СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХАРАКТЕРА КОЖНОЙ ТУБЕРКУЛИНОВОЙ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ IN VITRO Российский патент 2007 года по МПК G01N33/577 

Изобретение относится к медицине, в частности к отрасли клинической лабораторной диагностики, и может быть использовано в качестве способа определения характера кожной туберкулиновой гиперчувствительности in vitro по уровню интенсивности флюоресценции (ИФ) меченных флюороизотиацианатом (ФИТЦ) CD45+-, CD45RA+- и CD45RO+-лимфоцитов в опытной пробе (после инкубации периферической крови с раствором туберкулина 2ТЕ) относительно контрольной пробы (после инкубации периферической крови с физиологическим раствором) с использованием прямо меченных ФИТЦ моноклональных антител (МКАТ) к антигенам CD45, CD45RA, CD45RO и проточной лазерной цитофлюориметрии.

Известен способ определения аллергической гиперчувствительности к препаратам группы антибиотиков, анестетиков и мышечных релаксантов, витаминов in vitro по уровню удельной интенсивности флюоресценции (УИФ) меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов, заявка на патентование которого была нами ранее подана (заявка №99123165/14 от 04.11.99) [1, 15]. Способ включает инкубацию периферической крови больного с физиологическим раствором и растворами лекарственных препаратов с использованием меченных ФИТЦ МКАТ ИКО 46 к антигену CD45, автоматического приготовления лейковзвеси с помощью ImmunoPrepSystem ("Coulter", USA) и лазерную проточную цитофлюориметрию в режиме лимфогейта, где по изменению уровня УИФ меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов в опытной пробе относительно контрольной пробы определяют коэффициент сенсибилизации, при превышении которым соответствующего критического значения (для препаратов группы антибиотиков - 0,5, для анестетиков и мышечных релаксантов - 0,3, для витаминов - 0,3) определяют у пациента наличие гиперчувствительности к исследованному препарату [3, 4, 5].

К достоинствам вышеуказанного способа можно отнести использование изменения ИФ меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов периферической крови в опытной пробе (после инкубации с растворами лекарственных препаратов) относительно контрольной пробы с физиологическим раствором in vitro в качестве показателя аллергической гиперчувствительности на исследованные лекарственные препараты у пациентов с лекарственной гиперчувствительностью [4, 5, 7].

Недостатком вышеуказанного способа является отсутствие указаний на использование в тест-системе in vitro раствора туберкулина 2ТЕ, в связи с чем отсутствуют технические и методические рекомендации по использованию данного способа в плане обследования БЦЖ-вакцинированных детей с кожной туберкулиновой гиперчувствительностью.

Известен способ определения повышенной сенсибилизации к туберкулину in vitro по уровню суммарной и удельной интенсивностей флюоресценции меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов, который и был выбран нами в качестве прототипа [2]. Способ включает инкубацию периферической крови пациента с физиологическим раствором (контрольная проба) и с раствором туберкулина 2ТЕ (опытная проба) с последующим использованием меченных ФИТЦ МКАТ ИКО-46 к поверхностному общелейкоцитарному антигену CD45, автоматического приготовления лейковзвеси с помощью ImmunoPrepSystem ("Coulter", USA) и лазерную проточную цитофлюориметрию в режиме лимфогейта, где по изменению уровня суммарной и удельной интенсивностей флюоресценции меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов в опытной пробе относительно контрольной пробы определяют коэффициент сенсибилизации, при превышении которым нормативного значения 0,2 у пациента выявляют аллергическую гиперчувствительность к компонентам раствора туберкулина, используемого при постановке туберкулиновых проб [2].

Областью применения прототипа является лабораторно-диагностическое обследование детей с сомнительными и повышенными кожными реакциями на введение раствора туберкулина 2ТЕ (проба Манту).

Использование прототипа в лабораторно-диагностической практике позволяет установить аллергический генез клинических проявлений кожной туберкулиновой гиперчувствительности у детей.

К достоинствам прототипа можно отнести использование изменения ИФ меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов в опытной пробе (после инкубации периферической крови с раствором туберкулина 2ТЕ) относительно контрольной пробы с физиологическим раствором in vitro в качестве показателя аллергической гиперчувствительности на компоненты раствора туберкулина у детей с клиническими проявлениями кожной туберкулиновой гиперчувствительности.

Недостатком прототипа является то, что на основе повышенных значений полученного коэффициента сенсибилизации (К>0,2) предоставляется возможность определить только аллергический генез гиперчувствительности к компонентам раствора туберкулина 2ТЕ, используемого при постановке туберкулиновых проб. По нашим данным, это составляет до 20,0% случаев детей с клиническими проявлениями кожной туберкулиновой гиперчувствительности [2]. Тогда как в оставшемся большинстве случаев обследуемых детей использование прототипа не дает возможность установить генез кожной туберкулиновой гиперчувствительности.

Известно, что в числе прочих кожная туберкулиновая гиперчувствительность (размер папулы в пределах 5-9 мм) у детей, вакцинированных БЦЖ, может являться следствием как токсического неспецифического действия компонентов раствора туберкулина и поствакцинальной гиперреактивности сенсибилизированных лимфоцитов, так и инфицированности Mycobacterium tuberculosis (МБТ) [9].

Кроме того, нами показано, что диагностической значимостью обладает как феномен повышения, так и снижения ИФ меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов в тест-системе с медикаментами in vitro относительно контрольной пробы с физиологическим раствором [6]. В связи с этим немаловажным недостатком прототипа является отсутствие указаний о диагностической значимости регистрируемого повышения или снижения ИФ меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов после инкубации периферической крови с раствором туберкулина 2ТЕ in vitro относительно уровня контрольной пробы [2].

Сущность заявляемого способа заключается в том, что для выявления характера кожной туберкулиновой гиперчувствительности используют изменение ИФ меченных ФИТЦ CD45+-, CD45RA+- и CD45RO+-лимфоцитов в опытной пробе (после инкубации периферической крови с раствором туберкулина 2ТЕ) относительно контрольной пробы (после инкубации периферической крови с физиологическим раствором) (табл.1).

Таблица 1.
Характер кожной туберкулиновой гиперчувствительности по изменению ИФ меченных ФИТЦ CD45+-, CD45RA+- и CD45RO+-лимфоцитов в опытной пробе относительно контрольной пробыЗаключениеИФ в опытной пробе относительно контрольной CD45+-клеткиCD45RA+-клеткиCD45RO+-клеткиI вариант: Аллергическая реактивность на компоненты раствора туберкулинаПовышается >, чем на 25,0%повышается (снижается <, чем на 9,0%)повышается <, чем на 20,0%II вариант: Следствие пост-БЦЖ-вакцинальной гиперреактивности сенсибилизированных лимфоцитовПовышается <, чем на 25,0%повышается >, чем на 9,0%повышается >, чем на 20,0%III вариант: Следствие цитотоксического воздействия компонентов раствора туберкулинаСнижается <, чем на20,0%снижается<, чем на 8,5%снижается (повышается <, чем на 8,8%)IV вариант: Подозрение на инфицированность МБТСнижается >, чем на 20,0%снижается (повышается <, чем на 9,0%)снижается (повышается <, чем на 8,8%)Примечание: выделением отмечается ведущий показатель.

В случае, когда в опытной пробе с туберкулином регистрируется повышение ИФ меченных ФИТЦ CD45+-, CD45RA+- и CD45RO+-лимфоцитов относительно контрольной пробы с физ. раствором и данное повышение, в основном, затрагивает CD45+-лимфоциты (более, чем на 25,0% - вариант I по таблице 1) предполагается, что у пациента имеет место аллергическая реактивность на компоненты раствора туберкулина, которая может являться причиной кожной туберкулиновой гиперчувствительности.

В случае, когда в опытной пробе с туберкулином регистрируется повышение ИФ меченных ФИТЦ CD45+-, CD45RA+- и CD45RO+-лимфоцитов относительно контрольной пробы с физ. раствором и данное повышение, в основном, затрагивает CD45RO+-лимфоциты (более чем на 20,0%, вариант II по таблице 1), предполагается, что у пациента имеет место пост-БЦЖ-вакцинальная гиперреактивность сенсибилизированных лимфоцитов, которая может являться причиной кожной туберкулиновой гиперчувствительности.

В случае, когда в опытной пробе с туберкулином регистрируется снижение ИФ меченных ФИТЦ CD45+- и CD45RA+-лимфоцитов относительно контрольной пробы с физ. раствором (менее чем на 25,0% и 8,5%, соответственно, вариант III по таблице 1), предполагается, что клинические проявления кожной туберкулиновой гиперчувствительности у пациента могут являться следствием цитотоксического воздействия компонентов раствора туберкулина.

В случае, когда в опытной пробе с туберкулином регистрируется снижение ИФ меченых CD45+-лимфоцитов относительно контрольной пробы с физ. раствором (более чем на 20,0%, вариант IV по таблице 1), у данного пациента не исключено состояние инфицированности МБТ.

Анализируемые данным способом CD45+-лимфоциты периферической крови относятся к антигенраспознающим клеткам системы иммунитета, которые за счет морфофункциональных особенностей молекулы CD45 и кооперации CD45 с мембранными антигенно-рецепторными комплексами лимфоцитов (CD3-TCR-CD4; CD3-TCR-CD8) осуществляют процессы распознавания, инициации и регуляции развития ответных иммунологических реакций на антигены [11, 12, 13, 14]. Анализируемые данным способом CD45RA+-лимфоциты периферической крови относятся к наивным, непримированным клеткам иммунной системы, ответственным за антигенспецифическую активацию [10]. Анализируемые данным способом CD45RO+-лимфоциты периферической крови относятся к клеткам памяти [8, 10].

Проведенный заявителем поиск по научно-техническим и патентным источникам информации и выбранный из перечня аналогов прототип [2] позволили выявить отличительные признаки в заявляемом техническом решении. Следовательно, заявляемый способ удовлетворяет критерию "новизна".

Проведенный заявителем дополнительный поиск известных технических решений [1, 2, 15] с целью обнаружения в них признаков, сходных с признаками отличительной части формулы заявляемого способа, показал, что эти признаки отсутствуют, следовательно, заявляемое техническое решение удовлетворяет критерию "изобретательский уровень".

Критерий изобретения "клинико-диагностическая применимость" подтверждается тем, что предлагаемый способ определения характера туберкулиновой гиперчувствительности по уровню ИФ меченных ФИТЦ CD45+-, CD45RA+- и CD45RO+-лимфоцитов в опытной пробе с туберкулином 2ТЕ относительно контрольной пробы in vitro позволяет использовать его в клинической практике в качестве стандартизованного метода специфической диагностики.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом: к 480 мкл периферической гепаринизированной крови из локтевой вены добавляют 120 мкл рабочего раствора туберкулина 2ТЕ (опытная проба). Используется коммерческий препарат аллергена туберкулезного очищенного жидкого в стандартном разведении 2ТЕ, содержащего 0,01% хинозола (фенола) и 0,005% твина-80, производства НИИ вакцин и сывороток (г. Санкт-Петербург). Аналогичным способом готовят контрольную пробу, которая содержит 480 мкл гепаринизированной крови и 120 мкл физ. раствора. Опытную и контрольную пробы плотно закрывают, инкубируют 1 час при температуре 37°С при постоянном встряхивании.

После инкубации:

- к 100 мкл контрольной (проба 1) и 100 мкл опытной проб (проба 2) добавляют меченные ФИТЦ МКАТ к антигену CD45, в концентрациях, указанных фирмой-производителем;

- к следующим 100 мкл контрольной (проба 3) и 100 мкл опытной (проба 4) добавляют по 5 мкл меченных ФИТЦ МКАТ к CD45RA, в концентрациях, указанных фирмой-производителем;

- к следующим 100 мкл контрольной (проба 5) и 100 мкл опытной (проба 6) добавляют по 5 мкл меченных ФИТЦ МКАТ к CD45RO, в концентрациях, указанных фирмой-производителем.

Все 6 проб инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. После инкубации все 6 проб обрабатывают с помощью оборудования и реактивов ImmunoPrep System ("Coulter", USA), в результате чего получают взвесь лейко- и лимфоцитов, меченных комплексом [ФИТЦ - МКАТ], без потери их жизнеспособности и иммуногенности. Каждую пробу анализируют с помощью лазерного проточного цитофлюориметра EPICS XL (Coulter, USA) в режиме лимфогейта. Конечным итогом проведенного анализа проб с помощью указанного прибора является протокол исследования, где приведены данные статистической обработки гистограммы распределения меченных ФИТЦ CD45+-, CD45RA+-, CD45RO+-лимфоцитов по уровню ИФ. Для оценки изменения ИФ меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов в опытной пробе относительно контрольной используют показатель УИФ. Для оценки изменения ИФ меченных ФИТЦ CD45RA+- и CD45RO+-лимфоцитов в опытной пробе относительно контрольной используют показатель средней ИФ (СрИФ). Значение уровня СрИФ меченных ФИТЦ CD45RA+- и CD45RO+-лимфоцитов в опытной и контрольной пробах получают из протокола исследования. Значение уровня УИФ меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов в опытной и контрольной пробах определяют по разработанной автором и описанной в литературе методике [3]. Изменение ИФ меченных ФИТЦ CD45+-, CD45RA+-, CD45RO+-лимфоцитов в опытной пробе с туберкулином 2ТЕ относительно контрольной пробы с физиологическим раствором выражают в виде динамики ИФ (ДИФ) и оценивают по формуле:

где ИФ - интенсивность флюоресценции (удельная - для CD45; средняя для CD45RA; средняя - для CD45RO).

Заявляемый способ определения характера кожной туберкулиновой гиперчувствительности иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Пациентка К., 2001 г.р., вакцинирована БЦЖ, поствакцинальный рубчик 5 мм. В анамнезе отмечается повышение температуры и аллергические высыпания после последнего планового внутрикожного введения туберкулина 2ТЕ. Размер папулы - 5 мм.

К 480 мкл периферической гепаринизированной крови из локтевой вены добавили 120 мкл раствора туберкулина 2ТЕ. Аналогичным способом готовили контрольную пробу, которая содержала 480 мкл гепаринизированной крови данного больного и 120 мкл физраствора. Опытную и контрольную пробы плотно закрывали и инкубировали 1 час при температуре 37°С при постоянном встряхивании.

После инкубации:

- к 100 мкл контрольной (проба 1) и 100 мкл опытной (проба 2) пробам добавили по 5 мкл меченных ФИТЦ МКАТ к CD45 ("Caltag", USA);

- к следующим 100 мкл контрольной (проба 3) и 100 мкл опытной (проба 4) добавили по 5 мкл меченных ФИТЦ МКАТ к CD45RA ("Caltag", USA);

- к следующим 100 мкл контрольной (проба 5) и 100 мкл опытной (проба 6) добавили по 5 мкл меченных ФИТЦ МКАТ к CD45RO ("Caltag", USA).

Все 6 проб инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. После инкубации все 6 проб обработали с помощью оборудования и реактивов ImmunoPrep System ("Coulter", USA). Все полученные пробы анализироали с помощью лазерного проточного цитофлюориметра EPICS XL ("Coulter", USA) в режиме лимфогейта.

Уровень УИФ меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов в данном случае в контрольной пробе 1 составил 0,2, в опытной пробе 2 (с туберкулином) - 0,27. Используя формулу для расчета ДИФ, получаем: ((0,2-0,27):0,27)×100%=-35,0%. В данном случае (-) указывает, что в опытной пробе показатель УИФ больше, чем в контрольной. Из этого мы делаем заключение, что в опытной пробе УИФ меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов повысилась на 35,0%.

Уровень СрИФ меченных ФИТЦ CD45RA+-лимфоцитов в данном случае в контрольной пробе 3 составил 6,85, в опытной пробе 4 (с туберкулином) - 6,72. Используя формулу для расчета ДИФ, получаем: ((6,85-6,72):6,85)×100%=1,89%. В данном случае получено, что в опытной пробе показатель СрИФ меньше, чем в контрольной. Из этого мы делаем заключение, что в опытной пробе СрИФ меченных ФИТЦ CD45RA+-лимфоцитов снизилась на 1,9%.

Уровень СрИФ меченных ФИТЦ CD45RO+-лимфоцитов в данном случае в контрольной пробе 5 составил 1,89, в опытной пробе 6 (с туберкулином) - 2,0. Используя формулу для расчета ДИФ, получаем: ((1,89-2,0):1,89)×100%=-5,8%. В данном случае (-) указывает, что в опытной пробе показатель СрИФ больше, чем в контрольной. Из этого мы делаем заключение, что в опытной пробе СрИФ меченных ФИТЦ CD45RO повысилась на 5,8%.

Полученные результаты обследования позволяют заключить, что клинические проявления кожной туберкулиновой гиперчувствительности являются следствием аллергической реактивности на компоненты раствора туберкулина (вариант 1 по табл.1).

Пример 2. Пациентка Т., 2002 г.р., вакцинирована БЦЖ, поствакцинальный рубчик 5 мм. Результаты ежегодной плановой туберкулиндиагностики: с 2003 год отмечается повышенный размер папулы после постановки пробы Манту - 8-10 мм. Диагноз: поствакцинальная аллергия.

К 480 мкл периферической гепаринизированной крови из локтевой вены добавляли 120 мкл раствора туберкулина 2ТЕ. Аналогичным способом готовили контрольную пробу, которая содержала 480 мкл гепаринизированной крови данного больного и 120 мкл физ. раствора. Опытную и контрольную пробы плотно закрывали и инкубировали 1 час при температуре 37°С при постоянном встряхивании.

После инкубации:

- к 100 мкл контрольной (проба 1) и 100 мкл опытной (проба 2) пробам добавляют по 5 мкл меченных ФИТЦ МКАТ к CD45 ("Caltag", USA);

- к следующим 100 мкл контрольной (проба 3) и 100 мкл опытной (проба 4) добавляли по 5 мкл меченных ФИТЦ МКАТ к CD45RA ("Caltag", USA);

- к следующим 100 мкл контрольной (проба 5) и 100 мкл опытной (проба 6) добавляли по 5 мкл меченных ФИТЦ МКАТ к CD45RO ("Caltag", USA).

Все 6 проб инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. После инкубации все 6 проб обрабатывали с помощью оборудования и реактивов ImmunoPrep System ("Coulter", USA). Все полученные пробы анализировали с помощью лазерного проточного цитофлюориметра EPICS XL ("Coulter", USA) в режиме лимфогейта.

Уровень УИФ меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов в данном случае в контрольной пробе 1 составил 0,3, в опытной пробе 2 (с туберкулином) - 0,35. УИФ меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов повысилась на 16,66%.

Уровень СрИФ меченных ФИТЦ CD45RA+-лимфоцитов в данном случае в контрольной пробе 3 составил 5,0, в опытной пробе 4 (с туберкулином) - 5,5. Используя формулу для расчета ДИФ, получаем: ((5,0-5,5):5,0)×100%=-10,0%. В данном случае (-) указывает на то, что в опытной пробе показатель СрИФ больше, чем в контрольной. Из этого мы делаем заключение, что в опытной пробе СрИФ меченных ФИТЦ CD45RA+-лимфоцитов повысилась на 10%.

Уровень СрИФ меченных ФИТЦ CD45RO+-лимфоцитов в данном случае в контрольной пробе 5 составил 1,5, в опытной пробе 6 (с туберкулином) - 1,9. Используя формулу для расчета ДИФ, получаем: ((1,5-1,9):1,5)×100%=-26,66%. В данном случае (-) указывает на то, что в опытной пробе показатель СрИФ больше, чем в контрольной. Из этого мы делаем заключение, что в опытной пробе СрИФ меченных ФИТЦ CD45RO+-лимфоцитов повысилась на 26,6%.

Полученные результаты обследования позволяют предположить, что клинические проявления кожной туберкулиновой гиперчувствительности у пациента могут являться следствием пост-БЦЖ-вакцинальной гиперреактивности клеток иммунной системы (вариант II по таблице 1).

Пример 3. Пациент П., 1995 г.р., вакцинирован БЦЖ, поствакцинальный рубчик 5 мм. Направительный диагноз - "вираж туберкулиновых проб с 1999 года". Туберкулиновая чувствительность с 1999 года является нормэргической, монотонной (размеры папулы после ежегодной плановой постановки туберкулиновой пробы Манту находились в пределах 8-12 мм).

К 480 мкл периферической гепаринизированной крови из локтевой вены добавили 120 мкл раствора туберкулина 2ТЕ. Аналогичным способом готовили контрольную пробу, которая содержала 480 мкл гепаринизированной крови данного больного и 120 мкл физ. раствора. Опытную и контрольную пробы плотно закрывали и инкубировали 1 час при температуре 37°С при постоянном встряхивании.

После инкубации:

- к 100 мкл контрольной (проба 1) и 100 мкл опытной (проба 2) пробам добавляют по 5 мкл меченных ФИТЦ МКАТ к CD45 ("Caltag", USA);

- к следующим 100 мкл контрольной (проба 3) и 100 мкл опытной (проба 4) добавляли по 5 мкл меченных ФИТЦ МКАТ к CD45RA ("Caltag", USA);

- к следующим 100 мкл контрольной (проба 5) и 100 мкл опытной (проба 6) добавляли по 5 мкл меченных ФИТЦ МКАТ к CD45RO ("Caltag", USA).

Все 6 проб инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. После инкубации все 6 проб обрабатывали с помощью оборудования и реактивов ImmunoPrep System ("Coulter", USA). Все полученные пробы анализировали с помощью лазерного проточного цитофлюориметра EPICS XL ("Coulter", USA) в режиме лимфогейта.

Уровень УИФ меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов в данном случае в контрольной пробе 1 составил 0,675, в опытной пробе 2 (с туберкулином) - 0,6. Используя формулу для расчета ДИФ, получаем: ((0,675-0,6):0,675)×100%=11,1%. В данном случае получено, что в опытной пробе показатель УИФ меньше, чем в контрольной. Из этого мы делаем заключение, что в опытной пробе УИФ меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов снизилась на 11,1%.

Уровень СрИФ меченных ФИТЦ CD45RA+-лимфоцитов в данном случае в контрольной пробе 3 составил 5,9, в опытной пробе 4 (с туберкулином) - 5,7. Используя формулу для расчета ДИФ, аналогичным образом получаем, что в опытной пробе СрИФ меченных ФИТЦ CD45RA+-лимфоцитов снизилась на 3,4%.

Уровень СрИФ меченных ФИТЦ CD45RO+-лимфоцитов в данном случае в контрольной пробе 5 составил 1,77, в опытной пробе 6 (с туберкулином) - 1,69. Используя формулу для расчета ДИФ, аналогичным образом получаем, что в опытной пробе СрИФ меченных ФИТЦ CD45RO+-лимфоцитов снизилась на 4,5%.

Полученные результаты обследования позволяют заключить, что клинические проявления кожной туберкулиновой гиперчувствительности являются следствием цитотоксического действия компонентов раствора туберкулина 2ТЕ, используемого для постановки пробы Манту (вариант III по таблице 1).

Пример 4. Пациентка Н., 1997 г.р., вакцинирована БЦЖ, поствакцинальный рубчик 5 мм. Атопически отягощенный анамнез. Результаты ежегодной плановой туберкулиндиагностики с 1998 года по 2003 год - отрицательные. С 2003 года отмечается размер папулы после постановки пробы Манту - 8 мм. Диагноз - вираж туберкулиновых проб с 2003 года.

К 480 мкл периферической гепаринизированной крови из локтевой вены добавляли 120 мкл раствора туберкулина 2ТЕ. Аналогичным способом готовили контрольную пробу, которая содержала 480 мкл гепаринизированной крови данного больного и 120 мкл физ. раствора. Опытную и контрольную пробы плотно закрывали и инкубировали 1 час при температуре 37°С при постоянном встряхивании.

После инкубации:

- к 100 мкл контрольной (проба 1) и 100 мкл опытной (проба 2) пробам добавляют по 5 мкл меченных ФИТЦ МКАТ к CD45 ("Caltag", USA);

- к следующим 100 мкл контрольной (проба 3) и 100 мкл опытной (проба 4) добавляли по 5 мкл меченных ФИТЦ МКАТ к CD45RA ("Caltag", USA);

- к следующим 100 мкл контрольной (проба 5) и 100 мкл опытной (проба 6) добавляли по 5 мкл меченных ФИТЦ МКАТ к CD45RO ("Caltag", USA).

Все 6 проб инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. После инкубации все 6 проб обрабатывали с помощью оборудования и реактивов ImmunoPrep System ("Coulter", USA). Все полученные пробы анализировали с помощью лазерного проточного цитофлюориметра EPICS XL ("Coulter", USA) в режиме лимфогейта.

Уровень УИФ меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов в данном случае в контрольной пробе 1 составил 0,62, в опытной пробе 2 (с туберкулином) - 0,34. УИФ меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов в опытной пробе снизилась на 45,2%.

Уровень СрИФ меченных ФИТЦ CD45RA+-лимфоцитов в данном случае в контрольной пробе 3 составил 5,78, в опытной пробе 4 (с туберкулином) - 6,0. Используя формулу для расчета ДИФ, получаем: ((5,78-6,0):5,78)×100%=-3,8%. В данном случае (-) указывает на то, что в опытной пробе показатель СрИФ больше, чем в контрольной. Из этого мы делаем заключение, что в опытной пробе СрИФ меченных ФИТЦ CD45RA+-лимфоцитов повысилась на 3,8%.

Уровень СрИФ меченных ФИТЦ CD45RO+-лимфоцитов в данном случае в контрольной пробе 5 составил 2,16, в опытной пробе 6 (с туберкулином) - 2,16. СрИФ меченных ФИТЦ CD45RO+-лимфоцитов в тест-системе с туберкулином in vitro не изменилась.

Полученные результаты обследования не позволяют исключить состояние инфицированности МБТ (вариант IV по таблице 1).

Областью применения заявляемого способа является лабораторно-диагностическое обследование БЦЖ-вакцинированных детей в процессе проведения противотуберкулезных иммунопрофилактических мероприятий. В частности, назначение заявляемого способа показано в качестве дополнительного при обследовании детей с клиническими проявлениями кожной туберкулиновой гиперчувствительности с целью установления их генеза и в качестве альтернативного - при менеджменте детей с атопическим и/или отягощенным прививочным анамнезом, для которых постановка туберкулиновых проб in vivo сопряжена с возможностью развития опасных для здоровья и жизни побочных реакций.

Следует отметить, что использование заявляемого способа при менеджменте БЦЖ-вакцинированных детей с клиническими проявлениями кожной туберкулиновой гиперчувствительности дает следующие преимущества:

1. Позволяет подтвердить аллергический генез гиперчувствительности к туберкулину, используемому при постановке кожных туберкулиновых проб in vivo.

2. Позволяет установить факт токсического воздействия компонентов раствора туберкулина.

3. Позволяет установить факт пост-БЦЖ-вакцинальной гиперреактивности сенсибилизированных лимфоцитов.

4. Позволяет выявить детей группы риска, у которых не исключено состояние инфицированности МБТ, с целью их дальнейшего дообследования.

Для БЦЖ-вакцинированных детей с атопическим и/или отягощенным прививочным анамнезом использование заявляемого способа в качестве альтернативного дает следующие преимущества:

1. Позволяет оценить специфическую функциональную активность сенсибилизированных лимфоцитов в тест-системе с антигенами МБТ in vitro.

2. Позволяет выявить детей группы риска, у которых не исключено состояние инфицированности МБТ, с целью их дальнейшего дообследования.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Васнева Ж.П., Торопова Н.Е. // Метод проточной цитофлюориметрии (ПЦМ) для определения лекарственной сенсибилизации // Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и фармакологии: Тез. докл. 1-й национальной конференции аллергологов и клинических иммунологов (28-31 января 1997 года). - Москва. - 1997. - С.421.

2. Васнева Ж.П., Торопова Н.Е. // Обследование пациентов с повышенными или сомнительными результатами реакции на внутри- или подкожное введение туберкулина // Современные диагностические технологии на службе здравоохранения: Матер. науч.-практич. конфер., посвященные 10-летию Омского диагностического центра / Под ред. А.В. Кононова, П. Малькова// Омский диагностический центр. - Омск, 1998. - С.120 - 123.

3. Васнева Ж.П. / Диагностическое значение теста на уровень экспрессии CD45 лимфоцитами при лекарственной аллергии: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Челябинск, 1999.

4. Васнева Ж.П., Балмасова И.П. / Разработка методических подходов к оценке воздействия лекарственных препаратов группы антигистаминных и анальгетиков на показатели системы иммунитета периферической крови пациентов с лекарственной аллергией in vitro // Моделирование в медицинских и биологических исследованиях: Сборник научных статей / Под ред. проф. С.М. Бабкина. - Самара; СамГМУ, 1999. - С.33-42.

5. Васнева Ж.П., Балмасова И.П. / Внедрение новых технологий в процесс диагностического обследования больных с лекарственной аллергией // Материалы VI Международного конгресса "Экология и здоровье человека" 12-15 октября 1999 г., г.Самара. - С.45-48.

6. Васнева Ж.П., Беляева Л.В. // Функциональные особенности CD45, CD45RA, CD50 у пациентов с лекарственной гиперчувствительностью к анестезирующим препаратам. Тезисы IX Международного конгресса "Физиология и патология иммунной системы"/ International Jornal on Immunorehabilitation, 2003. - Т.5. - №1. - С.49-50.

7. Васнева Ж.П., Балмасова И.П. // Особенности состояния систем общего и специфического иммунитета у пациентов с лекарственной непереносимостью / Аллергология и иммунология, 2003 г. - №1. - С.41-47.

8. Медуницын Н.В. Вакцинология. - М.: Триада - X, 2004. - 448 с.

9. Червонская Г.П. Прививки: мифы и реальность. Основы вакцинологии. - М., 2002. - 416 с.

10. Ярилин А.А. Основы иммунологии: Учебник. - М.: Медицина, 1999. - 608 с.

11. Koretzky G.A. // Role of the CD45 tyrosine phosphatase in signal transduction in the immune system / FASEB J. - 1993. - №7. - P.420-426.

12. Novak T.J., et al. // Isoforms of the transmembrane tyrosine phosphatase CD45 differentially affect Т cell recognition / Immunity. - 1994. - V.1 - P.109.

13. Trowbridge I.S., Ostergaard H.L., Johnson P. // CD45: a Le - specific member of the protein tyrosine phosphatase family / Biochim. Biophys. Acta. - 1991. - V.1095. - P.46.

14. Torimoto Y., et al., // Activation of the T-cells through a T - cell - specific epitope of CD45 / Cell Immunol. - 1992. - V.145. - P.111.

15. Vasneva J., Toropova N., Sharapov V., Tyavkin V. // Application of a FCM and Mab to CD45 in drug sensibilisation diagnostics at drug allergic patients // 5th West-Pacific Allergy Symposium, Seoul (Korea), June 11-14. - 1997. - P.237-240.

Изобретение относится к области клинической лабораторной диагностики и может быть использовано для определения характера кожной туберкулиновой гиперчувствительности in vitro. Сущность изобретения состоит в том, что характер кожной туберкулиновой гиперчувствительности определяют по изменению интенсивности флуоресценции общелейкоцитарного антигена CD45 и его изоформ CD45RA и CD45RO в опытной пробе (после инкубации периферической крови с раствором туберкулина 2ТЕ) относительно контрольной пробы с физиологическим раствором с использованием меченных ФИТЦ моноклональных антител к указанным антигенам и проточной лазерной цитофлюориметрии. Техническим результатом является разработка способа, позволяющего определять характер кожной туберкулиновой гиперчувствительности in vitro. 1 табл.

Способ определения характера кожной туберкулиновой гиперчувствительности in vitro по уровню интенсивности флюоресценции (ИФ) меченных ФИТЦ CD45+ лимфоцитов, с использованием меченных ФИТЦ моноклональных антител (МКАТ) к общелейкоцитарному антигену CD45, отличающийся тем, что периферическую кровь инкубируют с раствором туберкулина 2ТЕ в качестве опытной пробы и физиологическим раствором в качестве контрольной пробы, добавляют меченные ФИТЦ МКАТ к CD45, и его изоформам CD45RA и CD45RO, инкубируют, измеряют уровень ИФ, определяют изменение ИФ меченых лимфоцитов в опытной пробе относительно контрольной по формуле

и при повышении удельной ИФ CD45+ - лимфоцитов более чем на 25,0% определяют аллергический характер кожной туберкулиновой гиперчувствительности, при повышении средней ИФ CD45RA+ - лимфоцитов более чем на 9,0% и CD45RO+ лимфоцитов более чем на 20,0%, характер кожной туберкулиновой гиперчувствительности определяют как пост-БЦЖ-вакцинальную гиперреактивность сенсибилизированных лимфоцитов, при снижении удельной ИФ CD45+ лимфоцитов менее чем на 20,0%, средней CD45RA+ - лимфоцитов менее чем на 8,5% характер кожной туберкулиновой гиперчувствительности определяют как цитотоксическое воздействие компонентов раствора туберкулина, при снижении удельной ИФ CD45+ - лимфоцитов более чем на 20,0% характер кожной туберкулиновой гиперчувствительности определяют как возможное инфицирование Mycobacterium tuberculosis.