ШТАММ А/БАК/РОССИЯ/05 ВИРУСА ПТИЧЬЕГО ГРИППА, ПОДТИП H5N1, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ СРЕДСТВ И МЕТОДОВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ Российский патент 2007 года по МПК C12N7/00 C12R1/93 

Изобретение относится к области вирусологии.

Изобретение может быть использовано в вирусологических, серологических, иммунологических и молекулярно-биологических методах исследования. В частности, при конструировании вакцин, разработке ОТ-ПЦР тест-системы для выявления РНК вируса птичьего гриппа, подтип H5N1 (далее - H5N1), диагностикумов для определения антигена H5N1 и антител к нему с помощью иммуноферментного анализа, а также разработки средств и методов биологической защиты в отношении данного возбудителя.

Вспышки высокопатогенного гриппа птиц (H5N1) наблюдались среди домашней птицы в 9 странах Азии (Камбодже, Китае, Индонезии, Японии, Лаосе, Южной Корее, Малайзии, Таиланде и Вьетнаме) в конце 2003 г. и начале 2004 г. За данный период более чем 100 миллионов голов птиц погибли от заболевания или были уничтожены [1-4].

В период с 30 декабря 2003 г. по 17 марта 2004 г. зарегистрировано 12 подтвержденных случаев инфицирования гриппом птиц (H5N1) человека в Таиланде, во Вьетнаме - 23, общее число летальных исходов составило 24 случая.

Начиная с конца июня 2004 г. о новых вспышках гриппа птиц (H5N1) среди домашней птицы сообщалось странами Азии: Камбоджей, Китаем, Индонезией, Малайзией, Таиландом и Вьетнамом. В период с августа по октябрь 2004 г. спорадические случаи инфицирования людей вирусом H5N1 наблюдались в Вьетнаме и Таиланде. В феврале 2005 г. сообщалось об инфицировании человека H5N1 в Камбодже, а в июле 2005 г. - в Индонезии.

По состоянию на 21 июля 2005 г. всего зафиксировано 109 случаев инфицирования человека гриппом птиц (H5N1) во Вьетнаме (87), Таиланде (17), Камбодже (4) и Индонезии (1), в 55 случаях заболевание закончилось летальным исходом [1-4].

По данным Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору в июле 2005 г. заболевание птиц "птичьим гриппом" на территории Российской Федерации установлено в 14 населенных пунктах пяти районов Новосибирской области, а также в Алтайском крае, Тюменской, Омской и Курганской областях.

На территорию Российской Федерации возбудитель "птичьего гриппа", предположительно, занесен дикими водоплавающими птицами (утками) из Юго-Восточной Азии.

Так, в конце июля 2005 года при исследовании патологоанатомического материала от больных птиц из Новосибирской области специалистами ВЦ НИИМ МО РФ был выделен и идентифицирован вирус гриппа птиц типа А, подтип H5N1, получивший название штамм А/Бак/Россия/05.

Возможность распространения эпизоотии H5N1, а также возможность инфицирования данным возбудителем людей обуславливает необходимость разработки средств как экстренной профилактики и лечения, так и идентификации возбудителя и диагностики вызываемого им заболевания, а также поиска эффективных средств и методов биологической защиты с использованием выделенного штамма А/Бак/Россия/05.

В практике диагностических исследований для решения этих задач наиболее часто применяют серологические и молекулярно-биологические методы, чувствительность и специфичность которых во многом определяется качеством антигенсодержащего субстрата.

Необходимым элементом при конструировании вакцин, диагностических тест-систем для идентификации возбудителя и диагностики вызываемого им заболевания, а также поиска эффективных средств и методов биологической защиты в отношении H5N1 является наличие культуры штамма иммунологически полноценного антигена биологически активного вируса, обладающего выраженными патогенными, иммуногенными и протективными свойствами. Такого рода исследования предполагают разработку методики выделения возбудителя из клинического материала, выбор оптимального субстрата накопления вируса H5N1, получения культуры штамма и рабочих культур, способа концентрирования и очистки, а также метода щадящей инактивации. Кроме того, необходимо провести выбор животных - продуцентов гипериммунных сывороток по отношению к возбудителю H5N1 и методов получения высокоочищенных препаратов антител к нему. Для оценки эффективности имеющихся и разработки новых неспецифических и специфических медицинских средств защиты необходимо выбрать наиболее чувствительный вид животного к возбудителю H5N1, воспроизводящий основные патогенетические синдромы и симптомы заболевания.

Выделенный штамм А/Бак/Россия/05 вируса H5N1 не имеет аналогов в Российской Федерации.

Целью настоящего изобретения является получение штамма А/Бак/Россия/05, предназначенного для разработки средств экстренной профилактики и лечения вызываемого им заболевания (вакцин, химиопрепаратов и т.д.); приготовления антигенсодержащего субстрата для идентификации данного возбудителя и диагностики вызываемого им заболевания в ИФА, а также идентификации РНК вируса H5N1 в ОТ-ПЦР и оценки эффективности средств и методов биологической защиты в отношении возбудителя H5N1.

Сущность изобретения состоит в том, что впервые в Российской Федерации в результате вирусологических исследований выделен в июле 2005 г. вирус птичьего гриппа, подтип H5N1, штамм А/Бак/Россия/05 из патологического материала от больных птиц из Новосибирской области. Штамм А/Бак/Россия/05 обладает биологическими характеристиками, позволяющими использовать его при конструировании иммунобиологических препаратов (диагностических тест-систем, иммуноглобулина, вакцины) и оценке их эффективности.

Титр антигена в РГА после проведенного пассажа на РКЭ составил 1:80. Эталонную культуру штамма хранят в виде лиофильно высушенной суспензии аллантоисной жидкости в 10% растворе сахарозы в дистиллированной воде с 10% желтка куриного яйца и антибиотиками при температуре не выше минус (20±2)°С.

Принадлежность к вирусу птичьего гриппа, подтип H5N1, доказана с помощью ОТ-ПЦР тест-системы, а также путем секвенирования фрагмента генома выделенного штамма возбудителя.

Пример выполнения

Полученный штамм А/Бак/Россия/05 вируса птичьего гриппа обладает нижеописанными характеристиками.

1. Родословная штамма А/Бак/Россия/05 вируса птичьего гриппа представлена в соответствии с чертежом.

2. Число пассажей к моменту паспортизации 1.

3. Стандартные условия выращивания in vivo.

Среда культивирования - размножается в развивающихся куриных эмбрионах 9-11-суточного возраста. Температура культивирования вируса H5N1 (36±1)°С.

4. Биологические свойства штамма

Характеристикой вируса H5N1 является высокая репродуктивная способность в развивающихся куриных эмбрионах. Вызывает гибель РКЭ на первые сутки после инфицирования.

5. Устойчивость штамма

Хранение в течение 3 недель (срок наблюдения) лиофилизированной эталонной культуры штамма А/Бак/Россия/05 при температуре минус (20±2,0)°С не вызывает снижения титра антигена в РГА. Хранение в течение двух месяцев (срок наблюдения) жидкой рабочей культуры штамма А/Бак/Россия/05 при температуре минус (20±2)°С также не вызывает снижение титра антигена в РГА.

6. Контроль контаминации культуры штамма

Грибковая и бактериальная микрофлора в культуре штамма А/Бак/Россия/05 вируса H5N1 отсутствуют.

7. Способ лиофилизации

Аллантоисная жидкость на 10% растворе сахарозы в дистиллированной воде с 10% желтка куриного яйца.

8. Характеристика эталонного штамма А/Бак/Россия/05 вируса H5N1 представлена в таблице.

Таблица - Характеристика эталонного штамма А/Бак/Россия/05 вируса H5N1Наименование и обозначение штаммаМесто получения штаммаХарактеристика штаммаУсловия сохранения штамма на предприятииУсловия пассирования штаммаУсловия получения маточной культуры (первичный посевной вирус)Морфологические свойстваКультуральные свойстваИммуногенные свойстваПатогенные свойстваШтамм А/Бак/ Россия/05 вируса H5N1Выделен в июле 2005 г. в Вирусологическом центре НИИ микробиологии МО РФ из патологоанатомического материала от больных птиц из Новосибирской областиВирионы имеют сферическую форму диаметром 80-100 нм, встречаются нитевидные формы с диаметром 80 нм. Поверхность вириона покрыта шипиками длиной около 10 нмРазмножается в РКЭн/дн/дХранят в лиофильно высушенном состоянии при температуре минус (20±2)°С и ниже в ампулах, запаянных под вакуумом, в виде аллантоисной жидкости на 10% растворе сахарозы в дистиллированной воде с 10% желтка куриного яйцаНа РКЭРКЭ, инфицированные эталонным штаммом на уровне не более 2, 3-го пассажа на РКЭ

Примером наилучшего использования штамма А/Бак/Россия/05 вируса H5N1 может являться его использование в качестве основы для конструирования различных медицинских иммунобиологических препаратов, вакцины, предназначенной для иммунизации человека (сельскохозяйственных животных), ИФА и ПЦР тест-систем, предназначенных для определения антигена вируса H5N1 в сыворотке крови и аспиратах больных людей и сельскохозяйственных животных, ИФА тест-системы, предназначенной для определения антител к вирусу H5N1 в сыворотке крови людей и сельскохозяйственных животных.

Ампулу с культурой штамма извлекают из холодильника, температура хранения минус (20±2)°С. РКЭ инфицируют вирусом H5N1 в объеме от 0,1 до 0,2 мл вируссодержащей суспензии. Продолжительность культивирования составляет 48 часов при температуре (32,5±0,5)°С.

После инкубации эмбрионы помещают на 12 часов в холодильник при плюс 4°С. Затем вскрывают РКЭ и отбирают аллантоисную жидкость. Вирус концентрируют при использовании системы полиэтиленгликоль-6000-NaCl (7% - 0,3 М) в течение 24 часов при температуре (4±2)°С и осаждают центрифугированием при 2500 об·мин^-1 в течение 20 минут. Осадок ресуспендируют в NTE-буфере и вирус осаждают в линейном градиенте концентрации сахарозы от 10 до 60%. Центрифугирование проводят в роторе SW 27 в течение 2,5 часов при 25000 об·мин^-1 при температуре (4±2)°С.

Культуру штамма А/Бак/Россия/05 вируса H5N1 извлекают шприцем из опалесцирующего кольца на границе раздела раствора сахарозы от 10 до 60%-ной концентрации и диализуют против NTE-буфера в течение 24 часов при температуре (4±2)°С.

Полученный препарат представляет собой концентрированный очищенный препарат вируса H5N1 штамм А/Бак/Россия/05, который может быть использован:

- в качестве основы при разработке вакцин для человека и сельскохозяйственных животных;

- в качестве диагностикума в ИФА тест-системах для определения антигена к вирусу H5N1 и антител к нему;

- в качестве положительного контрольного образца в ПЦР тест-системе для выявления РНК вируса H5N1.

Штамм А/Бак/Россия/05 вируса H5N1 депонирован в Специализированную коллекцию вирусов Вирусологического центра НИИ микробиологии Вооруженных сил Российской Федерации за №1141.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Centers for Disease Control and Prevention. Cases of influenza A (H5N1)-Thailand, 2004. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep.- 2004. - Vol.53. - P.100-103.

2. Enserink M., Kaiser J. Avian flu finds new mammal hosts. Science. - 2004.-Vol.305. - P.1385.

3. Keawcharoen J., Oraveerakul K., Kuiken T., Fouchier R., Amonsin A., Payungporn S., et al. Avian influenza H5N1 in tigers and leopards. Emerg. Infect. Dis. - 2004. - Vol.10. - P.2189-2191.

4. Cyranoski D. Bird flu data languish in Chinese journals. Nature. - 2004. - Vol.430. P.955.

Изобретение относится к области вирусологии. Предложен штамм вируса птичьего гриппа, подтип H5N1. Штамм депонирован в Специализированной коллекции вирусов Вирусологического центра НИИ микробиологии Министерства обороны Российской Федерации за №1141. Изобретение может быть использовано в вирусологических, серологических, иммунологических и молекулярно-биологических методах исследования. 1 табл., 1 ил.

Штамм вируса птичьего гриппа, подтип H5N1, депонированный в Специализированную коллекцию вирусов Вирусологического центра НИИ микробиологии Министерства обороны Российской Федерации за №1141 и предназначенный для приготовления на его основе диагностических тест-систем для специфического выявления РНК вируса птичьего гриппа, подтип H5N1, с помощью полимеразной цепной реакции, определения антигена H5N1, антител к нему с помощью иммуноферментного анализа и вакцины, а также разработки средств и методов биологической защиты в отношении данного возбудителя.