СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕННОГО ЭШЕРИХИОЗНОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА Российский патент 2009 года по МПК A61K39/108 G01N33/531 G01N33/543 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии может быть использовано при разработке средств специфической диагностики, и в частности для получения эшерихиозного эритроцитарного диагностикума.

Известен способ получения антигенного эшерихиозного эритроцитарного диагностикума путем экстракции адгезивного антигена из культур эшерихий, центрифугированием экстракта, отделением супернатанта с последующей сенсибилизацией им формалинизированных танинизированных эритроцитов животных («Определение адгезивных антигенов у патогенных эшерихий и выявление антиадгезивных антител в РПГА». Экологические аспекты эпизоотологии и патологии животных, Международная научно-производственная конференция, посвященная 100-летию со дня рождения Котова В.Т., г.Воронеж, 1999, стр.176-178).

Недостатками известного диагностикума является низкое качество целевого продукта, характеризующееся его низкой чувствительностью и специфичностью.

Задачей заявленного технического решения является повышение качества целевого продукта за счет увеличения его чувствительности и специфичности.

Поставленная задача решается в способе получения антигенного эшерихиозного эритроцитарного диагностикума путем экстракции адгезивного антигена из культур эшерихий, центрифугированием экстракта, отделением супернатанта с последующей сенсибилизацией им формалинизированных танинизированных эритроцитов животных тем, что экстракцию проводят в культуральной жидкости, содержащей культуру клеток эшерихий, 1,8-2,0 М фосфатно-мочевинным буфером с рН 7,2-7,4 при температуре 40-45°С в течение 25-30 мин, причем культуральная жидкость, содержащая культуру клеток эшерихий, и фосфатно-мочевинный буфер взяты в массовом соотношении 1:0,4-0,6, соответственно, а супернатант после экстракции прогревают при 65-68°С в течение 25-30 мин.

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие признаки, аналогичные заявляемым, т.е. предложение соответствует критерию «новизна».

Предложение осуществимо в лабораторных и промышленных условиях, направлено на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».

При разработке эритроцитарных антигенных диагностикумов первостепенное значение имеет получение высокоактивных антигенов, содержащих наиболее важные компоненты бактериальной клетки и обладающих наиболее выраженной иммуногенной активностью. В связи с этим разработка стабильных и специфичных эшерихиозных эритроцитарных диагностикумов на основе антигенов из пилей эшерихий является важнейшей задачей для изучения закономерности формирования иммунного ответа к адгезивным компонентам эшерихий и выявления степени напряженности иммунитета у привитых противоэшеихиозными вакцинами животных. Нами впервые установлено что, экстракция эшерихиозного адгезивного антигена из культур эшерихий непосредственно в культуральной жидкости, содержащей культуру клеток эшерихий, 1,8-2,0 М фосфатно-мочевинным буфером с рН 7,2-7,4 при температуре 40-45°С в течение определенного времени, причем соотношение культуральной жидкости, содержащей культуру клеток эшерихий, и фосфатно-мочевинным буфером взяты в массовом соотношении 1:0,4-0,6, соответственно, а супернатант после экстракции прогревают при определенных температурных режимах, что позволяет получить неочевидный положительный эффект - повышение качества целевого продукта за счет, по-видимому, снижения степени присутствия серологически родственных компонентов различных серогрупп эшерихий в составе адгезивных антигенов, что приводит к увеличению выхода адгезивных компонентов в экстракт и повышению чувствительности и специфичности антигенного диагностикума, т.е. предложение соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Способ иллюстрируется на следующих примерах.

Пример 1

Адгезивные антигены К 88 ab, К 88 ас, К 88 ad, К99, F-41, Att-25, 987Р Е. coli получают следующим образом. Культуры производственных штаммов эшерихий Е. coli, указанных адгезивных антигенов (штаммы №№729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745), выращивают в бульоне Хоттингера. Каждый штамм выращивают отдельно в течение 18 ч при 37°С. Выращенные штаммы отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 мин. Культуральную жидкость сливают в отдельную емкость. В полученном осадке после центрифугирования выращенных культур определяют концентрацию микробных тел и доводят ее до концентрации 150 млрд. микробных тел/мл культуральной жидкостью. Экстракцию адгезивных антигенов эшерихий из культур производственных штаммов проводят 1,8 М фосфатно-мочевинном буфером с рН 7,2 в течение 25 мин при температуре 40°С, причем культуральная жидкость, содержащая культуру клеток эшерихий, и фосфатно-мочевинный буфер взяты в массовом соотношении 1:0,4, соответственно. Затем реакционную жидкость центрифугируют при 10000 об/мин в течение 20 мин. Полученный супернатант прогревают при 65°С в течение 25 мин, охлаждают до 5°С и повторно центрифугируют 10000 об/мин в течение 20 мин. Полученный супернатант используют в качестве адгезивных антигенов /для приготовления антигенного эшерихиозного эритроцитарного диагностикума известным способом/ путем сенсибилизации ими формализированных танинизированных эритроцитов лошади по методу М.И.Леви с соавт. (ЖМЭИ, 1967, №1, с.133). Активность полученного диагностикума определяют по предельному титру в РПГА (реакции пассивной геммаглютинации), используя набор специфических гомологичных гипериммунных сывороток, полученных на адгезивные антигены эшерихий. Специфичность антигенного эшерихиозного эритроцитарного диагностикума проверяют в перекрестной РПГА с гомо- и гетерологичными антисыворотками. Активность полученного диагностикума к Е. coli (штаммы №№729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745) составила 1:1200, 1:1200, 1:2400, 1:1800, 1:1600, 1:2400, 1:1200, соответственно. Титр антител в гетерологичной системе взаимодействия для полученных диагностикумов к Е. coli (штаммы №№729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745) равен 1:2, 1:2, 1:2, 1:2, 1:2, 1:2, 1:2, соответственно.

Пример 2

Адгезивные антигены К 88 ab, К 88 ас, К 88 ad, К99, F-41, Att-25, 987Р Е. coli получают следующим образом. Культуры производственных штаммов эшерихий Е. coli, указанных адгезивных антигенов (штаммы №№729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745), выращивают в бульоне Хоттингера. Каждый штамм выращивают отдельно в течение 24 ч при 36,5°С. Выращенные штаммы отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 15000 об/мин в течение 15 мин. Культуральную жидкость сливают в отдельную емкость. В полученном осадке после центрифугирования выращенных культур определяют концентрацию микробных тел и доводят ее до концентрации 140 млрд. микробных тел/мл культуральной жидкостью. Экстракцию адгезивных антигенов эшерихий из культур производственных штаммов проводят 2,0 М фосфатно-мочевинном буфером с рН 7,4 в течение 30 мин при температуре 45°С, причем культуральная жидкость, содержащая культуру клеток эшерихий, и фосфатно-мочевинный буфер взяты в массовом соотношении 1:0,6. Затем реакционную жидкость центрифугируют при 18000 об/мин в течение 30 мин. Полученный супернатант прогревают при 68°С в течение 30 мин, охлаждают до 4°С и повторно центрифугируют 12000 об/мин в течение 15 мин. Полученный супернатант используют в качестве адгезивных антигенов /для приготовления антигенного эшерихиозного эритроцитарного диагностикума известным способом/ путем сенсибилизации ими формализированных танинизированных эритроцитов лошади по методу М.И.Леви с соавт. (1967). Активность полученного диагностикума определяли по предельному титру в РПГА (реакции пассивной геммаглютинации) используя набор специфических гомологичных гипериммунных сывороток, полученных на адгезивные антигены эшерихий. Специфичность антигенного эшерихиозного эритроцитарного диагностикума проверяют в перекрестной РПГА с гомо- и гетерологичными антисыворотками. Активность полученного диагностикума к Е. coli (штаммы №№729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745) составила 1:1200, 1:1200, 1:2400, 1:1800, 1:1600, 1:2400, 1:1200, соответственно. Титр антител в гетерологичной системе взаимодействия для полученных диагностикумов к Е. coli (штаммы №№729, 661/16, 798, 957, 688/19,4 и 745) равен 1:2, 1:2,1:2,1:2, 1:2, 1:2, 1:2, соответственно.

Пример 3

Адгезивные антигены К 88 ab, К 88 ас, К 88 ad, К99, F-41, Att-25, 987Р Е. coli получают следующим образом. Культуры производственных штаммов эшерихий Е. coli, указанных адгезивных антигенов (штаммы №№729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745), выращивают в бульоне Хоттингера. Каждый штамм выращивают отдельно в течение 18 ч при 37°С. Выращенные штаммы отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 мин. Культуральную жидкость сливают в отдельную емкость. В полученном осадке после центрифугирования выращенных культур определяют концентрацию микробных тел и доводят ее до концентрации 150 млрд. микробных тел/мл культуральной жидкостью. Экстракцию адгезивных антигенов эшерихий из культур производственных штаммов проводят 1,9 М фосфатно-мочевинном буфером с рН 7,3 в течение 28 мин при температуре 42,5°С, причем культуральная жидкость, содержащая культуру клеток эшерихий, и фосфатно-мочевинный буфер взяты в массовом соотношении 1:0,5. Полученный супернатант прогревают при 66,5°С в течение 28 мин, охлаждают до 3°С и повторно центрифугируют 15000 об/мин в течение 10 мин. Полученный супернатант используют в качестве адгезивных антигенов /для приготовления антигенного эшерихиозного эритроцитарного диагностикума известным способом/ путем сенсибилизации ими формализированных танинизированных эритроцитов лошади по методу М.И.Леви с соавт. (1967). Активность полученного диагностикума определяли по предельному титру в РПГА (реакции пассивной геммаглютинации), используя набор специфических гомологичных гипериммунных сывороток, полученных на адгезивные антигены эшерихий. Специфичность антигенного эшерихиозного эритроцитарного диагностикума проверяют в перекрестной РПГА с гомо- и гетерологичными антисыворотками. Активность полученного диагностикума к Е. coli (штаммы №№729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745) составила 1:1200, 1:1200, 1:2400, 1:1800, 1:1600, 1:2400, 1:1200, соответственно. Титр антител в гетерологичной системе взаимодействия для полученных диагностикумов к Е. coli (штаммы №№729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745) равен 1:2, 1:2, 1:2, 1:2, 1:2, 1:2, 1:2, соответственно.

Активность диагностикума к Е. coli (штаммы №№729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745), полученных известным способом, составила 1:400, 1:800, 1:600, 1:800, 1:400, 1:800, 1:600, соответственно. Титр антител в гетерологичной системе взаимодействия для полученных диагностикумов к Pasteurella multocida серотипов A,B,D и Pasteurella haemolytica равен 1:6, 1:8, 1:8, 1:6, 1:8, 1:8 и 1:12, соответственно.

Как показали результаты экспериментальных исследований, предлагаемые антигенные эшерихиозные эритроцитарные диагностикумы к Е. coli (штаммы №№729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745) позволяют повысить качество целевого продукта путем повышения его активности в 1,5-4 раза, а также увеличить специфичность ее в 2-6 раз.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии может быть использовано при разработке средств специфической диагностики. Способ по изобретению направлен на получение антигенного эшерихиозного эритроцитарного диагностикума путем экстракции адгезивного антигена из культур эшерихий, центрифугирования экстракта, отделения супернатанта с последующей сенсибилизацией полученным антигеном формалинизированных танинизированных эритроцитов животных. Экстрацию проводят в культуральной жидкости, содержащей культуру клеток эшерихий, 1,8-2,0 М фосфатно-мочевинным буфером с рН 7,2-7,4 при температуре 40-45°С в течение 25-30 мин, при этом культуральную жидкость, содержащая культуру клеток эшерихий, и фосфатно-мочевинный буфер берут в массовом соотношении 1:0,4-0,6, соответственно. Супернатант после экстракции прогревают при 65-68°С в течение 25-30 мин. Способ по изобретению позволяет повысить качество целевого продукта за счет увеличения его чувствительности и специфичности.

Способ получения антигенного эшерихиозного эритроцитарного диагностикума путем экстракции адгезивного антигена из культур эшерихий, центрифугированием экстракта, отделением супернатанта с последующей сенсибилизацией им формалинизированных танинизированных эритроцитов животных, отличающийся тем, что экстрацию проводят в культуральной жидкости, содержащей культуру клеток эшерихий, 1,8-2,0 М фосфатно-мочевинным буфером с рН 7,2-7,4 при температуре 40-45°С в течение 25-30 мин, причем культуральная жидкость, содержащая культуру клеток эшерихий, и фосфатно-мочевинный буфер взяты в массовом соотношении 1:0,4-0,6, соответственно, а супернатант после экстракции прогревают при 65-68°С в течение 25-30 мин.