ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ H.INFLUENZAE И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2009 года по МПК C12Q1/20 C12Q1/04 C12R1/21 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для выделения H.influenzae из патогенного материала.

H.influenzae является причиной таких инфекций как пневмония, эпиглотит, септический артрит, остеомиелит, средний отит у детей, гайморит, бактериальный конъюктивит, назофарингит. Эти бактерии обитают на слизистых оболочках верхних дыхательных путей, реже гениталий. Как правило на слизистых оболочках выявлются бескапсульные нетипируемые варианты H.influenzae, имеющие значение в развитии острого среднего отита, гайморита, хронических бронхолегочных инфекций, поэтому выделение и культивирование H.influenzae является важным фактором в диагностике заболеваний.

Для выявления H.influenzae в бактериологических лабораториях чаще всего используют «шоколадный агар», содержащий питательный агар и 15% дефибринированной крови лошади или человека, для приготовления которого в расплавленный и охлажденный до 80°С питательный агар добавляют в несколько приемов кровь лошади или человека, сохраняя температуру прогрева 70-80°С 25-30 минут (Приказ МЗ СССР №535 от 22 апреля 1985 г. «Об унификации микробиологических (бактереологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений» Москва, 1985 г., с.119-120). Как известно добавление крови к питательному агару увеличивает факторы роста (V и X) для бактерий H.influenzae.

Однако дефибринированная кровь во многих лабораториях не всегда доступна, кроме того, при приготовлении среды, вследствие термических обработок разрушается V фактор и частично Х фактор, что не обеспечивает условия для выделения H.influenzae из патогенного материала, особенно снижается чувствительность при малом количестве H.influenzae, которое можно выделить из 1 мл биоматериала (ликвор, кровь, мокрота). Среда, приготовленная из этих компонентов, имеет фактор Х в необходимом количестве, а фактор V остается в небольшом количестве, поэтому на такой среде не могут быть выделены малые количества H.influenzae из патогенного материала, особенно из обычно стерильных полостей, в отсутствии других микробов, являющиеся для них «кормушками», кроме того, в настоящее время для лабораторий недоступна дефибринированная кровь человека.

Поставленная задача - создание среды с высокой чувствительностью к H.influenzae, а так же доступность и простота приготовления.

Поставленная задача решается следующим образом.

В питательной среде для выделения H.influenzae, содержащей основу - питательный агар и стимуляторы роста, согласно изобретению в качестве стимуляторов роста используют эритроцитарную массу крови человека, сыворотку крупного рогатого скота и дрожжевой экстракт при следующем содержании компонентов, мл:

Питательный агар (2%) 100 Эритроцитарная масса крови человека 10 Сыворотка крупного рогатого скота 5 Дрожжевой экстракт 5

Способ получения питательной среды для выделения H.influenzae путем смешения питательного агара со стимуляторами роста и прогревания смеси отличается тем, что в качестве стимуляторов роста смесь содержит эритроцитарную массу крови человека, сыворотку крупного рогатого скота и дрожжевой экстракт, а смешение питательного агара со стимуляторами роста осуществляют в три этапа: на первом - к питательному агару добавляют половину эритроцитарной массы крови человека и прогревают смесь до 75-80°С в течение 5 минут; на втором - к охлажденной смеси до 55-60°С добавляют вторую часть эритроцитарной массы крови человека, снова прогревают смесь до 75-80°С в течение 5 минут, после чего охлаждают до 45-50°С; на третьем этапе - к охлажденной смеси добавляют сыворотку крупного рогатого скота и дрожжевой экстракт.

Использование в качестве стимуляторов роста эритроцитарной массы крови человека, сыворотки крупного рогатого скота и дрожжевого экстракта (в определенных количествах к 100 мл питательного агара) позволяет конструировать полноценную питательную среду для выделения и дальнейшего культивирования H.influenzae. Компоненты среды способствуют образованию капсулы у штамма, что имеет принципиальное значение для типирования H.influenzae и определения серологического (капсульного) варианта. При этом эритроцитарная масса крови человека поставляет в питательную среду фактор X, а сыворотка крупного рогатого скота и дрожжевой экстракт - фактор V и другие компоненты, необходимые для роста, что обеспечивает условия для выделения H.influenzae из патогенного материала, даже при его малых количествах. Приготовление среды в три этапа с минимальным временем прогрева практически не меняет количественный состав фактора Х и фактора V (который добавляется в уже охлажденную смесь). Величина вносимых в основу компонентов обусловлена необходимостью получения плотной питательной среды (1-2% агар-агара), необходимой для работы в лаборатории для микробиологических исследований.

Автор провел сравнительные исследования заявляемой среды и питательной среды, приготовленной по принципу «шоколадного» агара: с применением дефибринированной крови человека согласно методических рекомендаций. Для выделения H.influenzae использовали клинический материал объемом 1 мл (мокрота, заднеглоточные и назофарингеальные мазки и кровь, ликвор от больных детей). Результаты исследований показали, что предлагаемый состав питательной среды имеет более высокую чувствительность - выделение минимального количества H.influenzae (от 10 до 50 клеток в мл на заявляемой среде, в прототипе - 200 - 100 клеток в мл), а предлагаемый способ приготовления полноценной среды в условиях практической лаборатории является простым и доступным для лабораторий любого уровня.

Кроме того, при исследовании мокрот 105 больных пневмонией детей, с выделением H.influenzae, на заявляемой питательной среде, выявлено, что причиной пневмонии в 11,5% случаев стал возбудитель H.influenzae, что можно использовать для диагностических целей.

Питательную среду с компонентным составом: 2% питательный агар - 100 мл; эритроцитарная масса крови человека - 10 мл; сыворотка крупного рогатого скота - 5 мл; дрожжевой экстракт - 5 мл готовят следующим образом.

К 100 мл расплавленного и остуженного до 65-70°С питательного агара, например питательный агар Махачкалинского НИИ питательных сред из гидролизата кильки (промышленно-выпускаемый), добавляют 5 мл эритроцитарной массы из крови человека (получаемой со станций переливания крови согласно ГОСТа). Флакон взбалтывают и нагревают на водяной бане до 75-80°С в течение 5 минут. При постоянном встряхивании флакона на водяной бане получается светло-коричневая масса с мелкими хлопьями. Смесь остужают до 55-60°С в течение 10 минут и добавляют еще 5 мл эритроцитарной массы. Флакон снова нагревают на водяной бане до 75-80°С в течение 5 минут при постоянном перемешивании, после чего смесь охлаждают до 55-60°С и добавляют 5 мл сыворотки крупного рогатого скота (имеет промышленное производство) и 10 мл дрожжевого экстракта, который готовят заранее по известной методике (Энтэробактерии. Под ред. Покровского В.И., М.: Медицина, 1985 г.). Приготовленную среду сразу разливают по чашкам Петри. Среда имеет вид полупрозрачного агара с коричневатым оттенком и хранится при температуре +4°С в течение 2-3 дней.

Пример. Для сравнения использовали материал (10 образцов мокроты от больных с пневмонией и 10 образцов ликвора от больных с гнойным менингитом). При микроскопии в мокроте и ликворе обнаружены грамотрицательные бактерии, похожие на H.influenzae, при посеве на «шоколадный» агар из человеческой крови - H.influenzae не обнаружены, на чашке Петри со средой не обнаружено ни одной колонии Н.influenzae, на предлагаемой среде были выявлены от 10 и более колоний Н.influenzae.

Пример изобретения: получение питательной среды предусматривает смешение 2%-ного расплавленного питательного агара со стимуляторами роста, в качестве которых используют эритроцитарную массу из крови человека, сыворотку крупного рогатого скота и дрожжевой экстракт, в три этапа: на первом этапе - к расплавленному 2%-ному питательному агару добавляют половину эритроцитарной массы из крови человека и нагревают до 75-80°С в течение 5 минут; на втором этапе - к охлажденной смеси до 55-60°С добавляют остальную часть эритроцитарной массы из крови человека, вновь нагревают смесь до 75-80°С в течение 5 минут, после чего охлаждают до 45-50°; на третьем этапе - к охлажденной смеси добавляют сыворотку крупного рогатого скота и дрожжевой экстракт.

Таким образом, полученные данные показали, что предлагаемая среда и способ ее приготовления позволяет выделить бактериологическим методом Н.influenzae даже при малым количествах этого возбудителя в патологическом материале. Чувствительность полученной среды в 10-100 раз больше, чем в используемых в настоящее время средах, кроме этого доступность компонентов и простота приготовления заявляемой среды позволяете использовать ее для выделения Н.influenzae из клинического материала в лабораторных условиях при диагностике инфекционных заболеваний.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для выделения Н.influenzae из патогенного материала. Способ получения питательной среды предусматривает смешивание 2%-ного расплавленного питательного агара со стимуляторами роста, в качестве которых используют эритроцитарную массу из крови человека, сыворотку крупного рогатого скота и дрожжевой экстракт, в три этапа. На первом этапе - к расплавленному 2%-ному питательному агару добавляют половину эритроцитарной массы из крови человека и нагревают смесь до 75-80°С в течение 5 минут. На втором - к охлажденной смеси до 55-60°С добавляют остальную часть эритроцитарной массы из крови человека, вновь нагревают смесь до 75-80°С в течение 5 минут, после чего охлаждают до 45-50°С. На третьем этапе к охлажденной смеси добавляют сыворотку крупного рогатого скота и дрожжевой экстракт. Изобретение позволяет повысить чувствительность питательной среды к Н.influenzae. 2 н.п. ф-лы.

1. Питательная среда для выявления Н.influenzae, содержащая питательный агар и стимуляторы роста, отличающаяся тем, что она содержит 2%-ный питательный агар, в качестве стимуляторов роста она содержит эритроцитарную массу из крови человека, сыворотку крупного рогатого скота и дрожжевой экстракт при следующем содержании компонентов, 2%-ный питательный агар - 100 мл, эритроцитарная масса из крови человека - 10 мл, сыворотка крупного рогатого скота - 5 мл, дрожжевой экстракт - 5 мл.

2. Способ получения питательной среды по п.1 путем смешивания 2%-ного расплавленного питательного агара со стимуляторами роста, в качестве которых используют эритроцитарную массу из крови человека, сыворотку крупного рогатого скота и дрожжевой экстракт, в три этапа: на первом этапе - к расплавленному 2%-ному питательному агару добавляют половину эритроцитарной массы из крови человека и нагревают смесь до 75-80°С в течение 5 мин; на втором - к охлажденной смеси до 55-60°С добавляют остальную часть эритроцитарной массы из крови человека, вновь нагревают смесь до 75-80°С в течение 5 мин, после чего охлаждают до 45-50°С; на третьем этапе к охлажденной смеси добавляют сыворотку крупного рогатого скота и дрожжевой экстракт.