируют с помощью шпателя с поверхности агара 2,25%-ным раствором хлористого натрия (рН 7,3) при 41°С в течение 35 мин, доводят концентрацию полученной суспензии до 40 млрд м.т. (по оптическому стандарту мутности). Бактериальную взвесь прогревают при 41°С в течение 30 мин, центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин и отделяют супернатант. Полученный супернатант прогревают при 67,5°С в течение 20 мин и проводят стерилизующую фильтрацию через миллипоровские фильтры с мембраной типа GS-0,22.

Полученный супернатант используют в качестве капсульных антигенов для получения моноспецифических гипериммунных сывороток известным методом М.А.Мисникова и др. (Труды Института Ленинградского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Л.Пастера, 1976, т.44, стр.34-37). Из полученных гипериммунных сывороток выделяют фракции иммуноглобулина класса G известным методом (Иммунологические методы /под ред. X.Фримеля/. Изд-во «Мир», М., 1979, стр.264-291). Фракции иммуноглобулина класса G прогревают в течение 1 часа при 56°С с последующим охлаждением до 0°С в течение 15 мин и используют в качестве антител для обработки носителя и приготовления антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума. Обработку носителя антителами проводят при смешивании равных объемов 2,5%-ной взвеси формалинизированных танинизированных эритроцитов лошади и фракций иммуноглобулина класса G известным способом по методу Леви М.И. и др. (В кн.: «Мат-лы 3-й Международной конференции институтов вакцин и сывороток социалистических стран», М., 1965, стр.32).

Смесь прогревают в течение 1,75 часов при 44°С с последующей обработкой 0,65%-ным раствором нейтрального формалина. Активность полученного антительного диагностикума определяют по предельному титру в РПГА (реакции пассивной геммаглютинации), используя набор специфических гомологичных капсульных антигенов пастерелл. Специфичность антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума проверяют в перекрестной РПГА с гомо- и гетерологичными капсульными антигенами пастерелл. Активность полученного диагностикума к Pasteurella multocida серотипов A, B, D и Pasteurella haemolytica составила 1:2800, 1:3200, 1:2800, 1:1600 соответственно. Титр антител в гетерологичной системе взаимодействия для полученных диагностикумов к Pasteurella multocida серотипов A, B, D и Pasteurella haemolytica равен 1:4, 1:4, 1:4 и 1:8 соответственно.

Пример 6.

Селекционированную 18 час бульонную культуру производственных штаммов пастерелл: Pasteurella multocida /Р. multocida/ серотипов A, B, D №1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica биотип А-1, засевают в колбы с 1,5%-ным агаром Хоттингера, содержащим 10% сыворотки крови лошади, стерильной, не инактивированной, инкубируют при 37°С в течение 16 час. Выросшую бактериальную массу экстрагируют с помощью шпателя с поверхности агара 2,25%-ным раствором хлористого натрия (рН 7,3) при 41°С в течение 35 мин, доводят концентрацию полученной суспензии до 40 млрд м.т.(по оптическому стандарту мутности). Бактериальную взвесь прогревают при 41°С в течение 30 мин, центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин и отделяют супернатант. Полученный супернатант прогревают при 67,5°С в течение 20 мин и проводят стерилизующую фильтрацию через миллипоровские фильтры с мембраной типа GS-0,22.

Полученный супернатант используют в качестве капсульных антигенов для получения моноспецифических гипериммунных сывороток известным методом М.А.Мисникова и др. (Труды Института Ленинградского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Л.Пастера, 1976, т.44, стр.34-37). Из полученных гипериммунных сывороток выделяют фракции иммуноглобулина класса М известным методом Иммунологические методы /под ред. X.Фримеля/. Изд-во «Мир», М., 1979, стр.264-291). Фракции иммуноглобулина класса М прогревают в течение 1 часа при 56°С с последующим охлаждением до 0°С в течение 15 мин и используют в качестве антител для обработки носителя и приготовления антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума. Обработку носителя антителами проводят при смешивании равных объемов 2,5%-ной взвеси формалинизированных танинизированных эритроцитов лошади и фракций иммуноглобулина класса М известным способом по методу Леви М.И. и др. (В кн.: «Мат-лы 3-й Международной конференции институтов вакцин и сывороток социалистических стран», М., 1965, стр.32).

Смесь прогревают в течение 1,5 часов при 45°С с последующей обработкой 0,6%-ным раствором нейтрального формалина. Активность полученного антительного диагностикума определяют по предельному титру в РПГА (реакции пассивной геммаглютинации), используя набор специфических гомологичных капсульных антигенов пастерелл. Специфичность антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума проверяют в перекрестной РПГА с гомо- и гетерологичными капсульными антигенами пастерелл. Активность полученного диагностикума к Pasteurella multocida серотипов A, B, D и Pasteurella haemolytica составила 1:2400, 1:3200, 1:2400, 1:1600 соответственно. Титр антител в гетерологичной системе взаимодействия для полученных диагностикумов к Pasteurella multocida серотипов A, B, D и Pasteurella haemolytica равен 1:4, 1:2, 1:2 и 1:6 соответственно.

Пример 7.

Селекционированную 16 час бульонную культуру производственных штаммов пастерелл: Pasteurella multocida /Р. multocida/ серотипов A, B, D №1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica биотип А-1, засевают в колбы с 1,5%-ным агаром Хоттингера, содержащим 10% сыворотки крови лошади, стерильной, не инактивированной, инкубируют при 37°С в течение 16 час. Выросшую бактериальную массу экстрагируют с помощью шпателя с поверхности агара 2,0%-ным раствором хлористого натрия (рН 7,4) при 40°С в течение 30 мин, доводят концентрацию полученной суспензии до 40 млрд м.т. (по оптическому стандарту мутности). Бактериальную взвесь прогревают при 41°С в течение 30 мин, центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин и отделяют супернатант. Полученный супернатант прогревают при 65°С в течение 30 мин и проводят стерилизующую фильтрацию через миллипоровские фильтры с мембраной типа GS-0,22.

Полученный супернатант используют в качестве капсульных антигенов для получения моноспецифических гипериммунных сывороток известным методом М.А.Мисникова и др. (Труды Института Ленинградского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Л.Пастера, 1976, т.44, стр.34-37). Из полученных гипериммунных сывороток выделяют гамма-глобулиновые фракции известным методом (Иммунологические методы /под ред. X.Фримеля/. Изд-во «Мир», М., 1979, стр.264-291). Фракции гамма-глобулина прогревают в течение 1 часа при 56°С с последующим охлаждением до 0°С в течение 15 мин и используют в качестве антител для обработки носителя и приготовления антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума. Обработку носителя антителами проводят при смешивании равных объемов 2,5%-ной взвеси формалинизированных танинизированных эритроцитов лошади и фракций иммунного гамма-глобулина известным способом по методу Леви М.И. и др. (В кн.: «Мат-лы 3-й Международной конференции институтов вакцин и сывороток социалистических стран», М., 1965, стр.32).

Смесь прогревают в течение 2-х часов при 43°С с последующей обработкой 0,55%-ным раствором нейтральным формалина. Активность полученного антительного диагностикума определяли по предельному титру в РПГА (реакции пассивной геммаглютинации), используя набор специфических гомологичных капсульных антигенов пастерелл. Специфичность антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума проверяют в перекрестной РПГА с гомо- и гетерологичными капсульными антигенами пастерелл. Активность полученного диагностикума к Pasteurella multocida серотипов A, B, D и Pasteurella haemolytica составила 1:3200, 1:3200, 1:2400, 1:1600 соответственно. Титр антител в гетерологичной системе взаимодействия для полученных диагностикумов к Pasteurella multocida серотипов A, B, D и Pasteurella haemolytica равен 1:4, 1:4, 1:4 и 1:6 соответственно.

Пример 8.

Селекционированную 17 час бульонную культуру производственных штаммов пастерелл: Pasteurella multocida /Р. multocida/ серотипов A, B, D №1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica биотип А-1, засевают в колбы с 1,5%-ным агаром Хоттингера, содержащим 10% сыворотки крови лошади, стерильной, не инактивированной, инкубируют при 37°С в течение 16 час. Выросшую бактериальную массу экстрагируют с помощью шпателя с поверхности агара 2,0%-ным раствором хлористого натрия (рН 7,4) при 40°С в течение 30 мин, доводят концентрацию полученной суспензии до 40 млрд м.т. (по оптическому стандарту мутности). Бактериальную взвесь прогревают при 41°С в течение 30 мин, центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин и отделяют супернатант. Полученный супернатант прогревают при 65°С в течение 30 мин и проводят стерилизующую фильтрацию через миллипоровские фильтры с мембраной типа GS-0,22.

Полученный супернатант использовали в качестве капсульных антигенов для получения моноспецифических гипериммунных сывороток известным методом М.А.Мисникова и др. (Труды Института Ленинградского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Л.Пастера, 1976, т.44, стр.34-37). Из полученных гипериммунных сывороток выделяют фракции иммуноглобулина класса G известным методом (Иммунологические методы /под ред. X.Фримеля/. Изд-во «Мир», М., 1979, стр.264-291). Фракции иммуноглобулина класса G прогревают в течение 1 часа при 56°С с последующим охлаждением до 0°С в течение 15 мин и используют в качестве антител для обработки носителя и приготовления антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума. Обработку носителя антителами проводят при смешивании равных объемов 2,5%-ной взвеси формалинизированных танинизированных эритроцитов лошади и фракций иммуноглобулина класса G известным способом по методу Леви М.И. и др. (В кн.: «Мат-лы 3-й Международной конференции институтов вакцин и сывороток социалистических стран», М., 1965, стр.32).

Смесь прогревают в течение 1,75 часов при 44°С с последующей обработкой 0,65%-ным раствором нейтрального формалина. Активность полученного антительного диагностикума определяют по предельному титру в РПГА (реакции пассивной геммаглютинации), используя набор специфических гомологичных капсульных антигенов пастерелл. Специфичность антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума проверяют в перекрестной РПГА с гомо- и гетерологичными капсульными антигенами пастерелл. Активность полученного диагностикума к Pasteurella multocida серотипов A, B, D и Pasteurella haemolytica составила 1:2800, 1:3200, 1:2800, 1:1800 соответственно. Титр антител в гетерологичной системе взаимодействия для полученных диагностикумов к Pasteurella multocida серотипов A, B, D и Pasteurella haemolytica равен 1:4, 1:4, 1:4 и 1:6 соответственно.

Пример 9.

Селекционированную 18 час бульонную культуру производственных штаммов пастерелл: Pasteurella multocida /Р. multocida/ серотипов A, B, D №1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica биотип А-1, засевают в колбы с 1,5%-ным агаром Хоттингера, содержащим 10% сыворотки крови лошади, стерильной, не инактивированной, инкубируют при 37°С в течение 16 час. Выросшую бактериальную массу экстрагируют с помощью шпателя с поверхности агара 2,0%-ным раствором хлористого натрия (рН 7,4) при 40°С в течение 30 мин, доводят концентрацию полученной суспензии до 40 млрд м.т. (по оптическому стандарту мутности). Бактериальную взвесь прогревают при 41°С в течение 30 мин, центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин и отделяют супернатант. Полученный супернатант прогревают при 65°С в течение 30 мин и проводят стерилизующую фильтрацию через миллипоровские фильтры с мембраной типа GS-0,22.

Полученный супернатант используют в качестве капсульных антигенов для получения моноспецифических гипериммунных сывороток известным методом М.А.Мисникова и др. (Труды Института Ленинградского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Л.Пастера, 1976, т.44, стр.34-37). Из полученных гипериммунных сывороток выделяют фракции иммуноглобулина класса М известным методом Иммунологические методы /под ред. X.Фримеля/. Изд-во «Мир», М., 1979, стр.264-291). Фракции иммуноглобулина класса М прогревали в течение 1 часа при 56°С с последующим охлаждением до 0°С в течение 15 мин и используют в качестве антител для обработки носителя и приготовления антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума. Обработку носителя антителами проводят при смешивании равных объемов 2,5%-ной взвеси формалинизированных танинизированных эритроцитов лошади и фракций иммуноглобулина класса М известным способом по методу Леви М.И. и др. (В кн.: «Мат-лы 3-й Международной конференции институтов вакцин и сывороток социалистических стран», М., 1965, стр.32).

Смесь прогревают в течение 1,5 часов при 45°С с последующей обработкой 0,6%-ным раствором нейтрального формалина. Активность полученного антительного диагностикума определяют по предельному титру в РПГА (реакции пассивной геммаглютинации), используя набор специфических гомологичных капсульных антигенов пастерелл. Специфичность антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума проверяют в перекрестной РПГА с гомо- и гетерологичными капсульными антигенами пастерелл. Активность полученного диагностикума к Pasteurella multocida серотипов A, B, D и Pasteurella haemolytica составила 1:2800, 1:2800, 1:2800, 1:1600 соответственно. Титр антител в гетерологичной системе взаимодействия для полученных диагностикумов к Pasteurella multocida серотипов A, B, D и Pasteurella haemolytica равен 1:4, 1:4, 1:4 и 1:8 соответственно.

Активность диагностикума к Pasteurella multocida серотипов A, B, D и Pasteurella haemolytica, полученных известным способом, составила 1:1024, 1:2048, 1:2048, 1:900 соответственно. Титр антител в гетерологичной системе взаимодействия для полученных диагностикумов к Pasteurella multocida серотипов A, B, D и Pasteurella haemolytica равен 1:32, 1:32, 1:32 и 1:64 соответственно.

Как показали результаты экспериментальных исследований, предлагаемые антигенные пастереллезные эритроцитарные диагностикумы к Pasteurella multocida серотипов A, B, D и Pasteurella haemolytica позволяют повысить качество целевого продукта путем повышения его активности в 1,7-2 раза, а также увеличить специфичность ее в 2-8 раз.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, может быть использовано при разработке средств специфической диагностики. Способ по изобретению касается получения антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума путем обработки носителя антителами сывороток, полученных на антигены пастерелл. В качестве антигенов пастерелл используют капсульные антигены, полученные из культур пастерелл путем экстракции 2,0-2,5%-ным раствором хлористого натрия при 40-42°С в течение 30-40 мин, центрифугированием экстракта, отделением супернатанта и прогреванием его при 65-70°С в течение 15-30 мин с последующей стерилизующей фильтрацией. В качестве антител сывороток для изготовления диагностикума используют гамма-глобулиновые фракции или иммуноглобулины класса G или М. Использование способа позволяет повысить качество целевого продукта за счет увеличения его чувствительности и специфичности. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ получения антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума путем обработки носителя антителами сывороток, полученных на антигены пастерелл, отличающийся тем, что в качестве антигенов пастерелл используют капсульные антигены, полученные из культур пастерелл путем экстракции 2,0-2,5%-ным раствором хлористого натрия при 40-42°С в течение 30-40 мин, центрифугированием экстракта, отделением супернатанта и прогреванием его при 65-70°С в течение 15-30 мин с последующей стерилизующей фильтрацией.

2. Способ получения антительного пастереллезного эритроцитарного диагностикума по п.1, отличающийся тем, что в качестве антител сывороток используют гамма-глобулиновые фракции или иммуноглобулины класса G или М.