Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 2E1B5 - продуцент моноклонального антитела к рецептор-связывающему домену белка S вируса SARS-CoV-2 Российский патент 2022 года по МПК C12N5/16 A61K39/395 A61K39/42 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к гибридомной технологии, и касается получения моноклонального антитела (МКА) к рецептор-связывающему домену белка S вируса SARS-CoV-2 с помощью нового гибридного клона клеток (гибридомы) животных. Изобретение может быть использовано для создания диагностикумов и иммунохимических тест-систем для определения наличия вируса SARS-CoV-2 в биологических образцах или антител к белку S вируса SARS-CoV-2. Изобретение может быть использовано для создания лекарственных препаратов против вируса SARS-CoV-2.

Вирус SARS-CoV-2 относится к семейству Coronaviridae роду Betacoronavirus. Впервые вирус был выделен в конце 2019 в Ухане (Китай) [1]. 11 марта 2020 года распространение острой респираторной инфекции, вызываемой вирусом SARS-CoV-2, было признано ВОЗ пандемией [2]. К концу января 2021 года пандемия охватывает весь мир, число заболевших превышает 100 млн человек, более 2 млн умерли [3]. К наиболее распространенным симптомам COVID-19 относятся лихорадка, сухой кашель, утомляемость, утрата обоняния или вкусовых ощущений. У части пациентов инфекция SARS-CoV-2 сопровождается пневмонией, в том числе тяжелой. Инкубационный период в среднем от 2 до 6 суток [4].

Вирион SARS-COV-2 состоит из 4 структурных белков: S, М, Е, и N. N-белок связан с РНК вируса, формируя нуклеокапсид. 3 остальных белка формируют оболочку, при этом основную роль в заражении играет самый крупный из них - белок S, который связывается с клеточным рецептором АСЕ2. Белок S также является основной мишенью для нейтрализующих антител против вируса [5].

Плазма крови переболевших Covid-19 использовалась для терапии с начала эпидемии [6]. Моноклональные антитела, обладающие вируснейтрализующей активностью против SARS-CoV-2 также рассматриваются как кандидаты на роль противовирусных препаратов. Кроме того, МКА могут быть использованы в диагностических исследованиях для выявления антигена и специфических противовирусных антител.

Гибридомная технология получения моноклональных антител к вирусным инфекциям человека широко известна. Например, с использованием этой технологии были получены антитела к вирусу гепатита С [7], пандемическому вирусу гриппа A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)sw1 [8], против белков вируса Эболы [9, 10] и к другим патогенам.

В настоящее время существует несколько препаратов на основе моноклональных антител к белку S вируса SARS-CoV-2, находящихся в доклинических испытаниях. Используются с этой целью человеческие моноклональные антитела, полученные от переболевших Covid-19, например, P2C-1F11 [11], CB6-LALA [12], С002 [13], nAB сс12.1 [14], COVA1-18 [15], COV2-2196 [16] и мышиные антитела, например REGN-10987 [17]. Некоторые антитела к S белку SARS-CoV-1 также нейтрализуют вирус SARS-COV-2, например человеческие CR3022 [18], S309 [19], 47D11-H2L2 [20] и мышиные антитела Н014 [21]. Однако расширение арсенала МКА к антигенам вируса SARS-CoV-2 остается актуальной задачей.

Задача предлагаемого изобретения - создание стабильного штамма гибридного клона клеток, продуцирующего вируснейтрализующее МКА к рецептор-связывающему домену белка S вируса SARS-CoV-2, для последующего конструирования на их основе высокоспецифичных тест-систем для определения антигена вируса SARS-CoV-2 или антител к данному вирусу, а также для возможного использования данного МКА в качестве терапевтических препаратов для лечения заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2.

Технический результат изобретения заключается в создании моноклонального антитела (МКА) к рецептор-связывающему домену белка S вируса SARS-CoV-2 и расширении арсенала штаммов гибридом, продуцирующих МКА к антигенам вируса SARS-CoV-2.

Указанный технический результат достигается путем получения нового гибридного клона культивируемых клеток Mus museums 2Е1В5, являющегося продуцентом МКА к белку S вируса SARS-CoV-2. Полученное МКА обладает специфичностью и сродством к вируснейтрализующим эпитопам белка S, что, в свою очередь, дает возможность определять вирусный антиген в биологических жидкостях человека и животных. Нейтрализующие свойства МКА дают возможность рассматривать его в качестве кандидатного терапевтического препарата для профилактики и лечения Covid-19. Заявленный штамм депонирован в Коллекции перевиваемых клеточных культур федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, номер 01-1/21.

Гибридный клон культивируемых клеток Mus musculus 2Е1В5 характеризуется следующими свойствами.

Видовая принадлежность:

Mus musculus

Способ получения штамма:

Штамм получен путем слияния клеток мышиной миеломы Sp2/0-Ag-14 с клетками селезенки мышей линии Balb/c, иммунизированных введением внутрибрюшинно рекомбинантного рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2. Первая иммунизация - с полным адъювантом Фрейнда, вторая иммунизация - через 2 недели после первой, с неполным адъювантом Фрейнда, бустерная иммунизация через 2 недели после второй, за 3 суток до отбора спленоцитов, все иммунизации по 100,0 мкг белка/мышь. Селекцию гибридом проводят на питательной среде RPMI-1640 («Sigma», США) с добавлением HAT (Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine) Media Supplement (Hybri-Max®, «Sigma», США). Штамм синтезируют моноклональные антитела (МКА), специфически взаимодействующие в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА) с рецептор-связывающим доменом белка S вируса SARS-CoV-2.

Культуральные свойства штамма:

Гибридные клетки растут в виде суспензии in vitro или в виде асцитной опухоли в перитонеальной полости после введения сингенным мышам линии Balb/c.

Культивирование штамма in vitro:

В качестве ростовой среды используют среду RPMI-1640 («Sigma», США), содержащую 20% фетальной сыворотки теленка (ФСТ), 4,5 г/л глюкозы, 3 мМ глутамина, 0,2 ед./мл инсулина, 60 мкг/мл гентамицина. Клетки культивируют при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО₂. Для культивирования используют пластиковые планшеты или флаконы объемом 50 и 250 мл («Greiner», Германия). Характер роста - стационарная суспензия. Частота пассирования 2 суток. Кратность рассева 1:2-1:4.

Культивирование штамма в организме животного in vivo:

За 1 сутки до введения клеток гибридомы мышей линии Balb/c предварительно обрабатывают внутрибрюшинно неполным адъювантом Фрейнда («Sigma», США) в дозе 0,5 мл/животное. Далее праймированным животным вводят в брюшную полость гибридные клетки штамма в дозе 5-10×10⁶ клеток. Асцитные жидкости, содержащие МКА, получают через 7-15 суток после введения.

Биотехнологическая характеристика штамма (продуктивность):

- титр МКА в культуральной жидкости при выращивании in vitro - 1,5×10⁴ (в ИФА);

- титр МКА в асцитной жидкости при выращивании in vivo - 8×10⁵ (в ИФА).

Условия хранения и поддержания жизнеспособности штамма:

Штамм сохраняют посредством криоконсервации в жидком азоте. За 24 часа до замораживания клетки гибридомы пассируют с кратностью рассева 1:2. Осажденные центрифугированием (2000 об/мин, 10 мин) клетки суспендируют в криозащитной среде (90% ФСТ, 10% DMSO) и разливают по ампулам в концентрации 3-5 млн/мл, по 1,0 мл. Выдерживают 24 часа при минус 70°С, затем переносят в жидкий азот (минус 196°С).

Восстановление после размораживания:

Быстрое размораживание штамма проводят при 37°С. Гибридомные клетки разводят в 10 раз ростовой средой без сыворотки, осаждают центрифугированием при 2000 об/мин 10 минут и ресуспендируют в ростовой среде, содержащей 20% фетальной сыворотки теленка в концентрации 3-4×10⁵ клеток/см³. Жизнеспособность восстановленных клеток составляет 70-80% и устанавливается по дифференциальной окраске клеток с использованием 0,4% раствора трипанового синего, рН=7,2-7,3.

Стабильность штаммов:

Стабильность продуцирования антител гибридными клетками сохраняется на протяжении 70 пассажей в культуре клеток и 5 пассажей на мышах линии BALB/c.

Контаминация:

Бактерии и грибы в культурах не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на стандартные питательные среды (мясопептонный агар - для выявления бактерий и агар Сабуро - для грибов). Заражение микоплазмой не выявлено (тест-система Mycoplasma Stain Kit, «Flow Lab.»).

Кариотип гибридных клеток, модальное число хромосом не определяли.

Характеристика продуцируемых МКА к рецептор-связывающему домену белка S вируса SARS-CoV-2:

- мишень - рецептор-связывающий домен белка S вируса SARS-CoV-2;

- средняя константа взаимодействия для полученного МКА составляет 8,2е-9 ± 1,6е-9 М.

- Изотип продуцируемых иммуноглобулинов - IgG1 (ИФА, тест-система «Mouse-Hybridoma-Subtyping Kit» («Sigma», США).

Краткое описание чертежей.

На фигуре 1 представлен пример иммуноблоттинга с использованием МКА, полученного с помощью штамма 2Е1В5, демонстрирующий детекцию рецептор связывающего домена: 1 - отрицательный контроль (бычий сывоточный альбумин), 2 - маркер молекулярного веса, 3 -образец рецептор-связывающего домена белка S.

Изобретение иллюстрируется, но не ограничивается следующими.

Пример 1. Получение заявленного штамма гибридомы.

Мышей линии Balb/c массой 18-20 г, 3-кратно иммунизируют рекомбинантным рецептор-связывающим доменом белка S вируса SARS-CoV-2. Антиген получен в культуре клеток китайского хомячка СНО (Chinese hamster ovary). Интервал между иммунизациями составляет 2 недели. Животным вводят антиген внутрибрюшинно (100 мкг/мышь), с полным адъювантом Фрейнда (первая иммунизация) или с неполным адъвантом Фрейнда (вторая и третья иммунизации). Бустерная доза (100,0 мкг/мышь) вводится без адъюванта внутрибрюшинно за 3 суток до выделения селезенки.

Через 3 суток после введения бустерной дозы антигена получают суспензию клеток селезенки мыши стандартным методом в охлажденной ростовой среде без сыворотки.

Для слияния используют перевиваемую клеточную линию мышиной миеломы Sp2/0-Ag-14, дефектную по гену ГГФРТ, не продуцирующую собственные иммуноглобулины. Гибридизацию проводят по классическому методу Кёлера и Мильштейна. Суспензию клеток селезенки и миеломные клетки смешивают в соотношении 5:1 соответственно. После слияния клетки ресуспендируют в селективной среде с добавлением HAT, вносят в 96-луночные панели с фидерным слоем из перитонеальных макрофагов мышей (5×10⁶ кл/мл, по 50 мкл/лун) в концентрации 1,5×10⁵ клеток в лунку в объеме 0,1 мл. Панели с клетками инкубируют при 37°С в атмосфере 5% СО₂.

Замену среды в лунках с гибридомными клонами проводят каждые 2-3 суток, используя в течение 14 суток после слияния среду с HAT. Для селекции гибриды, продуцирующей МКА заданной специфичности, из лунок с растущими колониями отбирают культуральные жидкости. Когда клоны гибридных клеток занимают не менее 50% поверхности лунки их тестируют на наличие антител к рецептор-связывающему домену белка S вируса SARS-CoV-2 в твердофазном иммуноферментном анализе. Клоны, обнаружившие специфическую активность, реклонируют методом лимитирующих разведений в 96-луночных панелях с фидерным слоем из перитонеальных макрофагов мышей (5×10⁶ кл/мл, по 50 мкл/лун). Супернатанты из лунок, содержащих реклонированные гибридомы, снова тестируют на наличие антител и их специфичность.

Пример 2. Получение заявленного МКА.

Скрининг МКА заданной специфичности и иммунологической активности проводят методом непрямого ИФА. Для этого в лунки иммунологических микропланшетов («Greiner», Германия) вносят 0,1 мл антигена (рекомбинантный рецептор-связывающий домен белка S вируса SARS-CoV-2) в рабочем разведении в 0,1 М карбонат-бикарбонатном буфере, рН 9,5. Микропланшеты инкубируют 18 часов при 4°С. Свободные участки пластика блокируют 1% Top Block («Yuro», Швейцария) в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ). Инкубируют в течение 30 минут при 37°С и вносят в лунки 0,1 мл культуральной жидкости МКА в различных разведениях. Микропланшеты инкубируют 1 час при 37°С и добавляют пероксидазный конъюгат антител к IgG мыши («Sigma», США) в рабочем разведении. Инкубируют 1 час при 37°С. После каждого этапа, несвязавшиеся реагенты отмывают ФСБ с добавлением 0,1% Tween-20 (ФСБТ). В качестве хромогена используют тетраметилбензидин (ТМБ). Интенсивность окраски в лунках определяют после остановки реакции 1М H₂SO₄ на спектрофотометре iMark («Bio-rad», США) при длине волны 450 нм.

Клоны, проявившие специфическую активность к рецептор-связывающему домену белка S вируса SARS-CoV-2, реклонируют методом лимитирующих разведений в 96-луночных панелях с фидерным слоем из перитонеальных макрофагов мышей (5×10⁶ кл/мл, по 50 мкл/лун). Супернатанты из лунок, содержащих реклонированные гибридомы, снова тестируют на наличие антител и их специфичность. Положительные реклонированные гибридомы наращивают в культуральных флаконах увеличивающихся размеров (сначала 25 см³, затем 75 см³) («Greiner», Германия).

Выделение МКА из культуральных жидкостей (КЖ) осуществляют при помощи хроматографической системы АКТА START («GE Healthcare», Швеция) и колонки HiTrap Protein A HP 1,0 мл («GE Healthcare», Швеция), согласно протоколу фирмы производителя. Обессоливания и замену буфера в очищенном на первой стадии образце осуществляют при помощи хроматографической системы АКТА START («GE Healthcare», Швеция) и колонки HiTrap desalting 5 ml («GE Healthcare», Швеция), согласно протоколу фирмы производителя. После финальных стадий очистки, со 100,0 мл КЖ получают 10,0 мл препарата МКА с концентрацией 0,7 мг/мл. Выход очищенного МКА с КЖ составляет 70 мкг/мл.

Выделение иммуноглобулинов (Ig) класса G из асцитной жидкости (АЖ) проводят осаждением белков при помощи каприловой кислоты («Sigma», США). АЖ разводят 0,06 М ацетатным буфером, рН 4,0, добавляют каприловую кислоту (3,3 мкл/мл АЖ), инкубируют 30 мин при 20°С, центрифугируют. Супернатант фильтруют через PVDF-фильтр (0,45 мкм) и диализуют в течение суток против ФСБ. Затем добавляют насыщенный раствор сульфата аммония (до 50% насыщения), инкубируют 18 час. при 40°С, центрифугируют, осадок растворяют в ФСБ и обессоливают в колонках с полусухим Сефадексом G-25 Medium в ФСБ. Оптическую плотность растворов IgG измеряют на спектрофотометре («Eppendorf», Германия) при длине волны 280 нм. Концентрацию белка определяют по формуле:

C=D/1,4, где D - оптическая плотность, С - концентрация белка (мг/мл), 1,4 - оптическая плотность раствора IgG с концентрацией 1,0 мг/мл.

Характеристики полученного препарата представлены в таблице 1.

Пример 3. Использование МКА для детекции белка S методом иммуноблоттинга.

Образцы рецептор-связывающего домен белка S, полученные в примере 1, разделяют в 10-15% градиентном полиакриламидном геле (SDS-PAGE) при помощи оборудования Mini-Protein 3 cell apparatus («Bio-Rad», США). Далее образцы переносят на мембрану Hybond-P PVDF («GE Healthcare», США) при помощи оборудования Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell («Bio-Rad», США), согласно протоколу производителя. После переноса мембрану блокируют 5% раствором сухого обезжиренного молока на ФСБТ в течение часа при комнатной температуре. Затем в блокирующий раствор вносят МКА, полученные с использованием штамма 2Е1В5 до рабочей концентрации 1,0 мкг/мл и инкубируют мембрану в течение часа при 37°С, при слабом перемешивании. Отмывку мембраны от несвязавшихся антител проводят 5-кратно раствором ФСБТ. Затем инкубируют в блокирующем растворе с добавлением антимышиного конъюгата (1:2500) («Sigma», A9044-2ML) и инкубируют в течение часа при 37°С, при слабом перемешивании. После 5-кратной отмывки раствором ФСБТ, мембрану проявляют раствором люминесцентного субстрата (ECL) («GE Healthcare», США), согласно протоколу производителя. Результаты иммуноблоттинга детектируют при помощи системы Amersham Imager 600 («GE Healthcare», США), согласно инструкции производителя. Окрашивание с помощью полученного МКА позволяет детектировать рецептор-связывающий домен белка S вируса SARS-CoV-2 методом иммуноблоттинга. Пример результата иммуноблоттинга представлен на фиг. 1.

Пример 4. Определение средней константы взаимодействия МКА.

Константу взаимодействия полученного МКА с рецептор-связывающим доменом белка S, полученным в примере 1, определяют при помощи системы детекции молекулярных взаимодействий Octet Red 96 (ForteBio», США) с использованием сенсоров Ni-NTA (NTA) Dip and Read Biosensors («ForteBio», США), согласно рекомендациям производителя. Рецептор-связывающий домен белка S сорбируют на указанные выше сенсоры в однократном кинетическом буфере («ForteBio», США) в концентрации 25 мкг/мл. Связывание МКА с пресорбированным на сенсорах антигеном, осуществляют также в однократном кинетическом буфере («ForteBio», США) в концентрациях 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625, 0.78 и 0 мкг/мл соответственно. Базовую линию и диссоциацию антитела с антигеном измеряют также в однократном кинетическом буфере («ForteBio», США), согласно рекомендациям производителя. Программное обеспечение Data Analysis 10.0 используют для вычисления константы взаимодействия МКА с рецептор-связывающим доменом белка S.

В результате неоднократных измерений была вычислена средняя константа взаимодействия (KD)=8,2×10^-9±1,6×10^-9 М.

Пример 5. Оценка вируснейтрализующих свойств полученного МКА.

Реакцию нейтрализации выполняют микрометодом [22] в 96-луночных планшетах («Costar», США) на перевиваемой культуре клеток Vero Е6, выращенной на среде Игла с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки. Поддерживающая среда содержит 1% эмбриональной телячьей сыворотки.

Титр вируса (штамм SARS-CoV-2: PMVL-12, номер депонирования EPI_ISL_572398 в базе Gisaid) определяют методом конечных разведений путем параллельного титрования с шагом 10 в рядах планшета, начиная с разведения вируса 1×10^-1 и до 1×10^-8. За титр вируса принимают последнее разведение, в котором отмечено цитопатогенное действие (ЦПД). Количество 50% цитопатических доз (ЦПД₅₀) высчитывают по классическому методу Рида и Менча.

Антитело в реакции нейтрализации испытывают против 100 ЦПД₅₀ доз вируса в 0,1 мл. Антитело титруют, начиная с концентрации 125 мкг/мл до 0,014 нг/мл.

Результаты реакции учитывают на 3, 5 и 7 сутки после заражения клеток, просматривая лунки планшета в инвертируемом микроскопе. За титр (концентрацию) антител принимают наибольшее разведение, при котором обеспечивалась защита культуры от 100 ЦПД₅₀ вируса (т.е. ЦПД не развивается). Опыты нейтрализации сопровождаются контролем рабочей дозы вирусов, токсичности, стерильности и защитной активности положительных специфических сывороток (от переболевших COVID-19 людей).

Выявлено что моноклональные антитела, продуцируемые штаммом 2Е1В5, обладают нейтрализующей активностью (122 нг антител нейтрализуют 1000 цитопатических доз вируса SARS-CoV-2 в 1,0 мл).

Т.о., созданная гибридома 2Е1В5 синтезирует моноклональное антитело (МКА) класса IgG1, которое специфически взаимодействуют в ИФА с рекомбинантным рецептор-связывающим доменом белка S вируса SARS-CoV-2, полноразмерным белком S вируса SARS-CoV-2 и инактивированным вирусом SARS-CoV-2. Полученное МКА обладает вируснейтрализующей активностью и способно нейтрализовать вирус SARS-CoV-2 в тестах in vitro.

Изобретение может быть использовано для создания диагностикумов и иммунохимических тест-систем для определения наличия вируса SARS-CoV-2 в биологических образцах или для выявления антител к белку S вируса SARS-CoV-2. Нейтрализующие свойства полученного МКА дают возможность рассматривать его в качестве кандидатного терапевтического препарата для профилактики и лечения Covid-19.

Источники информации

1. Hui DS, Azhar EI, Madani ТА, Ntoumi F, Kock R, Dar O, et al. The continuing 2019-nCoV epidemic threat of novel coronaviruses to global health - The latest 2019 novel coronavirus outbreak in Wuhan, China. Int J Infect Dis. 2020; 91:264-6. https://doi.org/10.1016/j.ijid.2020.01.009.

2. WHO Director-General's opening remarks at the media briefing on COVID-19 - 11 March 2020 (https://www.who.int/ru/director-general/speeches/detail/who-director-general-s-opening-remarks-at-the-media-briefing-on-covid-19--- 11 -march-2020).

3. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center, COVID-19 map - Johns Hopkins coronavirus resource center, Johns Hopkins COVID-19 Rescent (2021).

4. C. Huang, Y. Wang, X. Li, L. Ren, J. Zhao, Y. Hu, et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, ChinaLancet, 395 (2020), pp.497-506, 10.1016/S0140-6736(20)30183-5.

5. Juan P. Jaworski, Neutralizing monoclonal antibodies for COVID-19 treatment and prevention, Biomedical Journal, 2020, ISSN 2319-4170, https://doi.Org/10.1016/j.bj.2020.11.011.

6. Duan, Kai et al. "Effectiveness of convalescent plasma therapy in severe COVID-19 patients." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America vol. 117,17 (2020): 9490-9496. doi:10.1073/pnas.2004168117.

7. Патент RU №2006 127 947 Моноклональные антитела, иммунореактивные с белком нуклеокапсида (кор) вируса гепатита С-4G5, способ диагностики - сэндвич-вариант иммуноферментного количественного анализа для детекции нуклеокапсида вируса гепатита С и комбинация моноклональных антител, включающая МКА 4G5, для его осуществления./ Авторы: Масалова О.В. и др., заявка №2006127947/13, приоритет 2006.08.02.

8. Патент RU №2457243 Штамм гибридных культивируемых клеток мыши Mus. Musculus - 1Е7, продуцирующий моноклональное антитело, иммунореактивное с белком гемагглютинина пандемического вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)sw1./ Авторы: Климова P.P. и др., заявка №2011100099, приоритет 11.01.2011.

9. Патент RU №2 395 576 Штамм гибридных клеток животного Mus musculus L.1b2 - продуцент моноклональных антител для выявления нуклеопротеина вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga) (варианты), моноклональное антитело, продуцируемое штаммом (варианты), набор для иммуноферментной тест-системы формата "сэндвич" для выявления нуклеопротеина Эбола, субтип Заир (штамм Mainga)./Авторы: Казачинская Е.И. и др., заявка №2008149653/13, приоритет 2008.12.16.

10. Патент RU №2 2 686 630 Штаммы гибридных клеток животных Mus. Musculus - продуценты моноклональных антител к белку GP вируса Эбола (subtype Zaire) и моноклональные антитела к белку GP вируса Эбола (subtype Zaire)./Авторы: Козлов А.Ю. и др., заявка №2017145321, приоритет 2017.12.22.

11. B. Ju, Q. Zhang, J. Ge, R. Wang, J. Sun, X. Ge, et al. Human neutralizing antibodies elicited by SARS-CoV-2 infection Nature (2020), pp.1-8, 10.1038/s41586-020-2380-z.

12. R. Shi, C. Shan, X. Duan, Z. Chen, P. Liu, J. Song, et al. A human neutralizing antibody targets the receptor-binding site of SARS-CoV-2 Nature (2020), pp.1-8, 10.1038/s41586-020-2381-y.

13. C.O. Barnes, A.P. West, K.E. Huey-Tubman, M.A.G. Hoffmann, N.G. Sharaf, P.R. Hoffman, et al. Structures of human antibodies bound to SARS-CoV-2 spike reveal common epitopes and recurrent features of antibodies Cell (2020), 10.1016/j.cell.2020.06.025.

14. T.F. Rogers, F. Zhao, D. Huang, N. Beutler, A. Burns, W.-T. He, et al. Isolation of potent SARS-CoV-2 neutralizing antibodies and protection from disease in a small animal model.

15. P.J.M. Brouwer, T.G. Caniels, K. van der Straten, J.L. Snitselaar, Y. Aldon, S. Bangaru, et al. Potent neutralizing antibodies from COVID-19 patients define multiple targets of vulnerability Science (80-) (2020), Article eabc5902, 10.1126/science.abc5902.

16. S.J. Zost, P. Gilchuk, R.E. Chen, J.B. Case, J.X. Reidy, A. Trivette, et al. Rapid isolation and profiling of a diverse panel of human monoclonal antibodies targeting the SARS-CoV-2 spike protein Nat Med (2020), pp.1-6, 10.1038/s41591-020-0998-x.

17. J. Hansen, A. Baum, K.E. Pascal, V. Russo, S. Giordano, E. Wloga, et al. Studies in humanized mice and convalescent humans yield a SARS-CoV-2 antibody cocktail Science (80-) (2020), Article eabd0827, 10.1126/science.abd0827.

18. J. ter Meulen, E.N. van den Brink, L.L.M. Poon, W.E. Marissen, C.S.W. Leung, F. Cox, et al. Human monoclonal antibody combination against SARS coronavirus: synergy and coverage of escape mutants PLoS Med, 3 (2006), p.e237, 10.1371/journal.pmed.0030237.

19. D. Pinto, Y.-J. Park, M. Beltramello, A.C. Walls, M.A. Tortorici, S. Bianchi, et al. Cross-neutralization of SARS-CoV-2 by a human monoclonal SARS-CoV antibody Nature, 583 (2020), pp. 290-295, 10.1038/s41586-020-2349-y.

20. C. Wang, W. Li, D. Drabek, N.M.A. Okba, R. van Haperen, A.D.M.E. Osterhaus, et al. A human monoclonal antibody blocking SARS-CoV-2 infection Nat Commun, 11 (2020), p.2251, 10.1038/s41467-020-16256-y.

21. Z. Lv, Y.-Q. Deng, Q. Ye, L. Cao, C.-Y. Sun, C. Fan, et al. Structural basis for neutralization of SARS-CoV-2 and SARS-CoV by a potent therapeutic antibody Science (80-) (2020), p.5881, 10.1126/science.abc5881.

22. An In Vitro Microneutralization Assay for SARS-CoV-2 Serology and Drug Screening // Fatima Amanat Kris M. White Lisa Miorin Shirin Strohmeier Meagan McMahon Philip Meade Wen-Chun Liu Randy A. Albrecht Viviana Simon Luis Martinez-Sobrido Thomas Moran Adolfo Florian Krammer / Current Protocols in Microbiology Volume 58, Issue 1 September 2020, p. 1-15.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к штамму гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 2Е1В5. Гибридный клон клеток 2Е1В5 был получен путем слияния клеток мышиной миеломы линии Sp2/0-Ag-14 со спленоцитами мышей линии Balb/c, иммунизированных внутримышечно рекомбинантным рецептор-связывающим доменом белка S вируса SARS-CoV-2. Гибридома 2Е1В5 синтезирует моноклональное антитело класса IgG1, которое специфически взаимодействует с рекомбинантным рецептор-связывающим доменом белка S вируса SARS-CoV-2, полноразмерным белком S вируса SARS-CoV-2 и инактивированным вирусом SARS-CoV-2. Антитело обладает вируснейтрализующей активностью и способно нейтрализовать вирус SARS-CoV-2 in vitro. Полученное антитело может быть использовано в диагностических исследованиях для выявления антигена и специфических противовирусных антител, а также для создания лекарственных средств против вируса SARS-CoV-2. Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал средств для получения моноклональных антител к белку S вируса SARS-CoV-2. 1 ил., 1 табл., 5 пр.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 2Е1В5, депонированный в Коллекции перевиваемых клеточных культур ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, номер 01-1/21, - продуцент моноклонального антитела к рецептор-связывающему домену белка S вируса SARS-CoV-2, имеющего среднюю константу взаимодействия 8,2×10^-9± 1,6×10^-9 М, относящегося к изотипу IgG1, способного специфично взаимодействовать с рекомбинантным рецептор-связывающим доменом белка S вируса SARS-CoV-2, полноразмерным белком S вируса SARS-CoV-2, инактивированным вирусом SARS-CoV-2, обладающего вируснейтрализующей активностью и способного нейтрализовать вирус SARS-CoV-2 in vitro, 122 нг которого нейтрализуют 1000 цитопатических доз вируса SARS-CoV-2 в 1,0 мл.