СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И ЕЕ ХАРАКТЕРА in vitro Российский патент 2007 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, в частности к отрасли клинической лабораторной диагностики, и может быть использовано в качестве способа определения специфической гиперчувствительности и ее характера in vitro по динамике удельной (УИФ) и средней интенсивности флюоресценции (СрИФ) меченных ФИТЦ CD45+-клеток в опытной пробе (после инкубации периферической крови с растворами исследуемых веществ) относительно контрольной пробы (инкубация периферической крови с физиологическим раствором) с использованием прямо меченных флюороизотиацианатом (ФИТЦ) моноклональных антител (МКАТ) к общелейкоцитарному антигену CD45 и проточной лазерной иммуноцитофлюориметрии.

Известен способ определения лекарственной гиперчувствительности к препаратам группы антибиотиков, анестетиков и мышечных релаксантов, витаминов in vitro по уровню УИФ меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов, который и был выбран нами в качестве прототипа (заявка на патентование №99123165/14 от 04.11.99). Способ включает инкубацию периферической крови с физиологическим раствором (контрольная проба) и растворами лекарственных препаратов (опытная проба) с использованием меченных ФИТЦ МКАТ ИКО 46 к антигену CD45 ("Биомедспектр", г.Москва), автоматического приготовления лейковзвеси с помощью ImmunoPrepSystem ("Coulter", USA) и лазерную проточную цитофлюориметрию в режиме лимфогейта, где по изменению УИФ меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов в опытной пробе относительно контрольной пробы определяют коэффициент сенсибилизации, при превышении которым соответствующего критического значения (для препаратов группы антибиотиков - 0,5, для анестетиков и мышечных релаксантов - 0,3, для витаминов - 0,3) определяют у пациента наличие гиперчувствительности к исследованному препарату [2, 5, 17].

К достоинствам прототипа можно отнести использование динамики УИФ меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов после инкубации периферической крови с растворами лекарственных препаратов (опытная проба) относительно контрольной пробы с физиологическим раствором in vitro в качестве показателя степени специфической чувствительности на исследованные лекарственные препараты у пациентов с лекарственной гиперчувствительностью [3, 4, 9].

Недостатками прототипа являются:

- во-первых, ограниченный спектр аллергенов, используемых в тест-системе in vitro, включающий только лекарственные препараты группы антибиотиков, анестезирующих средств и витаминов. В связи с этим отсутствуют технические и методические рекомендации по использованию в тест-системе in vitro медикаментов других групп и химических веществ [6, 7];

- во-вторых, отсутствие указаний о диагностической значимости регистрируемого повышения или снижения УИФ меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов после инкубации периферической крови с растворами лекарственных препаратов in vitro относительно уровня контрольной пробы, тогда как нами показано, что как повышение, так и снижение интенсивности флюоресценции меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов в тест-системе с медикаментами in vitro относительно контрольной пробы с физиологическим раствором обладает диагностической значимостью в плане определения характера выявленной лекарственной гиперчувствительности [8];

- в-третьих, использование только режима лимфогейта в процессе регистрации УИФ меченных ФИТЦ CD45+-клеток в тест-системе с медикаментами in vitro, что также ограничивает диагностические возможности теста в плане определения характера специфической гиперчувствительности;

- в-четвертых, использование импортного дополнительного оборудования и реактивов ImmunoPrepSystem ("Coulter", USA) для обработки про6, что делает анализ более дорогостоящим.

Областью применения прототипа является лабораторное обследование пациентов с клиническими проявлениями лекарственной непереносимости в анамнезе.

Использование прототипа в лабораторно-диагностической практике позволяет выявить причинный лекарственный препарат группы антибиотиков, анестезирующих средств и витаминов, оказывающих побочное действие при поступлении в организм, или спрогнозировать вероятность развития побочных реакций на планируемый к употреблению препарат указанных групп [9].

Сущность заявляемого способа заключается в том, что для выявления специфической гиперчувствительности и ее характера in vitro используют динамику УИФ и СрИФ меченных ФИТЦ CD45+-клеток в опытной пробе (после инкубации периферической крови с растворами исследуемых веществ) относительно контрольной пробы (после инкубации периферической крови с физиологическим раствором) с использованием прямо меченных ФИТЦ МКАТ к общелейкоцитарному антигену CD45 и лазерной проточной цитофлюориметрии в режиме лимфо- и лейкогейта.

Погрешность данного способа составляет 1,62 (р<0, 05), норматив контроля сходимости параллельных определений - 1,47 (р<0,05) и норматив контроля воспроизводимости результатов анализа - 2,08 (р<0,05) на всем диапазоне исследований.

В основу заявляемого способа положены фундаментальные исследования морфо-функциональных особенностей антигена CD45, которые показали, что общелейкоцитарный антиген CD45 представляет собой трансмембранный гликопротеин, пронизывающий насквозь цитоплазматическую мембрану всех ядросодержащих клеток крови. Внеклеточная (рецепторная) часть CD45 представлена 4 изоформами (CD45RA, CD45RO, CD45RB, CD45RC), трансмембранная часть CD45 представляет собой канал для потока ионов кальция через мембрану клетки, а внутриклеточная (каталитическая) часть является ферментом тирозинфосфатазой, которая катализирует реакцию фосфорилирования тирозинкиназ р56 и р59, что обеспечивает процесс трансмембранного проведения антигенного сигнала [11, 14, 15, 16].

Находясь в мембранах Т-лимфоцитов, CD45 ассоциирован с антигенраспознающим комплексом: на Th - это [TCR-CD3-CD4] на Ts - это [TCR-CD3-CD8] [13]. Находясь в мембранах В-лимфоцитов, CD45 ассоциирован с CD22, находясь в мембранах лейкоцитов, в числе прочих CD45 ассоциирован с молекулами адгезии и Fcε RI (высокоаффинные рецепторы для иммуноглобулина Е) [10]. Приведенные выше морфо-функциональные особенности антигена CD45 и его ассоциация с другими антигенно-рецепторными комплексами мембраны лимфо- и лейкоцитов позволяют предположить, что динамика CD45 в тест-системе in vitro с причинным аллергеном является показателем состояния специфической гиперчувствительности как на специфической (иммунологической, опосредуемой лимфоцитами), так и на неспецифической (опосредуемой лейкоцитами) стадии ее развития.

Проведенный заявителем поиск по научно-техническим и патентным источникам информации и выбранный из перечня аналогов прототип [2, 17] позволили выявить отличительные признаки в заявляемом техническом решении. Следовательно, заявляемый способ удовлетворяет критерию "новизна".

Проведенный заявителем дополнительный поиск известных технических решений [12] с целью обнаружения в них признаков, сходных с признаками отличительной части формулы заявляемого способа, показал, что эти признаки отсутствуют, следовательно, заявляемое техническое решение удовлетворяет критерию "изобретательский уровень".

Критерий изобретения "клинико-диагностическая применимость" подтверждается тем, что заявляемый способ позволяет использовать его в клинической практике в качестве стандартизованного метода специфической диагностики.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. К 160 мкл периферической гепаринизированной крови из локтевой вены добавляют 40 мкл рабочего раствора исследуемого вещества. Перечень веществ, пригодных к использованию с помощью заявляемого способа включает:

- лекарственные препараты любой групповой принадлежности в виде раствора или водорастворимых форм в 4-кратном рабочем разведении (1 часть лекарственного препарата: 4 части физиологического раствора);

- химические вещества (водорастворимые формы неорганических солей, кислот, щелочей и др.) в рабочем разведении (используется два разведения 1:500 и 1:1000);

- дезинфицирующие средства (водорастворимые формы) в рабочем разведении (используется два разведения 1:500 и 1:1000).

Контрольная проба содержит 160 мкл гепаринизированной крови и 40 мкл физиологического раствора. Опытную и контрольную пробы инкубируют 1 час при температуре 37°С на водяной бане при постоянном встряхивании. После инкубации к 100 мкл контрольной и 100 мкл опытной проб прибавляют меченные ФИТЦ МКАТ к антигену CD45 в концентрациях, указанных фирмой-производителем, и инкубируют в течение 30 минут. После инкубации пробы обрабатывают гемолизирующей смесью ручным способом для получения лейковзвеси без потери жизнеспособности и иммуногенности клеток.

Полученную лейковзвесь анализируют с помощью лазерного проточного цитофлюориметра по отработанным рабочим параметрам [1]. Регистрируют уровень УИФ меченных ФИТЦ СD45+-лимфоцитов (режим лимфогейта) и CD45+-лейкоцитов (режим лейкогейта) в опытной и контрольной пробах.

Степень снижения УИФ меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов в опытной пробе относительно контрольной пробы выражают в виде коэффициента сенсибилизации (КС) по формуле:

Степень повышения УИФ меченных ФИТЦ CD45+- лимфоцитов в опытной пробе относительно контрольной пробы выражают в виде коэффициента сенсибилизации (КС) по формуле:

Оценку степени специфической чувствительности к исследуемому веществу у пациента проводят путем сравнения его значений КС, полученных с использованием заявляемого способа, с нормативными показателями (табл.1).

Таблица 1.Нормативные показатели КСЛекарственные препаратХср.±σДискриминационная концентрация (ДК)Антибиотики0,18±0,030,5Анестезирующие средства0,13±0,030,3Витамины0,19±0,030,3Анальгезирующие средства0,3±0,050,5Антигистаминные средства0,54±0,060,6Прочие (медикаменты, химические, дезинфицирующие и другие вещества)0,20,2

В случае превышения КС пациента соответствующего нормативного показателя заключают, что у обследованного пациента выявлена гиперчувствительность к исследованному веществу.

Оценку характера выявленной специфической гиперчувствительности (аллергическая, псевдоаллергическая) проводят по характеру динамики (повышение или снижение) значений СрИФ меченных ФИТЦ CD45+лимфо- и лейкоцитов в опытной пробе относительно контрольной (табл.2).

Таблица 2.Характер специфической гиперчувствительности по динамике СрИФ меченных ФИТЦ CD45+- лимфо- и лейкоцитов в опытной пробе с исследуемым веществомХарактер специфической гиперчувствительностиДинамика СрИФ меченных ФИТЦ CD45+- лимфоцитовлейкоцитоввариант 1 Неспецифическая токсическаяне изменяетсяснижаетсявариант 2 Псевдоаллергическаяне изменяетсяповышаетсявариант 3 Реагиновая аллергическаяповышаетсяповышаетсявариант 4 Цитотоксическая аллергическаяснижается или 100% - лизис лимфоцитовснижается или 100% - лизис лейкоцитов

В случае, когда у пациента выявлена гиперчувствительность к исследованному веществу (КС пациента > КС нормативного) и регистрируется снижение СрИФ меченных ФИТЦ CD45+-лейкоцитов в опытной пробе относительно контрольной, делаем заключение о неспецифической цитотоксической реактивности на исследованное вещество (вариант 1 по табл.2).

В случае, когда у пациента выявлена гиперчувствительность к исследованному веществу (КС пациента > КС нормативного) и регистрируется повышение СрИФ меченных ФИТЦ CD45+-лейкоцитов в опытной пробе относительно контрольной, делаем заключение о псевдоаллергической реактивности на исследованное вещество (вариант 2 по табл.2).

В случае, когда у пациента выявлена гиперчувствительность к исследованному веществу (КС пациента > КС нормативного) и регистрируется повышение СрИФ меченных ФИТЦ CD45+- лимфо- и лейкоцитов в опытной пробе относительно контрольной, делаем заключение о реагиновой аллергической реактивности на исследованное вещество (вариант 3 по табл.2).

В случае, когда у пациента выявлена гиперчувствительность к исследованному веществу (КС пациента>КС нормативного) и регистрируется снижение СрИФ меченных ФИТЦ CD45+ лимфо- и лейкоцитов или 100%-ный лизис лимфо- и лейкоцитов в опытной пробе относительно контрольной, делаем заключение о цитотоксической аллергической реактивности на исследованное вещество (вариант 4 по табл.2).

Заявляемый способ определения специфической гиперчувствительности и ее характера иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Пациентка К., 1961 г.р., в анамнезе которой отмечается непереносимость анестезирующих препаратов (новокаина, тримекаина) по типу отека Квинке.

Обследовали с использованием заявляемого способа с целью подобрать препарат для местной анестезии.

К 160 мкл периферической гепаринизированной крови из локтевой вены пациентки добавляли 40 мкл рабочего раствора септанеста (8 мкл септанеста +32 мкл физиологического раствора). Контрольная проба содержала 160 мкл гепаринизированной крови и 40 мкл физиологического раствора. Опытную и контрольную пробы инкубировали 1 час при температуре 37°С на водяной бане при постоянном встряхивании. После инкубации к 100 мкл контрольной и 100 мкл опытной проб добавляли по 5 мкл меченных ФИТЦ МКАТ к антигену CD45 ("Caltag", USA) и инкубировали в течение 30 минут. После инкубации пробы обрабатывали гемолизирующей смесью ручным способом для получения лейковзвеси. Полученную лейковзвесь анализировали с помощью лазерного проточного цитофлюориметра EPICS XL ("Coulter", USA) в режиме лимфо- и лейкогейта.

Уровень УИФ меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов в контрольной пробе составил 1,1, в опытной пробе наблюдался 100%-ный лизис лимфоцитов (режим лимфогейта).

Уровень УИФ меченных ФИТЦ CD45+-лейкоцитов в контрольной пробе составил 1,17, в опытной пробе наблюдался 100%-ный лизис лейкоцитов (режим лейкогейта).

Полученные результаты обследования позволяют заключить, что у пациентки выявлена гиперчувствительность к септанесту цитотоксического аллергического характера (вариант 4 по табл.2).

Пример 2.

Пациентка П., 1972 г.р., в анамнезе которой отмечается бронхиальная астма и реакции непереносимости на химические вещества.

Обследовали с использованием заявляемого способа в плане оценки профессиональной вредности химических веществ.

Опытная проба №1 содержала 160 мкл периферической гепаринизированной крови из локтевой вены пациентки и 40 мкл рабочего разведения (1:500) раствора перхлората ртути. Опытная проба №2 содержала 160 мкл крови и 40 мкл рабочего разведения (1:1000) раствора перхлората ртути. Контрольная проба содержала 160 мкл гепаринизированной крови и 40 мкл физиологического раствора. Опытные и контрольную пробы инкубировали 1 час при температуре 37°С на водяной бане при постоянном встряхивании. После инкубации к 100 мкл контрольной, к 100 мкл опытной пробы №1 и к 100 мкл опытной пробы №2 добавили по 5 мкл МКАТ к антигену CD45 ("Caltag", USA) и инкубировали в течение 30 минут. После инкубации пробы обрабатывали гемолизирующей смесью ручным способом для получения лейковзвеси. Полученную лейковзвесь анализировали с помощью лазерного проточного цитофлюориметра EPICS XL ("Coulter", USA) в режиме лимфо- и лейкогейта.

Уровень УИФ меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов в контрольной пробе составил 0,48, в опытной пробе №1 (разведение 1: 500) - 1,1, в опытной пробе №2 (разведение 1:1000) - 1,04 (табл.3).

Таблица 3. Результаты обследования пациентки П. ЛимфогейтЛейкогейт проба 1 (разведение 1:500)проба 2 (разведение 1:1000)проба 1 (разведение 1:500)проба 2 (разведение 1:1000)УИФ в контрольной пробе0,480,48--УИФ в опытной пробе1,11,04--КС0,560,54--СрИФ в контрольнойпробе9,199,194,664,66СрИФ в опытной пробе8,788,24,64,33

КС в опытной пробе №1 составил 0,56, в опытной пробе №2 - 0,54 (табл.3). СрИФ меченных ФИТЦ CD45+-лимфоцитов и лейкоцитов в опытной пробе №1 и 2 снизилась (табл.3).

Полученные результаты обследования позволяют заключить, что у пациентки выявлена аллергическая гиперчувствительность к перхлорату ртути цитотоксического характера (вариант 4 по табл.2).

Областью применения заявляемого способа являются пациенты с лекарственной непереносимостью в анамнезе и пациенты с атопическим анамнезом, контактирующие с химическими и дезинфицирующими веществами, работающие на вредном производстве.

Следует отметить, что использование заявляемого способа определения специфической гиперчувствительности дает следующие преимущества:

1. Позволяет выявлять специфическую гиперчувствительность к любым медикаментам и химическим веществам (водорастворимые формы) в реакции in vitro.

2. Позволяет определять характер выявленной специфической гиперчувствительности (аллергический реагиновый, аллергический цитотоксический, псевдоаллергический или неспецифический цитотоксический).

3. Позволяет удешевить стоимость анализа, засчет использования ручного способа обработки проб гемолизирующей смесью.

Источники информации

1. Васнева Ж.П., Торопова Н.Е. // Фенотипирование лимфоцитов периферической крови здоровых доноров Поволжского региона методом проточой лазерной цитофлюорометрии // Современная диагностика в практике здравоохранения (реалии, проблемы, перспектива): Тез. докл. юбилейной науч.-практ. конференции Самарского диагностического центар (23-24 марта 1995 года). Самара, 1995. - С.96-98.

2. Васнева Ж.П., Торопова Н.Е. // Метод проточной цитофлюорометрии (ПЦМ) для определения лекарственной сенсибилизации // Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и фармакологии: Тез. докл. 1-й национальная конференции аллергологов и клинических иммунологов (28-31 января 1997 года), - Москва. - 1997. - С.421.

3. Васнева Ж.П., Торопова Н.Е., Шарапова М.В. // Определение специфической чувствительности к лекарственным препаратам с использованием общелейкоцитарного антигена CD45 //К 10-летию клинико-диагностического центра Тульской областной больницы. Материалы научно-практической конференции; Под общей редакцией О.Д.Лукичева. - Тула: НИИ НМТ, 1998. - С.52-53.

4. Васнева Ж.П., Торопова Н.Е., Шарапова М.В. // Сравнительная характеристика методов определения лекарственной гиперчувствительности in vitro //К 10-летию клинико-диагностического центра Тульской областной больницы. Материалы научно - практической конференции; Под общей редакцией О.Д.Лукичева. - Тула: НИИ НМТ, 1998. - С.54-55.

5. Васнева Ж.П. / Диагностическое значение теста на уровень экспрессии CD45 лимфоцитами при лекарственной аллергии: Автореф. дис. ...канд. биол. наук. - Челябинск, 1999.

6. Васнева Ж.П., Балмасова И.П. / Разработка методических подходов к оценке воздействия лекарственных препаратов группы антигистаминных и анальгетиков на показатели системы иммунитета периферической крови пациентов с лекарственной аллергией in vitro // Моделирование в медицинских и биологических исследованиях: Сборник научных статей / Под ред. проф. С.М.Бабкина. - Самара; СамГМУ, 1999. - С. 33-42.

7. Васнева Ж.П., Балмасова И.П. / Внедрение новых технологий в процесс диагностического обследования больных с лекарственной аллергией // Материалы VI Международного конгресса "Экология и здоровье человека" 12-15 октября 1999 г., г.Самара. - С.45-48.

8. Васнева Ж.П., Беляева Л.В. // Функциональные особенности CD45, CD45RA, CD50 у пациентов с лекарственной гиперчувствительностью к анестезирующим препаратам. Тезисы IX Международного конгресса "Физиология и патология иммунной системы"/ International Jornal on Immunorehabilitation, 2003. - т.5. - №1. - С.49-50.

9. Васнева Ж.П., Балмасова И.П. // Особенности состояния систем общего и специфического иммунитета у пациентов с лекарственной непереносимостью / Аллергология и иммунология, 2003 г. - №1. - С.41-47.

10. Hook, W.A., Berenstein, E.H., Zinsser, F.U. et al. // Monoclonal antibodies to the leucocyte common antigen (CD45) inhibit IgE - mediated histamine release from human basophyles / J.Immunol. - 1991.- №147. - P.2670-1676.

11. Koretzky G.A. // Role of the CD45 tyrosine phosphatase in signal transduction in the immune system / FASEB J. - 1993. - №7. - P.420-426.

12. Leynadier, F., Rajoely, В., Ghazouani, E., et al. // The diagnosis of anaphylactic reactions to muscle relaxants by flow cytometry / Abstracts of the 52 Annual Meeting AAAAI. - New Orleans. - 1996. - №647.

13. Lugman, M., Bottomly, К. // Activation requirements for CD4+Tcells differing in CD45R expression / J.Immunol. - 1992. - v.149. - P.2300.

14. Novak T.J., et al. // Isoforms of the transmembrane tyrosine phosphatase CD45 differentially affect Т cell recognition / Immunity. - 1994. - v.1 - P.109.

15. Trowbridge I.S., Ostergaard H.L., Johnson P. // CD45: a Le - specific member of the protein tyrosine phosphatase family / Biochim. Biophys. Acta. - 1991. - v.1095. - P.46.

16. Torimoto Y., et al., // Activation of the T-cells through a T - cell - specific epitope of CD45 / Cell Immunol. - 1992. - V. 145. - Р.111.

17. Vasneva J., Toropova N., Sharapov V., Tyavkin V. // Application of a FCM and Mab to CD45 in drug sensibilisation diagnostics at drug allergic patients // 5th West-Pacific Allergy Symposium, Seoul (Korea), June 11-14. - 1997. - Р.237-240.

Изобретение относится к медицине, а именно к отрасли клинической лабораторной диагностики. Сущность изобретения заключается в способе определения специфической гиперчувствительности и ее характера in vitro по динамике удельной (УИФ) и средней интенсивности флюоресценции (СрИФ) меченных ФИТЦ CD45+-клеток после инкубации периферической крови пациента с физиологическим раствором (контрольная проба) и водным раствором исследуемого вещества (опытная проба) с использованием прямо меченных флюороизотиацианатом (ФИТЦ) моноклональных антител (МКАТ) к общелейкоцитарному антигену CD45 и лазерной проточной иммуноцитофлюориметрии. Степень специфической чувствительности определяют путем сравнения коэффициента сенсибилизации пациента с нормативными показателями. Характер выявленной гиперчувствительности (аллергический реагиновый, цитотоксический, псевдоаллергический) к исследуемому веществу оценивают по динамике СрИФ меченных ФИТЦ CD45+- лимфо- и лейкоцитов. Изобретение позволяет выявить специфическую гиперчувствительность к любым медикаментам и химическим веществам (водорастворимые формы) в реакции in vitro; позволяет определять характер выявленной специфической гиперчувствительности; позволяет удешевить стоимость анализа за счет использования ручного способа обработки проб гемолизирующей смесью. 3 табл.

Способ определения специфической гиперчувствительности и ее характера in vitro по динамике удельной и средней интенсивности флюоресценции меченных флюороизотиацианатом CD45+-клеток, включающий инкубацию периферической крови пациента с физиологическим раствором в качестве контрольной пробы и водным раствором исследуемого вещества в качестве опытной пробы, последующее добавление прямо меченных флюороизотиацианатом моноклональных антител к общелейкоцитарному антигену CD45, приготовление лейковзвеси и лазерную проточную иммуноцитофлюориметрию, когда динамику удельной интенсивности флюоресценции меченных флюороизотиацианатом CD45+-лимфоцитов в опытной пробе относительно контрольной оценивают в виде коэффициента сенсибилизации, отличающийся тем, что в тест-системе in vitro используют водорастворимые формы медикаментов в пятикратном разведении, химических и дезинфицирующих веществ в двух разведениях 1:500 и 1:1000; приготовление лейковзвеси проводят ручным способом; анализ проб с помощью лазерной проточной цитофлюориметрии проводят в режиме лимфо- и лейкогейта таким образом, что при снижении средней интенсивности флюоресценции меченных флюороизотиацианатом СD45+-лейкоцитов в опытной пробе относительно контрольной выявленная гиперчувствительность рассматривается как неспецифическая цитотоксическая; при повышении - как псевдоаллергическая; при снижении средней интенсивности флюоресценции меченных флюороизотиацианатом CD45+ лимфо- и лейкоцитов или 100%-ном лизисе лимфо- и лейкоцитов в опытной пробе относительно контрольной - как аллергическая цитотоксическая; при повышении - как аллергическая реагиновая.