СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЭШЕРИХИОЗА ЖИВОТНЫХ Российский патент 2008 года по МПК A61K39/02 A61K39/108 C12N1/00 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, может быть использовано при разработке средств специфической профилактики, в частности для получения вакцины против эшерихиоза животных.

Известен способ получения вакцины против эшерихиоза животных, включающий культивирование эшерихий в жидкой питательной среде, с последующей инактивацией (Патент РФ №2043771, «Вакцина против эшерихиоза животных», Бюл. №26, 20.09.1995, МКИ А61К 39/108).

Недостатком известной вакцины является низкое качество целевого продукта, выявляемое с низкой антигенной и иммуногенной активностью штаммов эшерихий, содержащих адгезивные антитела, недостаточной иммуногенностью из-за неполноты антигенного состава входящих в вакцину компонентов, а именно отсутствия иммунитета против штаммов с адгезивными антигенами Att-25, а также наличия высокотоксичных штаммов серогрупп 078, 0141 и др., предназначенных для создания иммунитета к O-антигенам, обусловливает высокое содержание балластных веществ, реактогенность и сенсибилизацию организма животных.

Задачей заявленного технического решения является повышение качества целевого продукта за счет расширения его антигенного спектра и обогащения его основными протективными адгезивными антителами, повышения их антигенной и иммуногенной активности, которые вызывают образование антител, препятствующих адсорбции энтеропатогенных эшерихий в тонком отделе кишечника животных и ингибирующих основные процессы развития колиинфекции (эшерихиоза), а также уменьшает неспецифическую нагрузку на иммунную систему животных и снижает реактогенность.

Поставленная задача решается в способе получения вакцины против эшерихиоза животных, включающем культивирование эшерихий в жидкой питательной среде, исследования физико-химических и биологических показателей в процессе роста бактериальной массы с последующим прекращением культивирования эшерихий, концентрирование их и инактивацией, отличающемся тем, что культивируют эшерихии, содержащие адгезивные антигены К 88 ab, К 88 ас, К 88 ad, K99, F-41, Att-25, 987P, во время культивирования эшерихий дополнительно определяют активность фимбриальных адгезинов в реакции пассивной гемагглютинации клеточной бактериальной массы, затем прекращение культивирования осуществляют при значении титров фимбриальных адгезинов эшерихий, содержащих адгезивные антигены К 88 ab, К 88 ас, К 88 ad, K99, F-41, Att-25, 987P, равные как 1:2048-4096; 1:1024-2048; 1:256-512; 1:1024-2056; 1:1024-2056; 1:32-64; 1:256-512 соответственно.

Поставленная задача решается также тем, что культуральную жидкость освобождают от клеточной бактериальной массы центрифугированием при 3000-5000 об/мин в течение 20-25 минут.

Известно получение и использование фибриальных адгезинов для получения антисывороток (патент США №4769240, кл. А61К 39/02, 1988, патент РФ №2077337, А61К 39/02. Бюл. 11, 20.04.1997).

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие признаки, аналогичные заявляемым, т.е. предложение соответствует критерию «новизна».

Предложение осуществимо в лабораторных и промышленных условиях, направлено на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».

Существующие вакцины против эшерихиоза животных изготавливают из бактериальной массы эшерихий, выращенной без учета протективной характеристики компонентов клетки возбудителя, функционально относящихся к факторам патогенности. Реакторное культивирование эшерихий до стационарной фазы роста бактерий проводится без учета определения максимального уровня специфической активности, сохранения этой активности и распределения в среде роста протективных фимбриальных адгезинов. Процесс культивирования проводится в неконтролируемом по факторам патогенности режиме. Нами впервые установлено, что при получении максимального выхода биомассы, как это в настоящее время принято при промышленном производстве вакцины против эшерихиоза животных, снижается качество антигенного материала, т.к. по достижении определенной фазы развития культуры под действием собственных ферментов клетки в процессе старения ее происходят деструктивные изменения части компонентов фимбриальных адгезинов, что приводит к потере иммунологически активного материала и недопустимо при производстве эффективной вакцины против эшерихиоза животных. Кроме того, нами установлено, что культивирование эшерихий, содержащих адгезивные антигены К 88 ab, К 88 ас, К 88 ad, K99, F-41, Att-25, 987P, позволяет получить вакцину, именно совпадающую с эпизоотическими штаммами возбудителя колибактериоза животных.

Впервые предложен способ получения вакцины против эшерихиоза животных, в котором вместо определения критерия количества клеток эшерихий по физико-химическим и биологическим показателям, а также по оценке содержания адгезивных антигенов, максимальный уровень производства антигенов определяют по уровню активности фимбриальных адгезинов эшерихий в реакции пассивной гемагглютинации в культуральной жидкости, освобожденной от клеточной бакмассы, что позволяет получить неочевидный положительный эффект - повышение качества целевого продукта и ускорение способа, т.е. предложение соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Способ иллюстрируется на следующих примерах.

Пример 1.

Для получения вакцины против эшерихиоза животных отобраны семь производственных штаммов Е.coli, содержащих адгезивные антигены К 88 ab, К 88 ас, К 88 ad, K99, F-41, Att-25, 987P (штаммы №729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745), которые выращивают в бульоне Хоттингера, содержащем аминный азот - 150 мг%, триптофан - 50 мг% при рН 7,8. Каждый штамм выращивают отдельно. В каждой культуре в процессе ее роста определяют активность фимбриальных адгезинов эшерихий, для чего в пробе культуры с помощью центрифугирования при 3000 об/мин в течение 20 мин отделяют культуральную жидкость от бактериальной массы. Бактериальную массу ресуспензируют в 2 М фосфатно-мочевинном буфере с рН 7,4, концентрацию клеток доводят до 100 млрд. микробных тел в 1 мл и прогревают при температуре 60°С в течение 20 минут. Далее взвесь микробных тел охлаждают до 5°С и центрифугируют при 13000 об/мин в течение 20 мин. Полученный супернатант используют для определения активности фимбриальных адгезинов в реакции пассивной гемагглютинации. Через 5 час культивирования при значении титров фимбриальных адгезинов эшерихий, содержащих адгезивные антигены К 88 ab, К 88 ас, К 88 ad, K99, F-41, Att-25, 987P, равные как 1:2048; 1:1024; 1:256; 1:1024; 1:1024; 1:32; 1:256 соответственно, культивирование вышеуказанных штаммов прекращают. Отделяют бактериальную массу центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин, которую ресуспензируют в 2 М фосфатно-мочевинном буфере с рН 7,4, концентрацию клеток доводят до 100 млрд. микробных тел в 1 мл и прогревают при температуре 60°С в течение 20 минут. Далее взвесь микробных тел охлаждают до 5°С и центрифугируют при 10000 об/мин в течение 20 мин. Полученные супернатанты каждого штамма в равных частях смешивают, консервируют формалином в конечной концентрации 0,3% и используют для получения целевого продукта (состав 1).

Пример 2.

Для получения вакцины против эшерихиоза животных отобраны семь производственных штаммов Е.coli, содержащих адгезивные антигены К 88 ab, К 88 ас, К 88 ad, K99, F-41, Att-25, 987P (штаммы №729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745, которые выращивают в бульоне Хоттингера, содержащем аминный азот - 150 мг%, триптофан - 50 мг% при рН 7,8. Каждый штамм выращивают отдельно. В каждой культуре в процессе ее роста определяют активность фимбриальных адгезинов эшерихий, для чего в пробе культуры с помощью центрифугирования при 3000 об/мин в течение 20 мин отделяют культуральную жидкость от бактериальной массы. Бактериальную массу ресуспензируют в 2,1 М фосфатно-мочевинном буфере с рН 7,3, концентрацию клеток доводят до 120 млрд. микробных тел в 1 мл и прогревают при температуре 65°С в течение 25 мин. Далее взвесь микробных тел охлаждают до 4°С и центрифугируют при 15000 об/мин в течение 25 мин. Полученный супернатант используют для определения активности фимбриальных адгезинов в реакции пассивной гемагглютинации. Через 6 час культивирования при значении титров фимбриальных адгезинов эшерихий, содержащих адгезивные антигены К 88 ab, К 88 ас, К 88 ad, K99, F-41, Att-25, 987P, равные как 1:4096; 1:2048; 1:512; 1:2056; 1:2056; 1:64; 1:512 соответственно, культивирование вышеуказанных штаммов прекращают. Отделяют бактериальную массу центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин, которую ресуспензируют в 2,1 М фосфатно-мочевинном буфере с рН 7,3, концентрацию клеток доводят до 120 млрд. микробных тел в 1 мл и прогревают при температуре 65°С в течение 25 минут. Далее взвесь микробных тел охлаждают до 4°С и центрифугируют при 15000 об/мин в течение 25 мин. Полученные супернатанты каждого штамма в равных частях смешивают, консервируют формалином в конечной концентрации 0,5% и используют для получения целевого продукта (состав 2).

Пример 3.

Для получения вакцины против эшерихиоза животных отобраны семь производственных штаммов Е.coli, содержащих адгезивные антигены К 88 ab, К 88 ас, К 88 ad, K99, F-41, Att-25, 987P (штаммы №729, 661/16, 798, 957, 688/19, 4 и 745, которые выращивают в бульоне Хоттингера, содержащем аминный азот - 150 мг%, триптофан - 50 мг% при рН 7,8. Каждый штамм выращивают отдельно. В каждой культуре в процессе ее роста определяют активность фимбриальных адгезинов эшерихий, для чего в пробе культуры с помощью центрифугирования при 3000 об/мин в течение 20 мин отделяют культуральную жидкость от бактериальной массы. Бактериальную массу ресуспензируют в 2,05 М фосфатно-мочевинном буфере с рН 7,35, концентрацию клеток доводят до 110 млрд. микробных тел в 1 мл и прогревают при температуре 62,5°С в течение 22,5 мин. Далее взвесь микробных тел охлаждают до 3°С и центрифугируют при 10000 об/мин в течение 22 мин. Полученный супернатант используют для определения активности фимбриальных адгезинов в реакции пассивной гемагглютинации. Через 6 часов культивирования при значении титров фимбриальных адгезинов эшерихий, содержащих адгезивные антигены К 88 ab, К 88 ас, К 88 ad, K99, F-41, Att-25, 987P, равные как 1:4096; 1:2048; 1:512; 1:2056; 1:2056; 1:64; 1:512 соответственно, культивирование вышеуказанных штаммов прекращают. Отделяют бактериальную массу центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин, которую ресуспензируют в 1,9 М фосфатно-мочевинном буфере с рН 7,35, концентрацию клеток доводят до 110 млрд. микробных тел в 1 мл и прогревают при температуре 62°С в течение 22 минут. Далее взвесь микробных тел охлаждают до 3°С и центрифугируют при 13000 об/мин в течение 20 мин. Полученные супернатанты каждого штамма в равных частях смешивают, консервируют формалином в конечной концентрации 0,4% и используют для получения целевого продукта (состав 3).

Пример 4.

Использовали полученные составы следующим образом. Формируют 4 группы по 100 супоросных свиноматок, подобранных по принципу аналогов. Каждому животному опытных групп вводили вакцину составов 1-3 из расчета 2,5 мл. Каждому животному контрольной группы вводили состав-прототип из расчета 6 мл. В таблице 1 приводятся технические данные вакцин, полученных согласно известному (прототип) и предлагаемому (составы 1-3) техническим решениям.

Таблица 1ПоказателиСостав 1Состав 2Состав 3ПрототипВакцинировано супоросных свиноматок100100100100Количество поросят, полученных от супоросных свиноматок1250128013091230Количество поросят, заболевших эшерихиозом156135122386Количество поросят, павших от эшерихиоза30282585Сохранность поголовья97,697,89868

Как показали результаты экспериментальных исследований, предлагаемая вакцина против эшерихиоза животных позволяет повысить сохранность поголовья сельскохозяйственных животных на 29,6-30%.

Пример 5.

Использовали полученные составы следующим образом. Формируют 4 группы по 50 стельных коров, подобранных по принципу аналогов. Каждому животному опытных групп вводили вакцину составов 1-3 из расчета 5,0 мл. Каждому животному контрольной группы вводили состав-прототип из расчета 12 мл. В таблице 2 приводятся технические данные вакцин, полученных согласно известному (прототип) и предлагаемому (составы 1-3) техническим решениям.

Таблица 2ПоказателиСостав 1Состав 2Состав 3ПрототипВакцинировано стельных коров50505050Количество телят, полученных от стельных коров47464845Количество телят, заболевших эшерихиозом109821Количество телят, павших от эшерихиоза3326Сохранность поголовья93,693,495,886,6

Как показали результаты экспериментальных исследований, предлагаемая вакцина против эшерихиоза животных позволяет повысить сохранность поголовья сельскохозяйственных животных на 6,8-9,2%.

Как показали результаты экспериментальных исследований, предлагаемая вакцина против эшерихиоза животных позволяет повысить сохранность поголовья сельскохозяйственных животных на 6,8-30%, а также сокращает сроки получения вакцины против эшерихиоза животных на 18-42 часа, поскольку длительность культивирования согласно известному способу составляет 24-48 часов (в предлагаемом способе - 5-6 часов).

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для получения профилактических и лечебных биопрепаратов против эшерихиоза животных. Для получения вакцины в жидкой питательной среде культивируют клетки Escherichia coli, содержащие адгезивные антигены К 88 ab, К 88 ас, К 88 ad, K99, F-41, Att-25, 987P, исследуют физико-химические и биологические показатели в процессе роста бактериальной массы, дополнительно определяют активность фимбриальных адгезинов в реакции пассивной гемагглютинации клеточной бактериальной массы с последующим прекращением культивирования бактерий при значении титров фимбриальных адгезинов К 88 ab, К 88 ас, К 88 ad, K99, F-41, Att-25, 987P, равных: 1:2048-4096; 1:1024-2048; 1:256-512; 1:1024-2056; 1:1024-2056; 1:32-64; 1:256-512 соответственно. Затем концентрируют биомассу, для отделения культуральной жидкости от клеточной бактериальной массы проводят центрифугирование при 3000-5000 об/мин в течение 20-25 минут и инактивируют препарат. Изобретение позволяет повысить качество целевого продукта. 2 табл.

Способ получения вакцины против эшерихиоза животных, включающий культивирование клеток Escherichia coli в жидкой питательной среде, исследования физико-химических, биологических показателей в процессе роста бактериальной массы с последующим прекращением культивирования клеток Escherichia coli, концентрированием их и инактивацией, отличающийся тем, что культивируют клетки Escherichia coli, содержащие адгезивные антигены К 88 ab, К 88 ас, К 88 ad, K99, F-41, Att-25, 987P, во время культивирования клеток Escherichia coli дополнительно определяют активность фимбриальных адгезинов в реакции пассивной гемагглютинации клеточной бактериальной массы, затем прекращение культивирования осуществляют при значении титров фимбриальных адгезинов клеток Escherichia coli, содержащих адгезивные антигены К 88 ab, К 88 ас, К 88 ad, K99, F-41, Att-25, 987P, равные как 1:2048-4096; 1:1024-2048; 1:256-512; 1:1024-2056; 1:1024-2056; 1:32-64; 1:256-512 соответственно, а на стадии концентрирования культуральную жидкость освобождают от клеточной бактериальной массы центрифугированием при 3000-5000 об/мин в течение 20-25 мин.