РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pPHOFus, КОДИРУЮЩАЯ СУБСТРАТ ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ, СЛИТЫЙ СО ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗОЙ Escherichia coli, И ШТАММ Escherichia coli BL-PHOFus, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ БЕЛОК - СУБСТРАТ ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ В СОСТАВЕ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ Escherichia coli Российский патент 2011 года по МПК C12N1/21 C12N15/63 C12N15/70 C12Q1/42 

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно - к областям биохимии, генной инженерии и разработки искусственных репортерных биомолекул, касается создания нового субстрата для высокочувствительной детекции каталитически активного белка летального фактора сибирской язвы (LF) и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, определяющую синтез субстрата LF в составе одного полипептида с мутированным репортерным ферментом щелочной фосфатазой Escherichia coli, штамм бактерий Е. coli, продуцирующий репортерный рекомбинантный белок на основе модифицированной щелочной фосфатазы Е. coli, имеющий в своем составе субстрат для детекции протеолитической активности LF.

Основной областью применения разработанного белка-субстрата летального фактора сибирской язвы, слитого с репортерным ферментом щелочной фосфатазой, являются биологические исследования, биомедицина и разработка лекарств, в частности разработка средств быстрой и высокоэффективной специфической диагностики для раннего определения вирулентного возбудителя сибирской язвы, а также фармацевтических препаратов для терапии сибиреязвенной инфекции и вакцинации против сибирской язвы.

Сибирская язва - это инфекционное заболевание, вызываемое токсигенными штаммами грамположительной бактерии Bacillus anthracis. Вирулентность бактерии определяется капсулой, состоящей из поли-D-глютаминовой кислоты, и экзотоксином, включающим в себя три компонента - летальный фактор (LF), протективный антиген (РА) и фактор отечности (EF). По отдельности эти белки не обладают токсическим эффектом, но комбинации LF+PA (летальный токсин) и EF+PA (токсин отечности) приводят к различным патологическим последствиям как у млекопитающих и человека, так и в культуре клеток. Функционально LF сибирской язвы представляет собой Zn²⁺-зависимую металлопротеазу, специфически расщепляющую белки семейства митоген-активируемых протеинкиназ MAPKK (в частности, MEK1), приводя к лизису клеток, подвергшихся действию токсина под воздействием макрофагов. Проводились исследования ферментативной активности LF, его субстратной специфичности, его трехмерной структуры. Было продемонстрировано, что летальный фактор сибирской язвы (LF) наряду с протективным антигеном (РА) представляет собой важнейший компонент летального токсина сибирской язвы и является основным фактором, определяющим летальный исход при сибиреязвенной инфекции (Young JA, Collier RJ (2007) Annu Rev Biochem, 76, 243-265).

Известны коммерчески доступные пептидные специфические субстраты LF, применяемые для детекции протеолитической активности LF, базирующиеся на классических способах детекции протеолитической активности на основе хромогенных и флюорогенных групп, введенных в состав субстрата (Merck, каталожные номера 176902, 176904, 176903). Общими недостатками всех коммерческих субстратов LF являются их высокая стоимость при использовании этих субстратов для нужд широкоформатного скрининга и целей клинической диагностики, а также низкая чувствительность. Чувствительность флюоресцентных субстратов LF выше, чем колориметрических (детектируют до 5-10 пМ LF), но она не достаточна для обнаружения инфекции на достаточно ранних стадиях заражения сибирской язвой с целью проведения своевременной терапии.

Известны субстраты LF на основе белкового или пептидного FRET (резонансного переноса энергии Форстера) (Cummings RT, Salowe SP, Cunningham BR, Wiltsie J, Park YW, Sonatore LM, Wisniewski D, Douglas CM, Hermes JD, Scolnick EM. (2002) Proc Natl Acad Sci USA, 99, 6603-6603). Они также имеют достаточно низкую чувствительность, прежде всего в силу длины пептидного субстрата LF, превышающей эффективную область радиуса Форстера для большинства красителей и ограничивающей тем самым эффективность FRET. Кроме того, невысокая каталитическая эффективность расщепления известных субстратов LF в еще большей степени снижает общую чувствительность прямого определения активности LF методом FRET.

Известен наиболее идеологически и технически близкий к заявленному субстрат, разработанный компанией Quickzyme (http://www.tno.co.jp/Pharma/Protease_111a.pdf), базирующийся на амплификации сигнала на основе активации урокиназы. Разработанный субстрат обеспечивает в 1000 раз большую чувствительность, чем детекция летального фактора при помощи FRET с использованием флюорогенных пептидных субстратов. Недостатками этого субстрата являются необходимость дорогостоящей продукции белковых компонентов системы в эукариотических клетках, а также относительно невысокая скорость работы этой протеазы, снижающая общую чувствительность метода. Кроме того, урокиназа не полностью ингибирована в нерасщепленном состоянии и может спонтанно активироваться при хранении или под действием другой, чем LF протеазы. Длина и аминокислотный состав пептида, встраиваемого в N-концевую область урокиназы, весьма ограничены; пептиды с увеличенной длиной или повышенной гидрофобностью, а также со значительным положительным зарядом (что характерно для высокоэффективных субстратов LF) могут нарушить фолдинг и активацию урокиназы и ее зимогена. В отличие от урокиназы щелочная фосфатаза позволяет помещать в составе своего N-концевого домена такие протяженные, сложные в фолдинге и вариабельные по аминокислотному составу структуры, как одноцепочечное антитело.

Изобретение решает задачу разработки эффективного субстрата летального фактора сибирской язвы с высокой чувствительностью и специфичностью к расщеплению LF, большим выходом продукта и низкой себестоимостью процесса получения и очистки субстрата, применяемого для нужд клинической диагностики сибиреязвенной инфекции и широкоформатного скрининга при поиске химических ингибиторов активности летального фактора сибирской язвы с целью разработки новых терапевтических препаратов против сибирской язвы.

Поставленная задача решается конструированием рекомбинантного слитного белка на основе модифицированной щелочной фосфатазы Е. coli, который продуцируется с применением экспрессионной конструкции в составе вектора pPHOFus, состоящего из NdeI-XhoI фрагмента ДНК плазмиды pET22b(+); лидерного пептида щелочной фосфатазы Е. coli; первых 6 аминокислотных остатков зрелой щелочной фосфатазы; пептида NPGGLNDIFEAQKIEWHED, содержащего сайт для специфического биотинилирования остатка лизина-13 в составе этого пептида ферментом биотин-лигаза из Е. coli; спейсерного пептида; высокоэффективного субстратного пептида для LF RRKKVYPYPME; домена, содержащего активный центр фосфатазы, модифицированный внесением мутаций D153G и D330N, повышающих каталитическую эффективность фосфатазы более чем в 30 раз; последовательности шести гистидинов для эффективной очистки белка металл-хелатной хроматографией.

Также задача решается за счет штамма-продуцента Е. coli BL-PHOFus, продуцирующего слитный репортерный субстрат LF на основе щелочной фосфатазы.

Техническим результатом изобретения является получение в очищенном виде и с высоким выходом (до 95% чистоты, до 30 мг с литра культуры) гомогенного рекомбинантного белка высокочувствительного и специфичного субстрата летального фактора сибирской язвы, способного детектировать протеолитическую активность летального фактора сибирской язвы в концентрации до 1 пМ.

В предлагаемом техническом решении с целью повышения уровня чувствительности и специфичности детекции LF в состав слитного белкового субстрата введен каталитически активный белок, щелочная фосфатаза E. coli, которая выступает в качестве репортерного фермента для амплификации сигнала от акта разрезания субстрата летального фактора.

Щелочная фосфатаза Е. coli является секретируемым белком с молекулярной массой 94 кДа. Щелочная фосфатаза секретируется в периплазматическое пространство между клеточной стенкой и плазматической мембраной бактерии и содержит дисульфидные связи. При экспрессии в цитоплазму большая часть фермента растворима, но неактивна. Было показано, что N-концевая область полипептида щелочной фосфатазы в районе 20-30-го аминокислотного остатка не является существенной для каталитической активности и может быть разделена на различные домены путем внесения в эту область пептидного или белкового линкера длиной от 1 до 300-400 аминокислотных остатков (Kopetzki Е, Lehnert K, Buckel P. (1994) Clin Chem, 40, 688-704). Эффективность работы щелочной фосфатазы можно существенно повысить внесением в ее последовательность точечных мутаций D153G и D330N (Muller BH, Lamoure С, Le Du MH, Cattolico L, Lajeunesse Е, Lemaitre F, Pearson A, Ducancel F, Menez A, Boulain J-C. (2001) ChemBioChem, 2, 517-523). Щелочная фосфатаза является достаточно стабильным белком, устойчивым к изменениям pH и температуры. Все эти особенности, наряду с наличием высокочувствительных коммерчески доступных дешевых субстратов щелочной фосфатазы E. coli, обосновывает выбор ее в качестве репортерного фермента для амплификации сигнала от акта расщепления субстрата летальным фактором.

В состав слитного белкового субстрата LF введена аминокислотная последовательность NPGGLNDIFEAQKIEWHED для биотинилирования бактериальным ферментом биотин-лигазой E. coli, которое возможно проводить как in vivo, так и in vitro. Биотинилирование слитного белкового субстрата LF делает возможной иммобилизацию субстрата на планшетах за счет взаимодействия с авидином и его производными, что позволяет проводить детекцию активности LF в твердофазном формате.

Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli BL-PHOFus характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, неспороносные, грамотрицательные.

Культуральные признаки. Бактериальные клетки хорошо растут на простых питательных средах. При выращивании на агаре образуют круглые, мутные желто-серые колонии со слегка неровным краем, диаметром до 3 мм. При росте на жидких средах (LB, 2xYT) образуют интенсивную муть.

Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4 до 40°С при оптимуме 37°С и оптимальных значениях pH от 7 до 7.5. В качестве источника углерода используют аминокислоты, углеводы, глицерин. В качестве источника азота могут использовать как органические соединения (аминокислоты, дрожжевой экстракт, триптон и др), так и неорганические минеральные соли в аммонийной форме.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к антибиотикам пенициллинового ряда (до 200 мкг/мл).

Штамм-продуцент получают путем трансформации компетентных клеток E. coli соответствующей рекомбинантной плазмидной ДНК.

Штамм BL-PHOFus является суперпродуцентом. При индукции изпропилтио-β-галактозидом происходит эффективный синтез целевого белка субстрата LF, слитого в единый полипептид с репортерным ферментом щелочной фосфатазой, содержащего последовательность для in vivo и in vitro биотилинирования биотин-лигазой E. coli, который накапливается в периплазматическом пространстве клеток в растворимом состоянии и составляет до 30% суммарного белка клетки.

Изобретение осуществляют следующим образом.

Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pPHOFus на основе коммерчески доступной плазмиды pET22b(+) (Novagen). Ген щелочной фосфатазы E. coli получают прямым ПЦР с генома E. coli. Праймеры, используемые для ПЦР-амплификации, содержат сайты эндонуклеаз рестрикции NdeI (N-конец гена, праймер PhoAForNdeI) и XhoI (С-конец гена, праймер PhoARevXhoI). Полученную ДНК фосфорилируют и затем лигируют с расщепленной по сайту PvuII и очищенной элюцией из агарозного геля векторной плазмидной ДНК pBluescript (Stratagene). Мутации D153G и D330N последовательно вносят в ДНК щелочной фосфатазы сайт-специфическим ПЦР-мутагенезом с использованием праймеров D330NFor/D330NRev и D153GFor/D153GFor с последующей очисткой из агарозного геля и дотированием ПЦР-продуктов. В последовательность щелочной фосфатазы ПЦР-мутагензом с праймеров PhoAMDRSmaI/PhoAMDFSalI вносят сайты эндонуклеаз рестрикции SmaI и SalI, необходимые для дальнейшего конструирования. Полученный мутированный ДНК-фрагмент щелочной фосфатазы клонируют в плазмиду pET22b(+) (Novagen) по сайтам эндонуклеаз рестрикции NdeI и XhoI.

Фрагмент ДНК, кодирующий in vivo биотинилирующийся пептид и пептидный субстрат летального фактора сибирской язвы RRKKVYPYPME, получают отжигом праймеров BioLFSuFor/BioLFSuRev, содержащих на концах сайты эндонуклеаз рестрикции Smal и Sall, с последующей достройкой концов продукта отжига фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I. Фрагмент обрабатывают эндонуклеазами рестрикции SmaI и SalI, очищают в полиакриламидом геле и клонируют в плазмиду, полученную на основе pET22b(+), содержащую фрагмент ДНК, кодирующий мутантную фосфатазу. Корректность собранной конструкции pPHOFus подтверждают секвенированием плазмидной ДНК. Последовательности праймеров, использованных при конструировании плазмиды pPHOFus, представлены на фиг.1. Полная последовательность экспрессионной конструкции слитного репортерного субстрата LF в составе плазмиды pPHOFus представлена на фиг.2.

Для получения штамма BL-PHOFus, продуцирующего слитный репортерный субстрат LF, рекомбинантную плазмидную ДНК трансформируют в компетентные клетки штамма E. coli BL21(DE3), полученные клоны анализируют на уровень экспрессии целевого белка и отбирают штаммы-продуценты.

Штамм-продуцент E. coli BL-PHOFus выращивают на богатой среде (2xYT, Terrific Broth и др.) до достижения оптической плотности культуры 0.6-1.2 ОЕ и индуцируют продукцию белка добавлением 0.005 мМ изопропилтио-β-D-галактозида. Экспрессию проводят 6 часов при температуре 25°С.

Клетки из экспрессионной культуры собирают центрифугированием, суспендируют в буфере, содержащем 30 мМ трис-HCl pH 8, 20% сорбитола и 20 мкг/мл лизоцима, дополненном протеазным ингибитором (Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail, Roches) и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут. Клеточную суспензию центрифугируют 20 минут при 18000 g и супернатант, представляющий собой периплазматическую фракцию белков, наносят на металл-хелатную колонку (Talon, Clontech) в буферном растворе, содержащем 20 мМ трис-HCl pH 8 и 100 мМ NaCl. Элюцию осуществляют раствором 200 мМ имидазола на том же буфере (pH 8).

Для биотинилирования субстрата фракции, содержащие белок слитного субстрата LF, диализуют против буфера, содержащего 30 мМ трис-HCl рН 8.3 и 10 мМ MgCl₂, добавляют АТФ до концентрации 5 мМ и биотин до концентрации 1 мМ и инкубируют с биотин-лигазой BirA (www.avidity.com) при 30°С в течение 30 минут. Реакционную смесь наносят на гель-фильтрационную колонку Superdex 75 (Pharmacia) в буфере, содержащем 20 мМ Трис-HCl pH 8, 50 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 0.1 mM ZnCl₂ 10% глицерин. Чистоту полученного препарата белка слитного субстрата LF определяют денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле и препарат замораживают в аликвотах для хранения на -70°С. Типичные результаты электрофоретического анализа полученных гель-фильтрационных фракций представлены на фиг.3. Прохождение реакции биотинилирования субстрата проверяют иммуноблотом с использованием нейтравидин-пероксидазы.

Активность щелочной фосфатазы в составе слитного рекомбинантного субстрата летального фактора сибирской язвы определяют с использованием специфических колориметрических или флюоресцентных субстратов для щелочной фосфатазы, таких как пара-нитрофенилфосфат (pNPP), флюоресцеин-дифосфат, 9Н-(1,3 дихлоро-9,9-диметилакридин-2-один-7-ил) фосфат (DDAO фосфата), 6,8-дифлюоро-4-метил умбеллиферилфосфат (DiFMUP), 4-метилумбеллиферил фосфата (MUP) и их производных (http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp02999.pdf). Чувствительность слитного репортерного субстрата LF к расщеплению летальным фактором сибирской язвы измеряют по уровню активности щелочной фосфатазы, высвободившейся в раствор в результате расщепления субстрата, связанного за счет биотина с иммобилизованным на иммунологическом планшете нейтравидином. Результаты типичного экперимента по определению чувствительности субстрата к различным концентрациям LF приведены на фиг.4. Слитный репортерный субстрат на основе щелочной фосфатазы позволяет детектировать летальный фактор сибирской язвы в концентрации до 1 пМ.

Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:

Фиг.1. Последовательности праймеров, использованных при получении экспрессионной конструкции для продукции слитного репортерного субстрата LF на основе щелочной фосфатазы.

Фиг.2. Структура и последовательность экспрессионной конструкции для продукции слитного репортерного субстрата LF на основе щелочной фосфатазы.

Фиг.3. Результаты гель-фильтрации очищенного и биотинилированного слитного репортерного субстрата LF на основе щелочной фосфатазы, продуцируемого клетками штамма BL-PHOFus.

Фиг.4. Чувствительность слитного репортерного субстрата LF на основе щелочной фосфатазы к расщеплению летальным фактором сибирской язвы.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1.

Конструирование плазмиды pETPHOFus, содержащей экспрессионную конструкцию слитного репортерного субстрата LF на основе щелочной фосфатазы.

Выделяют геномную ДНК E. coli штамма BL21 (DE3). Для этого бактериальные клетки из 5 мл жидкой ночной культуры осаждают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут, суспендируют клетки в 200 мкл буфера, содержащего 50 мМ трис-HCl pH 7.5, 10 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, в течение 15 минут при 0°С обрабатывают лизоцимом в конечной концентрации 10 мкг/мл, лизируют клетки добавлением двух объемов раствора, содержащего 0.2 М NaOH и 1% додецилсульфата натрия, и трижды обрабатывают смесью фенол-хлороформ (1:1) с последующим центрифугированием при 12000 g и отбором водной фазы. К водной фазе добавляют 1/10 объема 3 М ацетата натрия pH 5.2 и осаждают нуклеиновые кислоты 2.5 объемами этанола. Осадок после центрифугирования при 12000 g растворяют в 100 мкл бидистиллированной стерильной воды.

Фрагмент гена щелочной фосфатазы получают прямым ПЦР с геномной ДНК с использованием праймеров PhoAForNdeI и PhoAXhoI. Реакцию амплификации проводят по стандартному протоколу с применением Pwo полимеразы (Roche) с использованием буфера, рекомендованного производителем. Количество каждого праймера в реакции амплификации составляет 20 пМ, в качестве матрицы добавляют 0.1 мкг геномной ДНК. Температура отжига праймеров устанавливается как 56°С, на фазу элонгации фрагмента ДНК отводится 1 мин.

Полученный фрагмент ДНК фосфорилируют с применением киназы фага Т4 (USB) согласно стандартному протоколу. Фрагмент очищают в агарозном геле и клонируют в плазмиду pBluescript SKII(-) (Stratagene), расщепленную по сайтам эндонуклеазы рестрикции PvuII в стандартных условиях и очищенную элюцией из агарозного геля. Положительные клоны идентифицируют по появлению фрагмента на агарозном геле при обработке эндонуклеазами рестрикции NdeI и XhoI. Из положительных по наличию фрагмента гена щелочной фосфатазы клонов выделяют плазмидную ДНК стандартным методом щелочного лизиса.

Для внесения мутаций, обеспечивающих аминокислотные замены D153G и D330N, с полученной плазмидной ДНК D153G и D330N проводят ПЦР-амплификацию с использованием пар праймеров D330NFor/D330NRev и D153GFor/D153GFor и смеси полимераз Pwo (Roche) и Taq (Fermentas). При проведении ПЦР используют по 30 пМ каждого из соответствующей пары праймеров, температура отжига праймеров составляет 54°С, время элонгации фрагмента устанавливается как 3 минуты. Фрагменты, полученные в результате ПЦР-амплификации, фосфорилируют по стандартному протоколу с использованием киназы фага Т4 и очищают в агарозном геле. Лигируют очищенный фрагмент согласно типовому протоколу для ДНК-лигазы (Fermentas) и продуктами реакции трансформируют электрокомпетентные клетки E. coli штамма DH12S. Отбор положительных клонов проводят рестриктным картированием по возникновению в последовательности гена щелочной фосфатазы сайтов эндонуклеаз рестрикции, находящихся в составе праймеров для мутагенеза (сайт NheI при внесении мутации D330N и сайт PstI при внесении мутации D153G). Корректность внесения мутаций подтверждают секвенированием. Аналогичным образом с использованием тех же экспериментальных протоколов и пары праймеров PhoAMDRSmaI/PhoAMDFSalI в последовательность щелочной фосфатазы вносят сайты эндонуклеаз рестрикции SmaI и SalI, необходимые для дальнейшего конструирования. ДНК плазмид, содержащих мутированный ген щелочной фосфатазы, расщепляют по сайтам NdeI и XhoI и фрагмент, соответствующий гену фосфатазы, вьщеляют элюцией из агарозного геля.

2 мкг ДНК коммерчески доступной плазмиды pET22b(+) обрабатывают эндонуклеазами рестрикции XhoI и NdeI (Fermentas) согласно протоколу производителя, очищают элюцией из агарозного геля и клонируют в полученный вектор мутированный фрагмент гена щелочной фосфатазы.

Фрагмент ДНК, кодирующий in vivo биотинилирующийся пептид NPGGLNDIFEAQKIEWHED и пептидный субстрат летального фактора сибирской язвы RRKKVYPYPME, получают отжигом при температуре 55°С эквимолярного количества (по 30 пМ) праймеров BioLFSuFor/BioLFSuRev, содержащих на концах сайты эндонуклеаз рестрикции SmaI и SalI, с последующей достройкой концов продукта отжига фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I (USB) согласно протоколу производителя. Достроенный фрагмент обрабатывают эндонуклеазами рестрикции SmaI и SalI в стандартных условиях, очищают в полиакриламидом геле и клонируют в плазмиду, полученную на основе pET22b(+), содержащую фрагмент ДНК, кодирующий мутантную фосфатазу. Правильность встраивания фрагмента в плазмиду подтверждают секвенированием плазмидной ДНК.

Пример 2.

Получение штамма BL-PHOFus и продукция белка слитного репортерного субстрата LF на основе щелочной фосфатазы.

Экспрессионный штамм BL-PHOFus получают электротрансформацией (прибор ВТХ 600, режим 129 Ом, 2,5 кB) электрокомпетентных клеток E. coli BL21(DE3) плазмидой pPHOFus. Трансформанты высевают на чашки с 2xYT-aгapoм, содержащим 50 мкг/мл ампициллина и 2% глюкозы и выращивают в течение ночи при 37°С.

Единичные клоны BL-PHOFus экспрессируют в аналитическом количестве (в 5 мл среды 2xYT) согласно протоколу, описанному для препаративной экспрессии, и анализируют уровень экспрессии слитного белка репортерного субстрата LF денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле. Для проведения электрофореза равные аликвоты клеток разных клонов центрифугируют при 5000 об/мин 5 минут, осажденные клетки растворяют в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим, обрабатывают 20 секунд ультразвуком, нагревают 3 минуты при 100°С и наносят на гель. После прохождения электрофореза гель окрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. К жидким культурам клонов, обладающих наиболее эффективной продукцией целевого белка, добавляют стерильный глицерин до концентрации 15% и замораживают клетки в аликвотах для хранения при температуре -70°С.

Для препаративной продукции белка единичные колонии E. coli BL-PHOFus выращивают в течение ночи при 37°С с добавлением 2% глюкозы, помещают 10 мл ночной культуры в 1000 мл среды 2xYT, содержащей 0.1% глюкозы и 50 мкг/мл ампициллина, и выращивают при 37°С до оптической плотности 1 ОЕ. Выросшую культуру охлаждают до 25°С, добавляют ИПТГ до 0.005 мМ и проводят экспрессию белка в течение 6 часов при 25°С. Уровень продукции белка слитного репортерного субстрата LF определяют электрофорезом в полиакриламидном геле. По денситометрическим измерениям количество белка слитного репортерного субстрата LF составляет 20% от общего клеточного белка.

Пример 3. Выделение, очистка и in vitro биотинилирование белка слитного репортерного субстрата LF на основе щелочной фосфатазы.

Клетки (1 л жидкой культуры) после экспрессии белка собирают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут и немедленно выделяют периплазматическую фракцию, содержащую целевой белок. Для этого клетки суспендируют в 100 мл раствора, содержащего 30 мМ трис-HCl pH 8, 20% сорбитола, 1 мМ PMSF и 20 мкг/мл лизоцима и инубируют при комнатной температуре в течение 30 минут. Клеточную суспензию центрифугируют при 10000 об/мин 15 минут, и супернатант, содержащий периплазматические белки, наносят на колонку с металл-хелатным сорбентом (Talon, Clontech), уравновешенную 10 объемами буфера 20 мМ трис-HCl pH 8, 100 мМ NaCl. Хроматографию проводят при температуре +4°С. Колонку промывают 10 объемами того же буфера и элюируют белок 200 мМ имидазола в том же буфере (pH 8). Фракции, сошедшие с колонки, анализируют электрофорезом в полиакриламидном геле, как описано в примере 2. По данным денситометрии чистота белка после металл-хелатной хроматографии составляет 80%, выход белка составляет 20 мг.

Очищенный белок диализуют при +4°С в течение 3 часов с тремя сменами раствора против буфера, содержащего 30 мМ трис-HCl pH 8.3 и 10 мМ MgCl₂. Для биотинилирования к белку добавляют АТФ до концентрации 5 мМ, биотин до концентрации 1 мМ и 1 мкг биотин-лигазы BirA (www.avidity.com) на 1 мг белка и инкубируют при 30°С в течение 30 минут.

Вторую стадию очистки белка и одновременно освобождение от компонентов реакции биотинилирования проводят на гель-фильтрационной колонке Superdex 75 в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl pH 8, 50 мМ KCl, 1 мM MgCl₂, 0.1 мM ZnCl₂ и 10% глицерина. Фракции, содержащие чистый целевой белок, идентифицируют электрофорезом в полиакриламидном геле по Леммли и хранят замороженными в аликвотах при температуре -70°С.

Пример 4. Определение чувствительности слитного репортерного субстрата LF на основе щелочной фосфатазы к расщеплению летальным фактором сибирской язвы.

На иммунологический планшет с иммобилизованным нейтравидином (Pierce) в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl, 50 мМ KCl, 1 мМ MgCl₂, 1 мкМ ZnCl₂ наносят очищенный белок слитного репортерного субстратом LF на основе щелочной фосфатазы в количестве 1 мкг на лунку и инкубируют планшет при комнатной температуре в течение 30 минут. Троекратно промывают лунки планшета от несвязанного субстратного белка буфером, содержащим 20 мМ трис-HCl, 50 мМ KCl, и наносят в лунки различные концентрации (от 0.1 до 1500 пМ) активного фермента LF (получение активного фермента летального фактора - патент РФ №2355769) в 100 мкл буфера для LF, содержащего 50 мМ HEPES pH 7,20 мкМ ZnCl₂ и свободного от ЭДТА ингибитора протеаз (Roche), и инкубируют планшет в течение 1 часа при температуре 37°С. В контрольные лунки LF не добавляют. По окончании инкубации из лунок переносят 100 мкл супернатанта в новый планшет и добавляют флюоресцентный субстрат щелочной фосфатазы флюоресцеин дифосфат до концентрации 100 мкМ. Инкубируют планшет при 37°С в течение 3 минут. Реакцию останавливают добавлением ЭДТА до концентрации 50 мМ. Измерения проводят на флюорометре (Tecan, Genious) при соотношении длин волн экстинкции/эмиссии 470/540. Минимальное значение флюоресценции, заведомо превышающее контрольное, соответствует минимальной детектируемой с применением данного метода концентрации фермента летального фактора и наблюдается при концентрации 1 пМ.

Изобретение относится к биотехнологии, белковой и генной инженерии. Конструируют рекомбинантную плазмиду pETPHOFus, обеспечивающую синтез субстрата летального фактора сибирской язвы в составе одного полипептида с мутированным репортерным ферментом щелочной фосфатазы Escherichia coli. Данный слитый полипептид представляет собой новый высокочувствительный субстрат летального фактора сибирской язвы. Кроме того, предлагается штамм Escherichia coli BL-PHOFus, продуцент слитого полипептида. Штамм обеспечивает высокий выход синтезируемого белка не менее 30 мг на 1 литр жидкой культуры без ферментации. Получаемый субстрат летального фактора сибирской язвы обладает повышенной чувствительностью и специфичностью к расщеплению LF и способен детектировать протеолитическую активность летального фактора сибирской язвы в концентрации до 1 пМ. Данное изобретение может найти применение при клинической диагностике заболевания сибирской язвой; для обнаружения природных очагов сибирской язвы; для скрининга библиотек химических соединений и поиска ингибиторов активности летального фактора сибирской язвы. 2 н.п. ф-лы, 4 ил.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pETPHOFus, обеспечивающая синтез рекомбинантного белка - субстрата летального фактора сибирской язвы в клетках Escherichia coli, имеющая молекулярную массу 4,55 МДа, содержащая в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость клеток Escherichia. coli BL21 (DE3), трансформированных плазмидой pETPHOFus, к антибиотикам пенициллинового ряда, содержащая уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, расположенные на следующем расстоянии влево от сайта NdeI: SalI 189 пн, PstI 635 пн, NheI 1154 пн, XhoI 1541 пн и состоящая из NdeI-XhoI фрагмента ДНК коммерческой плазмиды pET22b(+) и экспрессирующихся в составе одного полипептида NdeI/XhoI фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность лидерного пептида щелочной фосфатазы Escherichia coli; первые 6 аминокислотных остатков зрелой щелочной фосфатазы; пептид NPGGLNDIFEAQKIEWHED; спейсерный пептид; высокоэффективный субстратный пептид для LF RRKKVYPYPME; домен, содержащий активный центр щелочной фосфатазы, модифицированный внесением мутаций D135G и D330N; последовательность, кодирующая шесть гистидинов.

2. Штамм Escherichia coli BL-PHOFus, продуцирующий слитный репортерный субстрат летального фактора сибирской язвы на основе щелочной фосфатазы, содержащий в составе одного полипептида пептидный субстрат летального фактора сибирской язвы RRKKVYPYPME, пептид NPGGLNDIFEAQKIEWHED, биотинилирующийся под действием биотин-лигазы Escherichia coli, и последовательность, кодирующую шесть гистидинов.