ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ Mus musculus L. - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ РАЗНЫХ ИЗОФОРМ АЛЬФА2-МИКРОГЛОБУЛИНА ФЕРТИЛЬНОСТИ (АМГФ)/ГЛИКОДЕЛИНА Российский патент 2009 года по МПК C12N5/18 C12P21/08 

Изобретение относится к области биотехнологии, репродуктивной медицины, иммуногистохимии.

Сущность изобретения: Штамм получен путем слияния клеток мышиной миеломы SP2/0.Ag14 с клетками лимфоузлов мышей линии Balb/c, иммунизированных введением в подушечки лап очищенного препарата АМГФ, выделенного из амниотической жидкости. Селекция гибридом проведена на среде HAT. Штамм синтезирует моноклональные антитела (МКА), специфически взаимодействующие в твердофазном иммуноферментном анализе и иммуногистохимическом анализе с АМГФ как эндометриального, так и спермального происхождения. Титр антител в культуральной жидкости составляет 1:500-1:1000, в асцитной жидкости до 1:1×10⁷. Моноклональные антитела могут быть использованы для конструирования иммунобиотехнологических тест-систем для количественного определения АМГФ в биологических жидкостях и для иммуногистохимического исследования тканей.

Белок АМГФ/гликоделин - гликопротеин, представляющий собой гомодимерный комплекс с молекулярной массой 50-60 кДа и молекулярной массой субъединиц 28 кДа. В 1976-1985 гг. несколькими независимыми группами исследователей белок был выделен из ранней плаценты человека, децидуальной оболочки, амниотической жидкости, семенной плазмы и охарактеризован под разными наименованиями в зависимости от источника и физико-химических свойств: плацентарный α2-глобулин (Петрунин Д.Д., Грязнова И.М., Петрунина Ю.П., Татаринов Ю.С. Иммунохимическая идентификация органоспецифического α2-глобулина плаценты человека и его содержание в амниотической жидкости. БЭБиМ, 1976, №7, с.803-804); α2-микроглобулин фертильности (Петрунин Д.Д., Пшеничникова Т.Я., Шевченко О.П., Пиганова Н.Л. Иммунохимическое исследование α2-микроглобулина фертильности в эндометрии. Акуш. и гин., 1983, №9, с.27-28); плацентарный протеин 14, РР14 (Bohn H., Kraus W., Winckler W, New soluble placental tissue proteins: their isolation, characterization, localization and quantification. In: "Immunology of Human Placental Proteins", ed. Klopper. Placental Suppl (4) Praeger, NY, 1982, p.67-82); эндометриальный α2-глобулин, α2-PEG (Bell S.C., Hales M.W., Patel S., Kiwan P.H. Protein synthesis and secretion by the human endometrium and decidua during early pregnancy. Br. J. Obstet. Gynaecol., 1985a, v.92, p.793-803); ассоциированный с беременностью эндометриальный протеин 15, ЕР15 (Bell S.C., Patel S., Hales M.W. Immunochemical detection and characterization of pregnancy-associated endometrial alpha-globulins secreted by the human endometrium. J.Reprod. Fertil., 1985b, v.74, p.261); прогестаген-зависимый эндометриальный белок, PEP (Joshi S.G., Ebert K.M., Swartz D.R. Detection and synthesis of a progestogen-dependent protein in human endometrium. J.Reprod. Fertil.,1980, v.59, p.273); α-маточный белок, AUP (Sutcliff R.G., Joshi S.C., Patterson W.F. Serological identity between human alpha-uterine protein and human progestogen-dependent endometrial protein. J.Reprod. Fertil., 1982, v.65, p.207.). В иммунологических тестах была установлена антигенная идентичность этих белков (Bohn H., Kraus W., Winckler W. New soluble placental tissue proteins: their isolation, characterization, localization and quantification. In: "Immunology of Human Placental Proteins", ed. Klopper. Placental Suppl; (4) Praeger, NY, 1982, p.67-82; Bell S.C., Bohn H. Immunochemical and biochemical relationship between human pregnancy-associated secreted endometrial alphal- and alpha2-globulins (alphal- and alpha2-PEG) and the soluble placental proteins 12 and 14 (PP12 and PP14). Placenta, 1986, v.7, N4, p.283-294). Для унификации номенклатуры Dell и соавт. (Dell A., Morris H.R., Easton R.L. Structural analysis of the oligosaccharides derived from glycoprotein with potent immunosuppressive and contraceptive activities. J. Biol. Chem., 1995, v.270, N41, p.24116-24125) предложили современное обозначение "гликоделин", отражающее уникальное свойство белка - зависимое от пола гликозилирование и наличие его различных гликоформ в зависимости от места синтеза: амниотической - гликоделин-А, спермальной - гликоделин-S (Seppala M., Taylor R.N., Koistinen H., Koistinen R., Milgrom E. Glycodelin: A major lipocalin protein of the reproductive axis with diverse action in cell recognition and differentiation. Endocrin. Reviews, 2002, 23 (4): 401-430), фолликулярной - гликоделин-F (Chiu P.C., Koistinen R., Koistinen H. et al. Zona binding inhibitory factor-1 from human follicular fluid is an isoform of glycodelin. Biol. Reprod., 2003, 69: 365-372), кумулюсной - гликоделин-С (Chiu Р.С., Chung М.К., Koistinen R., et al. Cumulus oophorus-associated glycodelin-C displaces sperm bound glycodelin-A and -F and stimulates spermatozoa-zona pellucida binding. J. Biol. Chem., 2007, 282 (8): 5378-88). Уровень АМГФ/гликоделина в биологических жидкостях отражает функциональное состояние органов репродуктивной системы человека, его количественное определение может быть использовано для дифференциальной диагностики и контроля эффективности лечения нарушений репродуктивного здоровья.

Изобретение относится к гибридомной биотехнологии и может быть использовано для создания иммунодиагностических тест-систем с целью количественного определения АМГФ/гликоделина в биологических жидкостях и иммуногистохимического исследования тканей.

Цель изобретения - получение штамма гибридомных клеток, синтезирующих МКА против АМГФ/гликоделина с высокой пролиферативной активностью и продуктивностью. В зарубежной литературе описано получение МКА к белкам РР14 (Riitinen L., Narvanen О., Virtanen et al. Monoclonal antibodies against endometrial protein PP 14 and their use for purification and radioimmunoassay of PP 14. J. Immunol. Methods, 1991, 136: 85-90), α2-PEG (Bell S.C., Jackson J., Dore-Green F. et al. Development and validation of a radioimmunoassay for human α2-PEG and detection in serum during pregnancy Hum. Reprod., 1987, 25(5): 389-97), гликоделину (Eschke U., Kuhn С., Mylonas I. et al. Development and characterization of monoclonal antibodies for the immunohistochemical detection of glycodelin A in decidual, endometrial and gynecological tumor tissues. Histopathology, 2006, 48(4): 394-406). Однако при получении штаммов гибридных клеток были использованы другой источник антигена для иммунизации (очищенный цитозольный экстракт эндометрия - Bell (Bell S.C., Jackson J., Dore-Green F. et al. Development and validation of a radioimmunoassay for human α2-PEG and detection in serum during pregnancy Hum. Reprod., 1987, 25 (5): 389-97); другой способ иммунизации (подкожное введение) и партнеры для гибридизации - спленоциты и миелома линии Х63-Ag8.653 - Riitinen et al. (Riitinen L., Narvanen O., Virtanen et al. Monoclonal antibodies against endometrial protein PP 14 and their use for purification and radioimmunoassay of PP 14. J. Immunol. Methods, 1991, 136: 85-90); полученные МКА были направлены к углеводным структурам гликоделина и реагировали только с белком, выделенным из амниотической жидкости, но не со спермальным гликоделином (Eschke U., Kuhn С., Mylonas I. et al. Development and characterization of monoclonal antibodies for the immunohistochemical detection of glycodelin A in decidual, endometrial and gynecological tumor tissues. Histopathology, 2006, 48(4):394-406), поэтому тождества с аналогами не имеется.

Отечественные штаммы гибридом, продуцирующие МКА против различных изоформ АМГФ/гликоделина, получены нами впервые.

За прототип принят штамм гибридомных клеток 4f8 (Болтовская М.Н., Старосветская Н.А., Маршицкая М.И., Назимова С.В., Степанов А.А., Шевченко В.В. Получение и практическое использование моноклональных антител против альфа2-микроглобулина фертильности. Бюлл. эсперим. биол. и мед. - 1997. - Т.124, №9. - С.319-322), продуцирующий МКА IgG1 класса, направленное против одного из эпитопов молекулы АМГФ, выявляющее данный белок в твердофазном иммуноферментном анализе с чувствительностью до 5 нг/мл. В отличие от прототипа, полученного при гибридизации лимфоцитов селезенки мышей Balb/c, иммунизированных 4-кратным внутрибрюшинным введением 10 мкг АМГФ, выделенного из амниотической жидкости, с завершающей внутривенной иммунизацией, штамм гибридомы A5D1 был получен с использованием другого способа иммунизации, чувствительность выявления АМГФ в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА) с использованием МКА A5D1 составляет 1 нг/мл.

Штамм A5D1 получают следующим способом.

Мышей Balb/c иммунизируют 4-кратным введением 10-40 мкг АМГФ (последовательно в полном, неполном адъюванте Фрейнда и в физиологическом растворе) в подушечки лап. Спустя 3 дня после заключительной иммунизации лимфоциты подколенных лимфоузлов гибридизируют с клетками сингенной миеломы линии Sp2/0.Ag14 в соотношении 1:10 в 50% растворе полиэтиленгликоля-4000 (Merck) с 10% диметилсульфоксида в среде RPMI 1640 в течение 1 мин. После гибридизации клетки ресуспендируют в селективной среде HAT - гипоксантин, аминоптерин, тимидин (Flow) на основе RPMI 1640 с добавлением 20% фетальной телячьей сыворотки (Flow) и 4 мМ глутамина и рассевают в культуральные 96-луночные плоскодонные микропланшеты (Costar, Linbro). Спустя три недели после гибридизации (завершение этапа метаболической селекции) первичные гибридомы и/или клоны переводят на среду НТ, не содержащую аминоптерин, а через неделю культивирования исключают НТ. Через 7-14 дней после гибридизации в лунках наблюдают рост колоний гибридных клеток.

Для селекции гибридом, продуцирующих МКА заданной специфичности, из лунок с растущими колониями отбирают культуральный супернатант и тестируют его методом твердофазного ИФА в варианте, исключающем возможность отбора МКА на конформационно измененный антиген. Для этого микропланшеты для ИФА сенсибилизируют аффинно очищенными поликлональными кроличьими антителами против IgG мыши в концентрации 2 мкг/мл в карбонат-бикарбонатном буфере (0.05М, рН 9.5), неспецифическое связывание блокируют 1%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина в фосфатно-солевом буфере рН 7.4. Затем в лунки вносят по 100 мкл тестируемых образцов культурального супернатанта и инкубируют 1 ч при комнатной температуре на шейкере. В качестве детектора используют конъюгат высокоочищенного АМГФ с пероксидазой хрена в разведении 1:1000, полученный в лаборатории клеточной иммунопатологии и биотехнологии НИИ МЧ РАМН по методу Nakane (инкубация 1 ч при комнатной температуре на шейкере). После каждой инкубации микропланшеты 5-кратно отмывают от несвязавшихся компонентов. Реакцию проявляют 4 мМ тетраметилбензидин ди гидрохлорида с 0.01% перекисью водорода в 100 мМ фосфатно-цитратном буфере рН 4.5 (20 мин в темноте при комнатной температуре) и останавливают однонормальной серной кислотой. Оптическую плотность регистрируют с помощью сканирующего многоканального спектрофотометра Multiskan Titertek (Flow, UK) при длине волны 450 нм.

Гибридомы, в супернатанте которых обнаружены МКА против АМГФ, клонируют методом предельных разведений в жидкой фазе на фидерном слое тимоцитов 2-4 раза, пока частота позитивных клонов не достигнет 100%. АМГФ-позитивные клоны наращивают в 24-луночных культуральных планшетах, отбирая супернатант для оценки специфичности продуцируемых МКА. Специфичность МКА определяют методом непрямого ИФА с использованием очищенных препаратов эндометриальных и плацентарных белков (плацентарный α1-микроглобулин, трофобластический β1-глобулин, хорионический гонадотропин), α-фетопротеина, бычьего сывороточного альбумина, С-реактивного белка, сорбированных на твердой фазе из растворов с концентрацией 1 мкг/мл. Клоны, реагирующие с АМГФ и не дающие перекрестных реакций с контрольными белками, размножают in vitro и in vivo.

Штамм A-5D1 характеризуется следующими свойствами.

Культуральные свойства штамма: гибридные клетки растут в виде суспензии in vitro или в виде асцитной опухоли в перитонеальной полости после введения сингенным мышам Balb/c.

Условия культивирования штамма in vitro: среда RPMI 1640, 10% фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, температура 37°С, газовая фаза 5-7% СО₂, стеклянные или пластиковые флаконы. Концентрация клеток при посеве 2×10⁵ /мл, кратность пассирования - 2-3 раза в неделю, предельная плотность -10⁶/мл. Штамм перевивают на среде, не содержащей антибиотики. Контаминация бактериями и грибами не обнаруживается.

Культивирование в организме животного: мыши Balb/c, предобработанные вазелиновым маслом (0,5 мл внутрибрюшинно за 10-30 дней до введения гибридных клеток), доза вводимых клеток 2-5×10⁶/мышь, время образования асцита 7-14 дней, объем асцитной жидкости 3-7 мл.

Титры моноклональных антител при определении методом твердофазного иммуноферментного анализа 1:500-1:1000 в культуральных супернатантах, 1:10⁶-1:10⁷ в асцитной жидкости.

Рекомендуемые условия для замораживания. Клетки суспендируют в среде RPMI 1640, содержащей 20% фетальной телячьей сыворотки и 10% диметилсульфоксида, разводят до концентрации 1-2×10⁶ клеток/мл и переносят в пластиковые криовиалы. Виалы в толстостенном пенопластовом контейнере помещают на ночь в низкотемпературный холодильник (-70°С), после чего переносят в жидкий азот.

Производимый штаммом A-5D1 продукт - моноклональные антитела. Маркерный признак - продукция МКА против АМГФ/гликоделина человека.

Активность (продуктивность) штамма: гибридомный культуральный супернатант содержит 3-5 мкг/мл МКА, асцитная жидкость - 2-5 мг/мл МКА. Способ определения активности штамма - спектрофотометрическое определение концентрации иммуноглобулинов в культуральной среде и асцитной жидкости, определение титра МКА в ИФА с антигеном, сорбированным на твердой фазе.

МКА, продуцируемые штаммом A-5D1 относятся к классу иммуноглобулинов IgG1 по данным ИФА с типирующими моноспецифическими антисыворотками против классов иммуноглобулинов мыши.

Кариотип гибридных клеток штамма мышиный, модальное число хромосом не определялось.

Область применения штамма A-5D1: биотехнология, репродуктивная медицина, иммуногистохимия.

Примеры использования штамма гибридных клеток (гибридомы)

Пример 1. Использование МКА, продуцируемых штаммом A-5D1, для иммуногистохимического (ИГХ) исследования органов женской репродуктивной системы

Материал для ИГХ исследования эндометрия был получен при искусственном прерывании физиологической беременности (4-10 нед.). Соскобы из полости матки фиксировали в 10% нейтральном формалине на фосфатно-солевом буфере и обрабатывали по стандартной методике приготовления патогистологических препаратов с заключением в парафин. Визуализацию АМГФ в тканях проводили методом непрямого иммунопероксидазного окрашивания с использованием очищенных МКА А-5D1 в исходной концентрации 4.0 мг/мл. Депарафинированные срезы регидратировали и обрабатывали 30 минут 0.03% раствором Н₂O₂ в абсолютном метаноле, чтобы блокировать активность эндогенной пероксидазы. Для уменьшения неспецифического связывания антител срезы инкубировали с 5% раствором БСА на фосфатно-солевом буфере в течение 30 минут при комнатной температуре. МКА A-5D1 наслаивали на срезы в разведениях 1:500-1:1000 и экспонировали стекла во влажной камере при 4°С в течение 18-20 часов. После трехкратной отмывки буфером на срезы наносили кроличьи антимышиные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена в разведении 1:1000 (30 минут при комнатной температуре). Для проявления реакции в качестве хромогена использовали 3.3-диаминобензидин (Sigma, USA). После проведения реакции срезы обезвоживали по стандартной методике и заключали в канадский бальзам. Для исключения неспецифических реакций проводили негативный контроль реагентов: исключали первичные МКА, заменяя их фосфатно-солевым буфером; в качестве первичных антител использовали МКА того же субкласса (IgG1) к антигенам, заведомо отсутствующим в исследуемой ткани (С-реактивному белку, альфа-фетопротеину); вместо первичных МКА наносили на срезы неиммунные мышиные иммуноглобулины.

На срезах ткани эндометрия МКА A-5D1 выявляли АМГФ в клетках и просвете маточных желез. Количество желез, продуцирующих АМГФ, и интенсивность их иммуноокрашивания усиливались в гестационном промежутке 4-9 нед. Таким образом, полученные МКА реагируют с эндометриальным АМГФ после фиксации ткани формалином, заключения в парафин и рутинной гистологической обработки. Использование МКА A-5D1 не требует специальных способов фиксации и обработки тканей, что обусловливает возможность их широкого применения для иммуногистохимического исследования клинического материала.

Пример 2. Использование МКА, продуцируемых штаммом A-5D1, для ИГХ исследования органов мужской репродуктивной системы

Ткань семенных пузырьков для иммуногистохимического исследования была получена при аутопсии, проведенной не позднее 3 часов после внезапной смерти мужчины в возрасте 21 года. Обработку материала и иммуногистохимическую реакцию проводили, как описано в примере 1. На срезах семенных пузырьков МКА A-5D1 выявляли АМГФ в железах семенных пузырьков в виде интенсивного мелкозернистого окрашивания цитоплазмы эпителиальных клеток. Таким образом, МКА A-5D1, полученные с помощью иммунизации АМГФ, выделенным из амниотической жидкости (АМГФ-А), реагируют также с АМГФ, продуцируемым в мужском репродуктивном органе, т.е. со спермальным АМГФ (АМГФ-С). Это указывает на то, что МКА A-5D1 реагируют с белковой, а не с углеводной частью молекулы АМГФ и могут быть использованы для иммунодетекции АМГФ-С в клетках и тканях органов мужской репродуктивной системы, в отличие от МКА к гликоделину, полученными Eschke et al. (2006).

Пример 3. Использование МКА, продуцируемых штаммом A-5D1, для создания иммуноферментной тест-системы для количественного определения различных гликоформ АМГФ/гликоделина в биологических жидкостях.

Для масштабной наработки МКА штамм гибридных клеток A-5D1 культивировали в сингенных мышах Balb/c и получали асцитную жидкость. Из асцитной жидкости МКА A-5D1 выделяли высаливанием 50%-ным сульфатом аммония с последующей очисткой методом ионообменной хроматографии на колонках с ДЭАЭ-целлюлозой. МКА A-5D1 («ловушечные») сорбировали на дне плоскодонных 96-луночных полистироловых микропланшетов для иммуноферментного анализа (ИФА) из раствора 10 мкг/мл в карбонат-бикарбонатном буфере (рН 9.5), неспецифическое связывание блокировали 1%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина на фосфатно-солевом буфере (рН 7.4). Для выбора МКА, направленного против другого эпитопа молекулы АМГФ, панель АМГФ-специфических МКА конъюгировали с пероксидазой корня хрена и использовали в качестве детектирующих МКА при внесении в тест-систему с различными разведениями стандарта антигена в (1- 100 нг/мл). Использование МКА A-5D1 для иммобилизации на твердой фазе в сэндвич-варианте ИФА вместо прототипа МКА 4f8 повысило чувствительность тест-системы до 1 нг/мл. При внесении в тест-систему образцов сыворотки крови, амниотической и фолликулярной жидкости женщин, семенной жидкости мужчин МКА A-5D1 связывали различные гликоформы АМГФ, продуцируемые в органах мужской и женской репродуктивной системы, обеспечивая возможность их количественного определения в биологических жидкостях с высокой чувствительностью и специфичностью.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм A-5D1 получен путем слияния клеток мышиной миеломы линии SP2/0.Ag14 с лимфоцитами мышей линии Balb/c, иммунизированных введением в подушечки лап очищенного препарата АМГФ, выделенного из амниотической жидкости, и депонирован в коллекции перевиваемых культур клеток млекопитающих ГУ НИИ морфологии человека РАМН под номером 144/2002. Штамм гибридомы A-5D1 синтезирует моноклональные антитела (МКА) класса IgG1, специфически взаимодействующие в твердофазном иммуноферментном анализе и иммуногистохимическом анализе с изоформами АМГФ как эндометриального, так и спермального происхождения. МКА не дают перекрестных реакций с плацентарным α1-микроглобулином, трофобластическим β1-глобулином, хорионическим гонадотропином человека, α-фетопротеином, бычьим сывороточным альбумином, С-реактивным белком. МКА выявляют АМГФ/гликоделин в клетках и тканях женских и мужских органов репродукции. Использование МКА A-5D1 как иммунодиагностической системы позволяет проводить количественные определения изоформ АМГФ/гликоделина в биологических жидкостях с высокой чувствительностью (1 нг/мл) и специфичностью.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., депонированный в коллекции перевиваемых культур клеток млекопитающих ГУ НИИ морфологии человека РАМН под номером 144/2002, - продуцент моноклональных антител против разных изоформ альфа2-микроглобулина фертильности (АМГФ) / гликоделина.