ПРИМЕНЕНИЕ о-АТФ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВКЛЮЧАЮЩИХ АНГИОГЕНЕЗ Российский патент 2009 года по МПК A61K31/7076 A61P43/00 A61P35/00 A61P9/10 A61P27/02 

Настоящее изобретение относится, в целом, к веществам, которые воздействуют на ангиогенез. Более точно, изобретение относится к применению о-АТФ для лечения патологических состояний, которые требуют ингибирования ангиогенеза.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ангиогенез

Пролиферация эндотелиальных клеток является ответственной за процесс образования новых кровеносных сосудов, известный как ангиогенез. Образующиеся заново сосуды обеспечивают поступление питательных веществ и кислорода в клетки тканей, где возникает ангиогенез. Процесс ангиогенеза полезен, например, для заживления ран, так как регенерирующей ткани необходимо соответствующее кровоснабжение. Напротив, ангиогенез является вредным в случае опухолевых заболеваний, так как кровоснабжение способствует пролиферации опухолевых клеток. Кроме того, неоангиогенез является вредным, когда развивается в атеросклеротических бляшках; на самом деле, в таких структурах образование новых сосудов из-за продукции VEGF (эндотелиального фактора роста сосудов) эндотелиальными и другими клетками, такими как моноциты/макрофаги, поддерживает сохранение тех же бляшек. Следовательно, ингибирование пролиферации эндотелиальных клеток или антиангиогенная активность, предоставляет заметный интерес в противоопухолевой и антиатеросклеротической терапии.

Биологическая активность о-АТФ

Окисленная форма АТФ, известная как о-АТФ, характеризуется присутствием двух альдегидных групп в положениях 2' и 3' рибофуранозильного цикла. Она может быть получена обработкой АТФ солью йодной кислоты, как описано P.N. Lowe et al., “Preparation and chemical properties of periodate-oxidized adenosine triphosphate and some related compounds”, Biochemical Society Transactions, vol. 7: 1131-1133, 1979.

О-АТФ обычно используют в качестве аффинного маркера для нуклеотидных ферментных сайтов (Easterbrook-Smith, B., Wallace, J.C. & Keech, D.B. (1976) Eur. J. Biochem. 62, 125-130) благодаря его способности реагировать с непротонированными остатками лизина, которые присутствуют в нуклеотидных сайтах, образуя основания Шиффа или производные дигидроморфолина (Colman, R.F. (1990) в The Enzymes - Sigman, D.S., and Boyer, P.D., eds - Vol 19, pp. 283-323, Academic Press, San Diego). Также его используют для изучения активации тромбоцитов и ингибирования АТФ-индуцированной стимуляции мышц цыплят (Pearce, P.H., Wright, J.M. Egan. C.M. & Scrutton, M.C. (1978) Eur. J. Biochem. 88, 543-554; Thomas, S.A., Zawisa, M.J., Lin, X. & Hume, R.I, (1991) Br. J. Pharmacol. 103, 1963-1969). Более того, в клеточных линиях макрофагов о-АТФ оказался способным блокировать АТФ-индуцированное повышение мембранной проницаемости плазмы, уменьшать уровень гидролиза экзогенного АТФ мембранными экто-АТФ-азами и ингибировать АТФ-индуцированное набухание, вакуолизацию и лизис клеток (Murgia et al. The Journal of Biological Chemistry, (1993) by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, inc., Vol. 268, No. 11, pp. 8199). Предполагают, что о-АТФ обладает антагонистической активностью по отношению к пуринергическому рецептору P2z/P2X7 благодаря тому, что высвобождение ИЛ-1β (интерлейкин 1β) (который является зависимым от ЛПС = липополисахарида) из клеток микроглии, экспрессирующих P22/P2X7, селективно ингибируется о-АТФ (Ferrari D. et al., J. Exp. Med., (1997) Vol. 185, N.3, Pag. 579-582).

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

WO 02/11737 на имя Заявителя данной заявки описывает противовоспалительный и обезболивающий эффект о-АТФ с использованием одностороннего воспаления крысиной лапы, вызванного внутриподошвенной инъекцией полного адъюванта Фрунда (CFA), в качестве экспериментальной модели.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Исследования in vitro на человеческих эндотелиальных клетках пупочной вены (HUVEC) показали, что о-АТФ индуцирует значительное уменьшение их пролиферативной способности, даже в присутствии митогена. Эффект о-АТФ был более высоким, чем индуцированный вазостатином, известным антиангиогенным соединением.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является применение о-АТФ для ингибирования ангиогенеза. В частности, изобретение предлагает лекарственный препарат, содержащий о-АТФ в качестве активного компонента, применимый для лечения патологических состояний, начало или прогрессирование которых включает ангиогенез. Заболевания, опосредованные ангиогенезом, при которых может быть полезно лечение о-АТФ по изобретению, включают заболевания глаз, индуцированные неоваскуляризацией, такие как диабетическая ретинопатия, дегенерация макулы, пролиферативная витреоретинопатия, глаукома, атеросклеротические процессы и опухоли, такие как карциномы, лимфомы, лейкозы, саркомы, меланомы, глиомы, нейробластомы и другие солидные опухоли.

Для терапевтической цели о-АТФ может быть сформирован с фармацевтически приемлемыми носителями или вспомогательными веществами и вводиться перорально, местно или парентерально. Фармацевтические формы, подходящие для различных путей введения, включают таблетки, пилюли, капсулы, грануляты, порошки, суппозитории, сиропы, растворы, суспензии, кремы, мази, гели, пасты, лосьоны, эмульсии, спреи. Фармацевтические композиции могут быть получены, как описано в Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, Mack Pub. Co., NY, USA, XVII Ed. Количество активного вещества на лекарственную форму варьируется от 0,01 до 100 мг на кг массы тела, для введения один или более раз в сутки в соответствии с типом и тяжестью патологии. В общем, суточная доза будет варьироваться от 1 до 300 мг, предпочтительно от 10 до 100 мг.

В другом варианте осуществления изобретение относится к комбинированным препаратам о-АТФ и других биологически активных веществ для лечения патологических состояний, опосредованных ангиогенезом. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения о-АТФ используют в комбинации с противоопухолевыми веществами, такими как алкалоиды, антибиотики, цитотоксические или цитостатические соединения, антиметаболиты, антигормональные агенты, алкилирующие агенты, пептиды, модуляторы биологического ответа, цитокины. Альтернативно, оАТФ используют в комбинации с антиатеросклеротическими веществами, предпочтительно с гиполипидемическими лекарственными средствами или статинами.

Различные активные вещества можно вводить и одновременно и раздельно. Выбор специфической комбинации активных веществ, их дозировка и путь введения зависит от специфического заболевания, его устойчивости к фармакологическому лечению, переносимости пациентом и других переменных, определяемых на основании конкретного случая.

Пример 1 - Анализ пролиферации

Человеческие эндотелиальные клетки (HUVEC) выделяли из пупочной вены, считали и засевали в постоянном количестве в 96-луночные планшеты. Клетки культивировали как описано (Jaffe, E.A. (1984) Biology of Endothelial Cells, Martinus Nighoff Publisher, Boston, USA, pp. 1-260), с или без (контроль) VEGF (50 нг/мл), в присутствии о-АТФ (100 мкМ) и о-АТФ+VEGF. После 24 часов культивирования с или без стимуляции клетки промывали и считали с помощью оптического микроскопа с использованием камеры Баркера. Результаты показаны на фиг. 1 и представляют собой среднее ± СО (стандартное отклонение) из 10 экспериментов.

Пример 2 - Анализ проницаемости

Использовали транс-ячеечные камеры для культур клеток (поликарбонатные фильтры 0,4 мкм, Costar). Слившиеся эндотелиальные клетки в монослое подвергали воздействию VEGF, о-АТФ, АТФ (300 мкМ), АТФ + о-АТФ, о-АТФ + VEGF (в указанных ранее концентрациях) в течение 1 ч и тщательно промывали. Альбумин, меченный ¹²⁵I (NEN, Boston, MA), добавляли в верхнюю камеру; холодный альбумин (1,5 мг/мл) добавляли к питательной среде для минимизации трансцитоза. Через один час после добавления к каждой ячейке альбумина, меченного ¹²⁵I, отбирали образцы из нижней камеры. Радиоактивность образцов измеряли гамма счетчиком (Packard, Sterling, VA). Результаты, представленные на фиг.2, представляют собой среднее ± СО 10 независимых экспериментов и выражены как процентное отношение мигрировавших эндотелиальных клеток.

Предложено применение окисленной формы АТФ (о-АТФ) в качестве антиангиогенного фармакологического агента, терапевтический препарат для лечения опухолей, включающий о-АТФ с противоопухолевым веществом и терапевтический препарат для лечения атеросклеротических процессов, содержащий о-АТФ с антиатеросклеротическими веществами. Агент применим для лечения заболеваний, в чьем начале или прогрессировании вовлечен ангиогенез, таких как заболевания глаз, атеросклеротические процессы или опухоли. Показано подавление пролиферации эндотелиальных клеток, или антиантиогенный эффект даже в присутствии эндотелиального фактора роста сосудов. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Применение о-АТФ для получения лекарственного препарата с антиангиогенной активностью.

2. Применение по п.1 для лечения заболеваний, которые в своем начале или при прогрессировании включают ангиогенез.

3. Применение по пп.1 и 2 для лечения заболеваний глаз, атеросклеротических процессов или опухолей.

4. Применение по п.3 для лечения карцином, лимфом, лейкозов, сарком, меланом, глиом, нейробластом.

5. Терапевтический препарат, содержащий о-АТФ в комбинации с противоопухолевым веществом, выбираемым из цитотоксических или цитостатических соединений, антиметаболитов, алкалоидов, антибиотиков, алкилирующих агентов, пептидов, модуляторов биологического ответа и цитокинов, для одновременного, раздельного или последовательного применения в лечении опухолей.

6. Терапевтический препарат, содержащий о-АТФ в комбинации с антиатеросклеротическими веществами, выбираемыми из гиполипидемических лекарственных препаратов и статинов, для одновременного, раздельного или последовательного применения в лечении атеросклеротических процессов.