СПОСОБ БИОДЕТЕКЦИИ ВОЗДЕЙСТВИЯ ИНТЕГРАЛЬНОГО ПОЛЯ ЛАДОНЕЙ ЧЕЛОВЕКА НА ЭМБРИОНЫ Xenopus laevis ИЛИ МОРСКОГО ГИДРОИДНОГО ПОЛИПА Obelia Российский патент 2009 года по МПК A61D99/00 

Изобретение относится к области биологии и может быть использовано для тестирования биологического действия излучений человека при определении физиологического состояния и силы энергетического воздействия человека на другие организмы.

Как известно, способы коммуникации животных весьма разнообразны. У видов с развитой нервной системой эволюция сенсорных систем происходит с усложнением нервной системы и совершенствованием специализированных органов чувств, воспринимающих достаточно сложную информацию. Однако у всех животных имеется и простая сигнализация, передающая информацию о степени благоприятности среды - прежде всего об опасности или безопасности биологического окружения. Сигналы об опасности воспринимаются как стрессоры и, вероятно, имеют универсальный характер. Сигналы о присутствии живого существа (вне зависимости от возможной угрозы или безопасности) также должны восприниматься, по-видимому, универсальными механизмами. Одним из универсальных стрессорных механизмов является развитие окислительных свободнорадикальных реакций, вызывающих на клеточном уровне активизацию антиоксидантной защиты и изменения физико-химического состояния мембранных структур (Бурлакова Е.Б., Михайлов Е.Ф., Мазурик В.К. Система окислительно-восстановительного гомеостаза при радиационно-индуцируемой нестабильности генома. Радиац. биология. Радиоэкология. 2001 г., т.41, №5). При этом также изменяется электрический заряд на поверхности тела, что сказывается в изменении характеристик электрического поля, свойственного всем клеткам и организмам.

Источником бесконтактного воздействия одного организма на другой можно считать интегральное поле физической природы (А.Г.Гурвич. Принципы аналитической биологии и теории клеточных полей. М.: Наука, 1991). Известно, например, электрическое поле, характеристики которого зависят от интенсивности метаболизма, в частности, от развития окислительных свободнорадикальных процессов на клеточном уровне.

Биосенсором (детектором) могут быть мембранные сенсорные свободные радикалы, которые инициируют ответное развитие свободнорадикальных реакций в клетках объекта, т.е. стрессовую реакцию мобилизации. Свободные радикалы - активные формы кислорода - в биологических объектах могут вызывать развитие цепных разветвленных реакций, что может быть механизмом усиления первичного слабого воздействия (Ю.Б.Кудряшов. Радиационная биофизика. М.: Высш. шк., 2004; Эйдус Л.Х. Мембранный механизм биологического действия малых доз. М.: 2001).

В настоящее время доказано существование электрического поля человека, источником которого является трибоэлектрический заряд эпидермиса. Динамика этого поля коррелирует с изменениями терморегуляции организма и функционирования внутренних органов. Известна точка зрения о биоэлектретном происхождении электрического поля живых организмов (Warmke U. 1979, Губкин 1972, Дубров, Пушкин 1990).

Бесконтактный метод измерения электрических полей применяется в медицине. В медицине применяют также приборы, измеряющие магнитное поле человека. Электромагнитные поля и излучения человека характеризуются частотами до 1000 Гц (Биофизика / Под ред. Антонова В.Ф., М.: Владос, 2000; Годик Э.Э., Гуляев Ю.Ц. В мире науки, М., Мир, 1990, №5; Егоров В.В. Биологически активные поля и излучения организмов, М., МГАВМ и Б, 2004 г.).

Исследованы также радиотепловые излучения организма в диапазоне λ 10^-6-10^-1 м с максимумом в области 3-10 мкм (глубина поглощения такого излучения - несколько сантиметров). Основной источник такого излучения у человека - движение крови. СВЧ и видимая радиометрия используются в медицине для получения температурных карт органов человека и используются для диагностики опухолей различных органов.

Измерено также инфракрасное (ИК) излучение (более 100 Вт с поверхности всего тела человека). Также термокарты могут быть сняты на расстоянии и служат для исследования микроциркуляции капиллярного кровотока (Годик Э.Э., Гуляев Ю.В. В мире науки, 1990 г., №5).

Человеческий организм, как и другие живые организмы, является также источником оптического и УФ-излучения (10¹⁵ Гц и выше), измеряемого на расстоянии с помощью фотоэлектронных умножителей (ФЭУ), способных регистрировать отдельные кванты света.

Источником такого сверхслабого излучения в УФ и видимой области спектра являются метаболические клеточные процессы, идущие по свободнорадикальному механизму (Владимиров Ю.А. Свечение, сопровождающее биохимические реакции. Соросовский образовательный журнал, 1999 г. т.5, №6 (43); Гурвич А.Г. Митогенетическое излучение. М.: 1932.; Гурвич А.Г. Принципы аналитической биологии и теории клеточных полей. М.: Наука, 1991).

Зарегистрированы также акустические поля и излучения человека (от 0,01 Гц до 10³ Гц и УЗ - до 10 МГц). Источниками их являются, видимо, колебания на поверхности тела.

Таким образом, известны излучения живых организмов (в т.ч. человека) с различными характеристиками, которые могут служить источником интегрального поля, возникающего у поверхности ладоней человека, и средством дистанционных взаимодействий между организмами.

Излучения организмов относятся к сверхслабым воздействиям и для их регистрации используется различная сложная дорогостоящая аппаратура.

Не изученной остается вторая сторона вопроса о возможности волновых коммуникаций между организмами - проблема механизмов биодетекции слабых и сверхслабых дистанционных воздействий. Биодетекторы, как известно, весьма чувствительны к слабым сигналам как физической, так и химической природы.

Наиболее близким по технической сути и достигаемому результату к предлагаемому решению является способ биодетекции неконтактных воздействий организмов, включающий бесконтактное дистанционное воздействие интегрального поля ладоней человека на биодетекторы (семена растений), инкубацию биодетекторов и оценку результатов воздействия по изменениям скорости прорастания семян (Егоров В.В., Новичкова А.В., Славышенская О., Скороходов Д. Чувствительность семян к слабым полям организмов. Сб.: Вопросы физико-химической биологии в ветеринарии). М.: МГАВМБ, 2003 г. С.145-150).

Недостатком описанного способа является высокая стоимость, трудоемкость и продолжительность процесса тестирования.

Технический эффект, ожидаемый от использования предлагаемого изобретения, заключается в снижении стоимости и времени тестирования, а также в обеспечении возможности исследования различных энергоинформационных механизмов взаимодействия человека с объектами живой природы.

Указанный технический эффект достигается способом биодетекции воздействия интегрального поля ладоней человека на эмбрионы Xenopus laevis или морского гидроидного полипа Obelia, включающим помещение исследуемых тест-объектов в воду, разделение на опытную и контрольную группы, причем воздействию интегрального поля ладоней человека, подвергают тест-объекты опытных групп в течение 30 мин на расстоянии 15-20 см от тест-объекта, затем тест-объекты обеих групп помещают в водный раствор, содержащий радиоактивный индикатор свободнорадикальных реакций, и проводят инкубацию опытных групп в течение 1 ч после воздействия, а контрольных в течение 1,5 ч, после чего производят измерение радиоактивности тест-объектов в каждой группе, а оценивают результат воздействия по изменению уровня содержания в тест-объектах меченых сополимеров, определяемого по формуле:

Δ=(DPM_оп-DPM_к)·100/DPM_к,

где Δ - показатель изменения уровня меченых сополимеров, в %,

DPM_к - радиоактивность меченых сополимеров в тест-объектах контрольной группы, распады в мин,

DPM_оп - радиактивность меченых сополимеров в тест-объектах опытной группы, распады в мин,

при этом значение показателя изменения уровня меченых сополимеров более чем на 20% указывает на ускорение скорости развития эмбрионов и скорости образования и дегенерации морского гидроидного полипа.

Способ осуществляется следующим образом. В качестве испытуемых биодетекторов применяются эмбрионы амфибий (шпорцевых лягушек) на стадиях гаструлы или нейрулы (критических, высокочувствительных стадиях развития) (Мелехова О.П. Оценка эмбриотоксичности водной среды. Изв. РАН, сер. биол., 1994, №4), а также колонии морских гидроидных полипов.

Биодетекторы делят на две группы: контрольную и опытную. Биодетекторы обеих групп помещают в раствор, содержащий радиоактивный индикатор свободнорадикальных (СР) реакций. Биодетекторы контрольной группы после помещения в раствор, содержащий радиоактивный индикатор свободнорадикальных (СР) реакций размещают в изолированном от биодетекторов опытной группы помещении. Контрольные эмбрионы не подвергались более никакому воздействию, и процесс их развития до конечной стадии проходил естественным путем. Биодетекторы опытной группы подвергали дистанционному воздействию интегрального поля ладоней человека (либо другого физического источника поля) в течение 30 мин на расстоянии 15-20 см. Во время и после воздействия на эмбрионы их помещают в раствор, содержащий радиоактивный индикатор свободнорадикальных (СР) реакций. В клетках эмбриона in vivo происходит реакция радикальной сополимеризации (Ю.П.Козлов. Привитая сополимеризация как метод исследования свободных радикалов в биологических системах. М.: Изд-во МГУ, 1970 г., стр.29-35).

Кратко, суть метода привитой сополимеризации (ПС) заключается в том, что если в биологический объект, содержащий СР, ввести какой-либо мономер, способный к радикальной полимеризации, то процесс полимеризации развивается пропорционально имеющемуся в тканях количеству СР.

Метод привитой радикальной сополимеризации позволяет обнаружить начальные процессы реакции биодетектора на воздействия на субклеточном уровне. При введении в живой организм радиоактивного (меченого изотопом ¹⁴С) индикатора-мономера в клетках происходит полимеризация этого ненасыщенного соединения, инициируемая метаболическими свободными радикалами. При этом образуются сополимеры, у которых цепи меченого полимера оказываются соединенными с биополимерами (белки, фосфолипопротеиды). Небольшие молекулы водорастворимого мономера легко проникают в живую клетку и достаточно быстро вымываются из нее, тогда как сополимеры, по-видимому, выключаются из нормального метаболизма и при длительной инкубации накапливаются в клетках объекта, что обуславливают большую чувствительность метода.

Концентрация свободных радикалов в клетках и тканях характеризует уровень окислительно-восстановительных реакций, так как свободные радикалы (СР) являются промежуточными продуктами этих реакций. В клеточном метаболизме у животных наиболее распространены СР-реакции в ферментативных цепях окисления митохондрий и микросом, возможно, в процессе генерации АТФ, а также при неферментативном окислении: значительная часть СР в живой клетке образуется при перекисном окислении мембранных липидов (Ю.П.Козлов, 1973. Свободные радикалы в биологических системах).

При использовании метода ПС применяются мономеры винилового ряда. При полимеризации такого ненасыщенного соединения, индуцированной СР-состояниями биологических макромолекул образуются так называемые сополимеры. Возможно также присоединение мономера с разрывом π-электронной связи и образованием нового СР-состояния. В конечном счете процесс заканчивается или соединением двух радикалов, или замыканием кольца, или присоединением другой молекулы. Скорость реакции ПС in vivo зависит от многих факторов, в числе которых можно назвать концентрацию и реакционную способность СР в живой системе, концентрацию мономера, зависящую от проницаемости клеточных мембран, температуру и длительность инкубации и т.п.

Радикальный характер реакции ПС in vivo показан на облученных объектах (Козлов, Уртилэ, Тарусов, 1966), а также доказывается исчезновением сигнала ЭПР в интактном объекте, обработанном раствором мономера (Козлов, Сергеев, 1963).

При введении в клетки меченого радиоактивным изотопом мономера можно зарегистрировать наличие реакционноспособных СР по содержанию в тканях объекта меченых сополимеров (т.е. по радиоактивности образца ткани). Меченые сополимеры обычно выявляют методами радиометрии или радиоавтографии. Уровень радиоактивности образцов биологических объектов отражает относительную концентрацию СР в этих объектах, которая в свою очередь пропорциональна скорости тех биохимических реакций, в которых участвуют в качестве промежуточных продуктов свободные радикалы (т.е. скорости радикалообразования или, иначе, интенсивности СР-реакций).

Информация, полученная таким методом, носит полуколичественный характер: не давая возможности определить истинную концентрацию СР в клетках и тканях объекта, она позволяет судить об относительной концентрации СР и хорошо отражает тенденцию уровня СР-процессов к увеличению или уменьшению при том или ином изменении состояния биологических объектов.

Методом ПС выявляется суммарное количество всех СР - и долгоживуших и короткоживущих, возникших в клетках объекта за время его инкубации в растворе меченого мономера. Накопление меченых сополимеров в клетках in vivo во время инкубации объекта позволяет выявлять низкие стационарные концентрации СР.

Пример осуществления способа.

В качестве биотестов использовали эмбрионы шпорцевой лягушки на стадии гаструлы (полученные в лаборатории) и природный объект: морской гидроидный полип Obelia.

Объекты помещали в чашку Петри с чистой отстоенной водой, подвергали бесконтактному воздействию рук человека на расстоянии 15 см в течение 30 мин. Затем помещали их в воду, содержащую радиоактивный индикатор на 1,5 часа и приготавливали стандартным способом биодетекторы для сцинтилляционного счетчика.

При осуществлении опытной проверки способа в качестве радиоактивного индикатора СР использовался мономер акриламид CH₂=CH-CONH₂, меченый по углероду (АА-¹⁴С). Акриламид хорошо растворим в воде, быстро проникает в ткани при инкубации объектов в его водном растворе. Эмпирически была подобрана удобная концентрация АА: порядка 10^-3 моля (0,003%) с активностью 3 мкКи/мл при удельной активности препарата АА-¹⁴С 100 мкКи/мг. Эта концентрация не токсична (гидробионты могут жить в таком растворе долгий срок - до 14-15 дней - без видимых нарушений развития и поведения); вместе с тем эта концентрация АА-¹⁴С достаточна для измерений радиометрическим методом жидкостной сцинтилляции. Выбор оптимальных условий инкубации эмбрионов в растворе АА-¹⁴C потребовал некоторых дополнительных исследований. Основываясь на результатах этих предварительных опытов, мы приняли следующие условия инкубации объектов: концентрация водного раствора 10^-3 моля (0,003%); температура 15°С; время инкубации 90 мин; в основном, фиксации проводили в одно и то же время суток. Объем раствора АА¹⁴С, в котором содержали перед фиксацией объекты, соизмеряли с размерами объектов. Приблизительно исходили из расчета 6 мкКи на 1 г веса объектов, с некоторым превышением. Активность рабочего раствора AA¹⁴C - 3 мкКи/мл. Препарат AA¹⁴C был синтезирован в лаборатории.

Содержание метки привитых сополимеров определяли с помощью метода жидкостной сцинтилляции. Пробы растворяли в концентрированной HClO₄ в течение 12 ч при 50°. Поскольку HClO₄ является сильным гасителем сцинтилляций, к пробам добавляли 1,5 М трис, необходимый для нейтрализации кислоты. В качестве сцинтиллятора использовали раствор Брея. Автоматический сцинтилляционный счет проводили на установке Mark-2 (США). Результаты счета получали в величинах относительной активности (СРМ - импульсы в мин). Для их пересчета в истинную активность (DPM - распады в мин) методом внешней стандартизации была построена калибровочная кривая гашения. Каждую серию опытов повторяли трижды.

Сцинтилляционные счетчики представляют показатели радиоактивности образцов в импульсах/мин (СРМ, относительная активность). Эти численные данные пересчитываются в значения истинной радиоактивности: распады в мин, DPM и затем относятся к количеству или массе объекта, вычисляется средняя арифметическая DPM (М±σ). После этого вычисляется Δ=(DPM_оп-DPM_к)·100/DPM_к.

Эта величина отражает сдвиг уровня СР-процессов в объекте после воздействия.

Образцы контрольной группы содержались в растворе индикатора той же концентрации, в течение такого же времени, при той же температуре воздуха, как и образцы опытной группы. Предварительными опытами было показано, что выбранные диагностические весьма слабые концентрации индикатора не влияют на развитие эмбрионов даже при длительном содержании эмбрионов в растворе.

Нарушения субклеточных процессов, которые могут возникнуть в момент воздействия, в результате развития эмбриона быстро визуализируются и регистрируются морфометрически (появление уродств, изменение скорости, синхронизация или остановка развития). Сочетание обнаружения первичных процессов на субклеточном уровне с морфометрической регистрацией изменений хода развития позволяет получить сведения о механизмах повреждений.

После окончания инкубации производили измерение радиоактивности образцов биодетекторов методом жидкостной сцинтилляции. Оценку результата воздействия проводили по изменению уровня в эмбрионах радиоактивности меченых сополимеров, пропорционального уровню свободнорадикальных реакций, по уравнению:

Δ=(DPM_оп-DPM_к)·100/DPM_к,

где Δ - показатель изменения уровня радиоактивности меченых сополимеров, % (уровень радиоактивности меченых сополимеров пропорционален концентрации свободных радикалов, возникших в объектах за время их инкубации в присутствии индикатора),

DPM_к - распады в мин, отражающие содержание меченых сополимеров в образцах, эмбрионы которых не подвергались воздействию,

DPM_оп - распады в минуту в опытном образце, отражающие содержание меченых сополимеров (конц. СР) в эмбрионах, подвергавшихся дистанционному воздействию.

Для оценки надежности вышеописанного экспрессного определения воздействия проводили морфометрические измерения и определяли скорость развития опытных и контрольных эмбрионов в течение 4 суток после однократного воздействия.

Показатели сцинтилляционного счетчика автоматически регистрируются на ленте. В каждом опыте делается 3 повторности, в каждый флакон для сцинтилляционного счета помещается 5-7 объектов. Затем показатели счетчика (DPM) пересчитываются на 1 объект. После этого рассчитывается средняя арифметическая (М) и дисперсия (σ) из 3 повторностей для DPM_оп и DPM_к. Затем производится расчет по формуле Δ=(DPM_оп-DPM_к)·100/DPM_к.

В предварительных опытах по определению индивидуальных различий уровня СР-реакций у выбранных объектов показано, что индивидуальные различия составляют в контроле не более 15-20%. Сдвиг уровня СР-реакций (пропорциональной разности DPM_оп-DPM_к более чем на 20% после воздействия считается достоверным результатом воздействия. Это заключение в обоих примерах подтверждается в более поздние сроки морфологическим эффектом (см. таблицу).

Контрольными являются биодетекторы, приготовленные из интактных объектов, не подвергавшихся воздействию человека и находившихся в другом помещении в таких же условиях. Тестовая реакция количественно характеризует метаболические изменения (отклонения уровня свободнорадикальных реакций) в опытных образцах по отношению к контрольным, возникающие в результате воздействий интегрального поля ладоней человека.

Для проверки надежности заключения вели прижизненные наблюдения над другими объектами контрольной и опытной групп объектов в течение некоторого срока, оценивая показатели их жизнеспособности (скорость развития эмбрионов и скорость образования и дегенерации гидрантов Obelia):

а) определение действия интегрального поля ладоней человека на тест-объекты (зародыши шпорцевой лягушки Xenopus Laevis D на стадии гаструлы и ранней нейрулы). Воздействие производилось с расстояния 15 см в течение 30 минут, контрольные эмбрионы из той же кладки инкубировали в растворе индикатора в это же время в соседнем помещении при тех же условиях. Инкубация с индикатором начиналась одновременно с воздействием и продолжалась 1,5 часа (в том числе 1 час после окончания воздействия);

б) определение действия интегрального поля ладоней человека на тест-объект (гидроидный полип Obelia.). Воздействие производилось с расстояния 15 см в течение 30 минут, контрольная часть колонии располагалась в это же время в соседнем помещении в таких же условиях. Инкубация с индикатором продолжалась 1,5 часа во время и после окончания воздействия.

Полученные результаты приведены в таблице.

Таблица Объект Воздействие Инкубация Детекция результата: измерение радиоактивности, % (5 повторностей в разные сезоны) Длительные наблюдения последующего развития (в течение 5 суток, с определением стадий развития ежедневно) в опытной и контрольной выборках по 40-50 зародышей DPM_оп
M±σ DPM_k
M±σ Δ(DPM_оп-DPM_k)·100/DPM_k, % Зародыши африканской шпорцевой лягушки Бесконтактное воздействие рук чел. (расстояние 15 см от кажд. руки до объекта). Время воздействия 30 мин Инкубация в р-ре радиоактивного индикатора СР-реакций. Время инкубации 90 мин 1370±123 6237±932 (1370-6237)·100/6237=-78,03 В опытных группах зародышей развитие синхронизируется и ускоряется на 1-2 стадии. Колониальный гидроидный полип Obelia Бесконтактное воздействие рук чел. (расстояние 15 см от кажд. руки до объекта). Время воздействия 30 мин Инкубация в р-ре радиоактивного индикатора СР-реакций. Время инкубации 90 мин 353±32 705±89 (353-705)·100/705=-49,9 Количество дегенерировавших полипов уменьшается на 27%

Инкубация в растворе индикатора СР-реакций в течение первых 30 мин - одновременно с дистанционным воздействием рук экспериментатора, затем еще 60 мин - после воздействия.

Последующие наблюдения скорости развития - в течение 5 суток (определение стадий развития в опытной и контрольной группах по 40-50 зародышей).

Таким образом, немедленный результат воздействия определяется количественно по сдвигу уровня СР-реакций в % по отношению к контролю. Последующие наблюдения - морфометрия и подсчет зародышей, достигших каждой следующей стадии развития (ежедневно в течение 5 суток) - подтверждает результат: снижение уровня СР (антиоксидантный эффект) достоверно синхронизирует и ускоряет развитие.

У гидроидных полипов Obelia дистанционное воздействие ладоней человека также вызывает изменение (снижение) уровня свободнорадикальных реакций, а в последующее время - снижение числа дегенерировавших полипов в колонии.

Исследуемые тест-объекты помещают в воду и разделяют на опытную и контрольную группы. Воздействию интегрального поля ладоней человека подвергают тест-объекты опытных групп в течение 30 мин на расстоянии 15-20 см от тест-объекта, затем тест-объекты обеих групп помещают в водный раствор, содержащий радиоактивный индикатор свободнорадикальных реакций. После инкубации опытных групп в течение 1 ч после воздействия, а контрольных в течение 1,5 ч, проводят измерение радиоактивности тест-объектов в каждой группе. Оценивают результат воздействия по изменению уровня содержания в тест-объектах меченых сополимеров, определяемого по формуле: Δ=(ДРМ_оп-ДРМ_к)·100/ДРМ_к, где Δ - показатель изменения уровня меченых сополимеров, в %. ДРМ_к - радиоактивность меченых сополимеров в тест-объектах контрольной группы, распады в мин. ДРМ_оп - радиоактивность меченых сополимеров в тест-объектах опытной группы, распады в мин. Устанавлено, что значение показателя изменения уровня меченых сополимеров более чем на 20% указывает на ускорение скорости развития эмбрионов и скорости образования и дегенерации морского гидроидного полипа. Это обеспечивает достоверность и надежность результатов воздействия. 1 табл.

Способ биодетекции воздействия интегрального поля ладоней человека на эмбрионы Xenopus laevis или морского гидроидного полипа Obelia, включающий помещение исследуемые тест-объектов в воду, разделение на опытную и контрольную группы, причем воздействию интегрального поля ладоней человека подвергают тест-объекты опытных групп в течение 30 мин на расстоянии 15-20 см от тест-объекта, затем тест-объекты обеих групп помещают в водный раствор, содержащий радиоактивный индикатор свободнорадикальных реакций, и проводят инкубацию опытных групп в течение 1 ч после воздействия, а контрольных в течение 1,5 ч, после чего проводят измерение радиоактивности тест-объектов в каждой группе, а оценивают результат воздействия по изменению уровня содержания в тест-объектах меченых сополимеров, определяемого по формуле
Δ=(ДРМ_оп-ДРМ_к)·100/ДРМ_к,
где Δ - показатель изменения уровня меченых сополимеров, %;
ДРМ_к - радиоактивность меченых сополимеров в тест-объектах контрольной группы, распады в мин;
ДРМ_оп - радиоактивность меченых сополимеров в тест-объектах опытной группы, распады в мин,
при этом значение показателя изменения уровня меченых сополимеров более чем на 20% указывает на ускорение скорости развития эмбрионов и скорости образования и дегенерации морского гидроидного полипа.