СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛЬНОГО ЭШЕРИХИОЗНОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА Российский патент 2009 года по МПК A61K39/40 G01N33/569 G01N33/531 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке средств специфической диагностики и, в частности, для получения антительного эшерихиозного эритроцитарного диагностикума.

Известен способ получения антительного эшерихиозного эритроцитарного диагностикума путем обработки носителя антителами, полученными на антигены эшерихий («Определение адгезивных антигенов у патогенных эшерихий и выявление антиадгезивных антител в РПГА», Экологические аспекты эпизоотологии и патологии животных, Международная научно-производственная конференция, посвященная 100-летию со дня рождения Котова В.Т., г.Воронеж, 1999, с.176-178).

Недостатком известного диагностикума является низкое качество целевого продукта, характеризующееся его низкой чувствительностью и специфичностью.

Задачей заявленного технического решения является повышение качества целевого продукта за счет увеличения его чувствительности и специфичности.

Поставленная задача решается в способе получения антительного эшерихиозного эритроцитарного диагностикума путем обработки носителя антителами, полученными на антигены эшерихий тем, что в качестве антигенов эшерихий используют адгезивные антигены, полученные из культур эшерихий путем экстракции, 1,8-2,0 М фосфатно-мочевинным буфером с рН 7,2-7,4 при температуре 40-45°С в течение 25-30 мин, причем культуральная жидкость, содержащая культуру клеток эшерихий, и фосфатно-мочевинный буфер взяты в массовом соотношении 1:0,4-0,6 соответственно, а супернатант после экстракции прогревают при 65-68°С в течение 25-30 мин, причем в качестве антител сывороток для обработки носителя используют гамма-глобулиновые фракции.

В патентной и научно-технической литературе неизвестны технические решения, содержащие признаки, аналогичные заявляемым, т.е. предложение соответствует критерию «новизна».

Предложение осуществимо в лабораторных и промышленных условиях, направлено на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».

При разработке эритроцитарных антительных диагностикумов первостепенное значение имеет получение активных антител на наиболее важные иммуногенные компоненты бактериальной клетки эшерихий. В связи с этим разработка стабильных и специфичных эшерихиозных эритроцитарных диагностикумов, полученных в результате гипериммунизацией животных высокоспецифичными адгезивными антигенами эшерихий, является важнейшей задачей для индикации и серологической их идентификации.

Нами впервые установлено, что экстракция эшерихиозного адгезивного антигена из культур эшерихий непосредственно в культуральной жидкости, содержащей культуру клеток эшерихий, 1,8-2,0 М фосфатно-мочевинным буфером с рН 7,2-7,4 при температуре 40-45°С в течение определенного времени, причем соотношение культуральной жидкости, содержащей культуру клеток эшерихий, и фосфатно-мочевинного буфера взято в массовом соотношении 1:0,4-0,6 соответственно, а супернатант после экстракции прогревают при определенных температурных режимах, что приводит к увеличению выхода растворимых адгезивных компонентов в экстракт и повышению чувствительности и специфичности антительного диагностикума, т.е. предложение соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Способ иллюстрируется на следующих примерах.

Пример 1.

Адгезивные антигены К 88 ab, К 88 ас, К 88 ad, К99, F-41, Att-25, 987Р Е. coli получают следующим образом. Культуры производственных штаммов эшерихий Е. coli указанных адгезивных антигенов (штаммы №№729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745) выращивают в бульоне Хоттингера. Каждый штамм выращивают отдельно в течение 18 ч при 37°С. Выращенные штаммы отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 мин. Культуральную жидкость сливают в отдельную емкость. В полученном осадке после центрифугирования выращенных культур определяют концентрацию микробных тел и доводят ее до концентрации 150 млрд микробных тел/мл культуральной жидкостью. Экстракцию адгезивных антигенов эшерихий проводят непосредственно в культуральной жидкости 1,8 М фосфатно-мочевинным буфером с рН 7,2 в течение 25 мин при температуре 40°С, причем культуральная жидкость, содержащая культуру клеток эшерихий, и фосфатно-мочевинный буфер взяты в массовом соотношении 1:0,4 соответственно. Затем реакционную жидкость центрифугируют при 10000 об/мин в течение 20 мин. Полученный супернатант прогревают при 65°С в течение 25 мин, охлаждают до 5°С и повторно центрифугируют 10000 об/мин в течение 20 мин. Полученный супернатант используют в качестве адгезивных антигенов для получения моноспецифических гипериммунных сывороток известным методом М.А.Мисникова и др. (Труды Института Ленинградского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Л.Пастера, 1976, т.44, с.34-37). Из полученных гипериммунных сывороток выделяют гамма-глобулиновые фракции известным методом (Иммунологические методы. /Под ред. X.Фримеля/. М., «Мир», 1979, с.264-291). Фракции гамма-глобулина прогревают в течение 1 часа при 56°С с последующим охлаждением до 0°С в течение 15 мин и используют в качестве антител для обработки носителя и приготовления антительного эшерихиозного эритроцитарного диагностикума. Обработку носителя антителами проводят при смешивании равных объемов 2,5%-ной взвеси формалинизированных танинизированных эритроцитов лошади и фракций иммунного гамма-глобулина известным способом по методу Леви М.И. и др. (В кн.: «Мат-лы 3-й Международной конференции институтов вакцин и сывороток социалистических стран», М., 1965, с.32).

Смесь прогревают в течение 2 часов при 43°С с последующей обработкой 0,55%-ным раствором нейтрального формалина. Активность полученного антительного диагностикума определяют по предельному титру в РПГА (реакции пассивной геммаглютинации), используя набор специфических гомологичных капсульных антигенов эшерихий. Специфичность антительного эшерихиозного эритроцитарного диагностикума проверяют в перекрестной РПГА с гомо- и гетерологичными адгезивными антигенами эшерихий. Активность полученного диагностикума к Е. coli (штаммы №№729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745) составила 1:1200, 1:1200, 1:2400, 1:1800, 1:1600, 1:2400, 1:1200 соответственно. Титр антител в гетерологичной системе взаимодействия для полученных диагностикумов к Е. coli (штаммы №№729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745) равен 1:2, 1:2, 1:2, 1:2, 1:2, 1:2, 1:2 соответственно.

Пример 2.

Адгезивные антигены К 88 ab, К 88 ас, К 88 ad, К99, F-41, Att-25, 987Р Е. coli получают следующим образом. Культуры производственных штаммов эшерихий Е. coli указанных адгезивных антигенов (штаммы №№729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745) выращивают в бульоне Хоттингера. Каждый штамм выращивают отдельно в течение 20 ч при 36,5°С. Выращенные штаммы отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 15000 об/мин в течение 15 мин. Культуральную жидкость сливают в отдельную емкость. В полученном осадке после центрифугирования выращенных культур определяют концентрацию микробных тел и доводят ее до концентрации 150 млрд микробных тел/мл культуральной жидкостью. Экстракцию адгезивных антигенов эшерихий проводят непосредственно из культур производственных штаммов эшерихий в культуральной жидкости 2,0 М фосфатно-мочевинным буфером с рН 7,4 в течение 30 мин при температуре 45°С, причем культуральная жидкость, содержащая культуру клеток эшерихий, и фосфатно-мочевинный буфер взяты в массовом соотношении 1:0,6. Затем реакционную жидкость центрифугируют при 18000 об/мин в течение 30 мин. Полученный супернатант прогревают при 68°С в течение 30 мин, охлаждают до 0°С и повторно центрифугируют 15000 об/мин в течение 15 мин. Полученный супернатант используют в качестве адгезивных антигенов для получения моноспецифических гипериммунных сывороток известным методом М.А.Мисникова и др. (Труды Института Ленинградского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Л.Пастера, 1976, т.44, с.34-37). Из полученных гипериммунных сывороток выделяют гамма-глобулиновые фракции известным методом (Иммунологические методы. /Под ред. X.Фримеля/. М., «Мир», 1979, с.264-291). Фракции гамма-глобулина прогревают в течение 1 часа при 56°С с последующим охлаждением до 0°С в течение 15 мин. и используют в качестве антител для обработки носителя и приготовления антительного эшерихиозного эритроцитарного диагностикума. Обработку носителя антителами проводят при смешивании равных объемов 2,5%-ной взвеси формалинизированных танинизированных эритроцитов лошади и фракций иммунного гамма-глобулина известным способом по методу Леви М.И. и др. (В кн.: «Мат-лы 3-й Международной конференции институтов вакцин и сывороток социалистических стран», М., 1965, с.32).

Смесь прогревают в течение 1,75 часов при 44°С с последующей обработкой 0,65%-ным раствором нейтрального формалина. Активность полученного антительного диагностикума определяют по предельному титру в РПГА (реакции пассивной геммаглютинации), используя набор специфических гомологичных капсульных антигенов пастерелл.

Специфичность антительного эшерихиозного эритроцитарного диагностикума проверяют в перекрестной РПГА с гомо- и гетерологичными адгезивными антигенами эшерихий. Активность полученного диагностикума к Е. coli (штаммы №№729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745) составила 1:1200, 1:1200, 1:2400, 1:1800, 1:1600, 1:2400, 1:1200 соответственно. Титр антител в гетерологичной системе взаимодействия для полученных диагностикумов к Е. coli (штаммы №№729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745) равен 1:2, 1:2, 1:2, 1:2, 1:2, 1:2, 1:2 соответственно.

Пример 3.

Адгезивные антигены К 88 ab, К 88 ас, К 88 ad, К99, F-41, Att-25, 987Р Е. coli получают следующим образом. Культуры производственных штаммов эшерихий Е. coli указанных адгезивных антигенов (штаммы №№729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745) выращивают в бульоне Хоттингера. Каждый штамм выращивают отдельно в течение 20 ч при 36,5°С. Выращенные штаммы отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 15000 об/мин в течение 15 мин. Культуральную жидкость сливают в отдельную емкость. В полученном осадке после центрифугирования выращенных культур определяют концентрацию микробных тел и доводят ее до концентрации 150 млрд микробных тел/мл культуральной жидкостью. Экстракцию адгезивных антигенов эшерихий проводят непосредственно из культур производственных штаммов эшерихий в культуральной жидкости 1,9 М фосфатно-мочевинным буфером с рН 7,3 в течение 28 мин при температуре 42,5°С, причем культуральная жидкость, содержащая культуру клеток эшерихий, и фосфатно-мочевинный буфер взяты в массовом соотношении 1:0,6. Затем реакционную жидкость центрифугируют при 14000 об/мин в течение 25 мин. Полученный супернатант прогревают при 66,5°С в течение 28 мин, охлаждают до 3°С и повторно центрифугируют 18000 об/мин в течение 10 мин. Полученный супернатант используют в качестве адгезивных антигенов для получения моноспецифических гипериммунных сывороток известным методом М.А.Мисникова и др. (Труды Института Ленинградского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Л.Пастера, 1976, т.44, с.34-37). Из полученных гипериммунных сывороток выделяют гамма-глобулиновые фракции известным методом (Иммунологические методы. /Под ред. X.Фримеля/. М., «Мир», 1979, с.264-291). Фракции гамма-глобулина прогревают в течение 1 часа при 56°С с последующим охлаждением до 0°С в течение 15 мин и используют в качестве антител для обработки носителя и приготовления антительного эшерихиозного эритроцитарного диагностикума. Обработку носителя антителами проводят при смешивании равных объемов 2,5%-ной взвеси формалинизированных танинизированных эритроцитов лошади и фракций иммунного гамма-глобулина известным способом по методу Леви М.И. и др. (В кн.: «Мат-лы 3-й Международной конференции институтов вакцин и сывороток социалистических стран», М., 1965, с.32).

Смесь прогревают в течение 1,5 часов при 45°С с последующей обработкой 0,6%-ным раствором нейтрального формалина. Активность полученного антительного диагностикума определяют по предельному титру в РПГА (реакции пассивной геммаглютинации), используя набор специфических гомологичных капсульных антигенов пастерелл. Специфичность антительного эшерихиозного эритроцитарного диагностикума проверяют в перекрестной РПГА с гомо- и гетерологичными адгезивными антигенами эшерихий. Активность полученного диагностикума к Е. coli (штаммы №№729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745) составила 1:1200, 1:1200, 1:2400, 1:1800, 1:1600, 1:2400, 1:1200 соответственно. Титр антител в гетерологичной системе взаимодействия для полученных диагностикумов к Е. coli (штаммы №№729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745) равен 1:2, 1:2, 1:2, 1:2, 1:2, 1:2, 1:2 соответственно.

Активность диагностикума к Е. coli (штаммы №№729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745), полученных известным способом, составила 1:400, 1:800, 1:600, 1:800, 1:400, 1:800, 1:600 соответственно. Титр антител в гетерологичной системе взаимодействия для полученных диагностикумов Е. coli (штаммы №№729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745) равен 1:6, 1:8, 1:8, 1:6, 1:8,1:8 и 1:12 соответственно.

Как показали результаты экспериментальных исследований, предлагаемые антительные эшерихиозные эритроцитарные диагностикумы к Е. coli (штаммы №№729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745) позволяют повысить качество целевого продукта путем повышения его активности в 1,5-4 раза, а также увеличить специфичность ее в 2-6 раз.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке средств специфической диагностики эшерихиозов. Способ по изобретению предназначен для получения антительного эшерихиозного эритроцитарного диагностикума и предусматривает обработку носителя антителами, полученными на антигены эшерихий. В качестве антигенов эшерихий используют адгезивные антигены, полученные из культур эшерихий путем экстракции 1,8-2,0 М фосфатно-мочевинным буфером с рН 7,2-7,4 при температуре 40-45°С в течение 25-30 мин, при этом культуральную жидкость, содержащую культуру клеток эшерихий, и фосфатно-мочевинный буфер берут в массовом соотношении 1:0,4-0,6 соответственно. Супернатант, полученный после экстракции, прогревают при 65-68°С в течение 25-30 мин. В качестве антител сывороток для обработки носителя используют гамма-глобулиновые фракции. Способ по изобретению позволяет повысить качество целевого продукта за счет увеличения его чувствительности и специфичности.

Способ получения антительного эшерихиозного эритроцитарного диагностикума путем обработки носителя антителами, полученными на антигены эшерихий отличающийся тем, в качестве антигенов эшерихий используют адгезивные антигены, полученные из культур эшерихий путем экстракции, 1,8-2,0 М фосфатно-мочевинным буфером с рН 7,2-7,4 при температуре 40-45°С в течение 25-30 мин, причем культуральная жидкость, содержащая культуру клеток эшерихий, и фосфатно-мочевинный буфер взяты в массовом соотношении 1:0,4-0,6 соответственно, а супернатант после экстракции прогревают при 65-68°С в течение 25-30 мин, причем в качестве антител сывороток для обработки носителя используют гамма-глобулиновые фракции.