Способ определения количества живых клеток в биопрепаратах Советский патент 1992 года по МПК C12N1/00 C12Q1/06 

Изобретение относится к прикладной микробиологии, а именно к способам анализа микроорганизмов.

Как известно, для определения живых клеток в биопрепаратах применяют такие

методы, как высев на чашках Петри, определение количества живых клеток по изменениюсодержанияразличныхвнутриклеточных компонентов (ферментов, структурных компонентов клеточной мембраны, концентрации калия в надосадочной жидкости), появляющихся в среде после гибели клетки и т.д. 1-4.

Недостатками известных способов являются низкая точность, необходимость сложной аппаратуры и длительность определений.

Наиболее близким к предлагаемому способу является физико-химический метод 5, заключающийся в том, что точность и достоверность определения жизнеспособности микробных клеток повышается за счет стабилизации условий роста колоний. Уравнивание условий их образования одиночными клетками достигается тем, что плотные питательные среды, на которые наносятся для высева суспензии микроорганизмов, заземляют, что обеспечивает снятие возникающего при распределении влаги между пробой и средой электрического заряда. В качестве анализируемого пара- метра берется колониеобразующая способность. Точность метода составляет приблизительно 30%.

Недостатком прототипа является длительность эксперимента (16-48 ч).

Целью изобретения является разработка способа анализа, превосходящего поточности прототип и отличающегося меньшей длительностью.

Указанная цель достигается тем, что в качестве параметра, определяющего состояние клетки, измеряют электрокинетические потенциалы.

Анализ проводят следующим образом.

Определяют дзета-потенциалы натив- ной ( РО) и полностью инактивированной культур (рм ) и определяют число живых клеток по предварительно построенной кривой зависимости числа живых клеток от параметра

0 bte

ро

где Apt - разность дзета-потенциалов на- тивной культуры в момент времени t(pt) и полностью инактивированной культуры (рм);

Ар0 Apt при . Определение дзета-потенциала клеток проводят методом микроэлектрофореза 6. Суспензию клеток помещают в видоизмененную ячейку Абрамсона, представляющую собой плоскопараллельный капилляр, на концах которого находятся емкости с обратимыми Си Си504-электродами и агаровыми пробками. Наблюдение за движением клетки ведут с помощью микроскопа Био- лар (увеличение 300) в темном поле. Для определения истинной электрофоретичеЈ

ской скорости клеток все измерения проводят на 1 /5 глубины ячейки 6. Время (t) про- хождения клеткой определенного расстояния (h) под действием постоянного

электрического поля измеряют электронным секундомером СТЦ-1, после чего переключателем меняют направление тока на противоположное и снова фиксируют время. Такие измерения проводятся не менее

чем для 100 клеток. Напряжение на ячейку подается с помощью блока питания У1/1П-1 так, чтобы градиент электрического поля составлял 600-700 В/м. Величину тока и напряжение в цепи регистрируют цифровым

вольтамперметром ВК-2-20, а электропроводность суспензии измеряют по обычной методике на переменном токе в специальной ячейке с платиновыми электродами с помощью моста емкостей Е8-2. Дзета-потенциал клеток рассчитывают по формуле Гельмгольца-Смолуховского 7

AnrjKh S/ 4

Dlt где rj- вязкость раствора;

к- удельная электропроводность суспензии клеток;

S - площадь поперечного сечения ячейки;

D -диэлектрическая постоянная среды;

I - сила тока в ячейке; h - расстояние, проходимое клеткой за время t.

Измерения электрофоретической подвижности использовались ранее для определения видовой принадлежности микроорганизмов 8 и 9 и определения их электроповерхностных свойств 10-13.

Существенность отличий предлагаемого способа от известных заключается в том, что авторами впервые было установлено наличие разницы в дзета-потенциале между живыми и мертвыми культурами и связь различия между этими потенциалами с их выживаемостью.

П риме р 1. Культура E.coli штамм М-17, выращенная на глюкозоминеральной среде, инактивировалась в результате хранения. Хранение осуществлялось при 20 ± 2 и 4 ± 1°С в течение 16 сут. На разных этапах хранения одновременно с измерением дзета-потенциала определялась их биологическая концентрация, В табл. 1 приведены

усредненные значения исследованных параметров для биологических и физико-химических свойств клеток.

По методу наименьших квадратов был проведен расчет коэффициентов уравнения

линейной регрессии, при этом были использованы экспериментальные значения, приведенные в табл. 1 (BKtxIO , -р. Анализ полученных результатов показывает, что между выживаемостью и величиной дзета- потенциалов клеток существует линейная зависимость с коэффициентом корреляции 0,996. Коэффициент корреляции рассчитывался по формуле

Т2 S(5-hxcBKi-5K)f

2(Јi-e)2HZ(BKi-BK)2

где Т - коэффициент корреляции;

БК и - средние значения соответствующих величин.

Выявленная линейная корреляция между дзета-потенциалом и БК представляет не только научный, но и практический интерес, поскольку на основании данных по электро- форетической подвижности клеток появляется возможность оценивать их биологическую активность. Учитывая простоту и большую скорость измерения, метод микроэлектрофореза в ряде случаев может заменить более трудоемкий традиционный способ определения биологической концентрации клеток - высев на твердые питательные среды и подсчет колониеобразующих единиц.

П р и ме р 2. Из данных табл. 1 строится калибровочный график BKt/БКо от в(см. фиг. 1). Этот график может быть использован для определения БК по измерению дзе- та-потенциала клеток. Например, дзета-потенциал и БК нативной культуры составляют 25,4 мВ и 8х109 кл/мл соответственно. Через 5 дней хранения дзета-потенциал клеток стал равен 15,5 мВ. Зная, что дзета-потенциал полностью инактиви- рованной культуры составляет 10,5 мВ, вычисляем коэффициент #(15,5- 10,5)х(25,4- 10,5),3. Из калибровки определяем, что БК в результате пятидневного хранения культуры составляет 2,7x109 кл/мл. Традиционный способ - высев клеток на чашке Петри-дал значение 2,4x109 кл/мл. Результаты определения БК, полученные двумя

способами, дают совпадающие в пределах экспериментальных погрешностей величины, но в отличие от традиционного метода экспресс-анализ позволяет определять Б К

5 клеток по электрофоретической подвижности в течение 10-20 мин.

Примерз. В табл. 2 приведены значения дзета-потенциала и БК культуры E.coll штамм М-17, подвергшейся равным

10 режимам инактивации.

Как видно из табл. 2, выживаемость клеток E.coli, определенная двумя методами, дает близкие результаты.

Из преимуществ метода можно указать

15 также точность определения изменения Б К клеток, полученной по электрокинетическому потенциалу.

П р и м е р 4. На фиг. 2 представлен график зависимости БК от дзета-потенциа20 ла для клеток E.coli М-17. На этой же фиг.2 приведены среднеквадратичные отклонения полученных экспериментальных результатов. Измерения проводились по мере инактивации культуры в результате хране25 ния при 4 и 20°С. Величина дзета-потенциала клеток определялась по измерению электрофоретической подвижности не менее 100 клеток. Точность определения величины дзета-потенциала клеток E.coli

30 соответствовала 3%. Численные значения БК клеток определялись высевом клеток в 4-5 чашках Петри. Как показали измерения, точность определения изменения выживаемости, вычисленной по дзета-потенциалу,

35 превосходила точность определения изменения БК по традиционному методу в несколько раз.

Формула изобретен и я Способ определения количества живых

40 клеток в биопрепаратах путем измерения физико-химического параметра йсеяедуе- мой нативной и инактивированной кульУур с последующей оценкой результатов; отличающийся тем, что, с целью усКбр ения

45 и повышения точности способа, в качестве физико-химического параметра измеряют дзета-потенциал.

Таблица 1

Использование: микробиологическая промышленность. Сущность изобретения: определяют дзета-потенциал нативной и полностью инактивированной культур. Строят кривую зависимости числа живых клеток от величины дзета-потенциала. Определяют количество живых клеток по кривой. При этом сокращается время и повышается точность определения. 2 табл. 2 фиг, (/) С VI со ел GJ ,0 VI

Изменение физико-химических и биологических свойств клеток Е.соМ в процессе хранения культуры

х При расчете параметра в, величина Јм принималась равной 10,5 мВ, т.к. ниже этой величины дзета-потенциал клеток не опускался

Изменение физико-химических и биологических

свойств клеток E.coli в зависимости от способа

инактивации

БК измерена традиционным методом БК определена по дзета-потенциалу.

Таблица 2

lO 18Ct/3Co

Фиг.1

25 ,-

Ю 8Uu3iff

10 11 /2 73 М U № 17 18 /9 20 2122 С UJ

Фаг. 2 50