РАДИОФИЗИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ ЖИВЫХ И НЕЖИВЫХ ОДНОКЛЕТОЧНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2009 года по МПК C12Q1/06 G01N33/02 

Изобретение относится к технике измерений и может быть использовано при автоматизации процесса измерений в микробиологии, пищевой промышленности при оценке жизнеспособности одноклеточных микроорганизмов (дрожжей и др.) путем определения в смеси процентного содержания живых и неживых одноклеточных микроорганизмов по данным измерений диэлектрической проницаемости в диапазоне радиоволн.

Способ основан на экспериментально установленных зависимостях диэлектрической проницаемости влажной смеси и ее второй производной от влажности.

Известен широко используемый на практике метод подсчета живых и неживых микроорганизмов, находящихся во взвеси, путем их микроскопирования с предварительным окрашиванием специальными, в том числе флуоресцентными, красителями, осуществляемый с помощью счетных камер Бюркера, Горяева и подобных им приспособлений для визуального подсчета под микроскопом количества объектов, невидимых невооруженным глазом (см., например, [1]).

Недостатком данного способа является необходимость предварительной специальной технической подготовки препаратов для изучения живой и убитой клеток, соблюдение жестких условий стерильности, что в технологических условиях не всегда может выполняться. Также следует учитывать, что данные, полученные этим способом, относятся к микроскопически малому объему или поверхностному слою толщиной в несколько нанометров и не всегда соответствуют наблюдаемому в действительности процентному соотношению живых и неживых клеток в значительно большем объеме (например, из-за плохого перемешивания).

Известен также способ определения содержания основных производных гемоглобина, основанный на изучении спектров поглощения с помощью спектрофотометра на 6 аналитических длинах волн в диапазоне 450-650 нм (Патент RU №2140083) [2].

Однако для живых и погибших клеток различие спектров поглощения не установлено.

В литературе описаны результаты экспериментальных исследований, из которых следует, что радиофизические свойства живых и неживых клеток различаются. Установлено, что живые и неживые клетки, помещенные в однородное электромагнитное поле с частотой 0.2…0.8 МГц, по разному ориентируются в этом поле и имеют различную электропроводность, зависящую от частоты приложенного поля [3, 4]. Для субстанции, состоящей из живых клеток, установлено, что внеклеточная, внутриклеточная жидкости и клеточная мембрана характеризуются различными значениями комплексной диэлектрической проницаемости (КДП) и электропроводности [5-8].

Но этих данных оказывается недостаточно для определения процентного содержания живых и неживых одноклеточных организмов, находящихся в виде суспензии или однородной смеси.

Для повышения точности определения процентного содержания живых и неживых микроорганизмов, находящихся в смеси, предлагается использовать диапазон радиоволн.

Целью изобретения является определение процентного содержания живых V_Ж и неживых V_Н одноклеточных микроорганизмов в однородной смеси.

Физической основой данного метода является различие диэлектрических свойств живых и неживых одноклеточных микроорганизмов в микроволновом диапазоне электромагнитных волн.

Для определения процентного содержания живых V_Ж и неживых V_Н одноклеточных микроорганизмов проводят измерения диэлектрической проницаемости.

Поставленная цель достигается тем, что с помощью промышленного фазометра ФК2-18 (или любым другим способом) измеряют диэлектрические характеристики электромагнитной волны, проходящей через увлажненный образец, состоящий из одноклеточных микроорганизмов, и определяют V_Ж по формулам:

или

где ε, ε_Ж, ε_Н - диэлектрические проницаемости смеси живых и неживых клеток, W - объемная влажность, ε_Ж, ε_Н являются известными (табличными).

Долю неживых микроорганизмов определяют по формуле V_Н=1-V_Ж.

Сущность изобретения поясняется нижеследующим описанием.

Известно, что диэлектрические характеристики воды, присутствующей в биологических клетках, в значительной степени зависят от ее фазового состава [7, 8]. Наблюдаемые отличия в диэлектрических свойствах живых и неживых клеток связаны с изменением объемного содержания водных фракций, характеризующихся существенно различающимися диэлектрическими параметрами.

Для изучения внутренней структуры микроорганизмов, а также фазового состава и диэлектрических свойств воды, присутствующей в клетках микроорганизмов, может быть использован дециметровый диапазон, в котором наиболее ярко проявляется влияние растворенных солей, а также наблюдаются заметные различия в диэлектрических свойствах связанной и свободной воды.

Предлагаемый способ был апробирован на дрожжевых клетках, относящихся к одноклеточным микроорганизмам.

Диэлектрические характеристики измеряли на лабораторной установке мостового типа, выполненной с использованием измерительного и опорного каналов промышленного фазометра ФК2-18.

В качестве объекта исследования использовали хлебные дрожжи, возраст которых составлял от 2 до 4 суток. Для изменения влажности дрожжевую массу измельчали на отдельные макроагрегаты размером 1…5 мм и равномерно высушивали при температуре 25±1°С в закрытом помещении при свободном доступе воздуха.

Образцы, высушенные до требуемой влажности, помещали в измерительный контейнер, добиваясь его равномерного заполнения дрожжевой массой. Определяли модуль и фазу φ комплексного коэффициента прохождения электромагнитной волны с частотой 1.11 ГГц в волноводе через исследуемый образец. Измеренные величины использовали для определения действительной ε' части комплексной диэлектрической проницаемости.

После измерения диэлектрических параметров определяли объемную влажность путем выпаривания воды из образца. Для этого образец помещали в сушильный шкаф и выдерживали в течение 3 часов при температуре 105°С, после чего производили взвешивание обезвоженных образцов на аналитических весах с погрешностью не более 0.001 г.

Величину объемной влажности, выраженную в объемных долях, определяли по формуле W=V_B/V, где V_B=М_B/ρ_B - объем воды, М_B=M_ВД-M_СУХ - масса содержащейся в образце воды, М_ВД, М_СУХ - массы влажных и сухих дрожжей, ρ_B=1 г/см³ - плотность воды, V - объем контейнера, занимаемый образцом.

Исследованные образцы, в которых в результате нагревания все живые клетки погибли, в дальнейшем использовали для изучения диэлектрических характеристик неживых клеток.

Экспериментальные значения ε интерполировали с помощью пакета прикладных программ "Origin 6.1" следующими соотношениями:

для живых клеток:

для неживых клеток:

где σ - среднеквадратическая погрешность.

Нелинейный характер возрастания значений ε с увеличением W, наблюдаемый на фиг.1 как для живых, так и для неживых клеток, обусловлен существованием в дрожжевой массе связанной и свободной воды, различающейся по диэлектрическим свойствам.

Различие диэлектрических характеристик живых и неживых клеток может быть связано с особенностями формирования структуры воды внутри клетки, в клеточной мембране и в межклеточном пространстве.

Из анализа графиков (1) и (2) можно сделать вывод о том, что по сравнению с живыми клетками в неживых клетках содержится большее количество свободной воды, характеризующейся значительно более высокими значениями ε, чем у связанной воды. Так как основная часть связанной воды в живой клетке находится в клеточной мембране, то, видимо, при отмирании живой клетки часть связанной воды теряет связь с клеточной стенкой и становится свободной.

Предполагая, что диэлектрическая проницаемость смеси ε складывается из диэлектрических проницаемостей живых (ε_Ж) и неживых (ε_Н) клеток, с учетом их процентного содержания в соответствии с соотношением

преобразовав (3) получим выражение для определения V_Ж:

где ε_Ж, ε_Н являются известными (табличными).

Для повышения точности проводят измерения величины ε для нескольких влажностей и строят зависимость ε(W), аппроксимируя ее полиномом третьей степени

находят вторую производную по формуле

Зависимости вторых производных действительной части КДП живых и неживых клеток от влажности (d²ε/dW²) приведены на фиг.2.

Сплошными линиями отмечены экспериментальные зависимости, а пунктирными зависимости, построенные по формуле

где W_Ж=0…1 - содержание в образце живых клеток.

Преобразовав выражение (4) получим формулу для определения V_Ж:

Полученные выражения могут быть использованы для получения информации о количественном содержании в образце живых и неживых клеток.

Использование вышеприведенного способа позволит автоматизировать процесс измерений и тем самым повысить точность измерений.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М.: Изд-во МГУ. 1983. 222 с.

2. Патент RU №2140083 "Способ определения содержания основных производных гемоглобина" / Семиколенова Н.А., Адамов С.А., Александрова С.А., Мосур Е.Ю. 1999.

3. Iglesias, F.J., M.C.Lopez, С.Santamaria, and A.Dominguez. 1985. Orientation of Schizosaccharomyces pomb nonliving cells under alternating uniform and njnuniform electric firlds. Biophys. J. 48: 721-726.

4. Asencor, F.J., С.Santamaria, F.J.Iglesias, and A.Dominguez. 1993. Dielectric energy of orientation in dead and living cells of Schizosaccharomyces pombe. Biophys. J. 64: 1626-1631.

5. Щеголева Т.Ю. Гидратное окружение макромолекул биополимеров по данным СВЧ-диэлькометрии // Биофизика 1984, т.34, вып.6. С.935-939.

6. Gabriel, С., Е.Н.Grant, R.Tata, P.R.Brown, B.Gestblom, and E.Noreland. 1989. Dielectric behavior of aqueous solutions of plasmid DNA at microvawe frequencies. Biophys. J. 55: 29-34.

7. Harvey, S.C., and P.Hoekstra. 1972. Dielectric relaxation spectra of water absorbed on lysozyme. J. Phys. Chem. 76. 2987-2994.

8. Takashima, S., Gabriel, C., Sheppard, R.J. and Е.Н.Grant. 1984. Dielectric behavior of DNA solution at radio and microwave frequencies (at 20°C). Biophys. J. 46: 29-34.

9. Masszi, G. 1972. Dielectric relaxation and water structure in gelatin solution. Acta Biochim. Biophys. Acad. Sci. Hung. 7: 349-357.

10. Schwan, H.P. 1965. Electrical properties of bound water. Ann N.Y. Acad. Sci. 125: 344-354.

Способ может быть использован в микробиологии, пищевой промышленности при оценке жизнеспособности одноклеточных микроорганизмов (дрожжей и др.), у которых наблюдается различие диэлектрических свойств. Процентное содержание в смеси живых и неживых одноклеточных микроорганизмов определяют по отклонению измеренного значения диэлектрической проницаемости от диэлектрических проницаемостей смесей, состоящих только из живых и только из неживых одноклеточных микроорганизмов, или по экспериментальной зависимости второй производной диэлектрической проницаемости от влажности. Способ позволяет повысить скорость анализа, а также может быть использован при разработке дистанционных методов определения в непрерывном потоке, при разработке промышленных технологий контроля над производством живых микроорганизмов. 2 ил.

Радиофизический способ определения процентного содержания живых и неживых одноклеточных микроорганизмов в общей массе, основанный на измерении диэлектрической проницаемости, отличающийся тем, что проводят одночастотные измерения диэлектрической проницаемости с помощью фазометра и находят процентные доли живых V_Ж и неживых V_Н микроорганизмов по формулам
V_H=1-V_Ж,

или

где ε, ε_Ж, ε_Н - диэлектрическая проницаемость смеси, живых и неживых клеток; W - объемная влажность.