ШТАММ А/БАК/РОССИЯ/05 ВИРУСА ПТИЧЬЕГО ГРИППА, ПОДТИП H5N1, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ СРЕДСТВ И МЕТОДОВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ Российский патент 2007 года по МПК C12N7/00 C12R1/93 

Описание патента на изобретение RU2300564C1

Изобретение относится к области вирусологии.

Изобретение может быть использовано в вирусологических, серологических, иммунологических и молекулярно-биологических методах исследования. В частности, при конструировании вакцин, разработке ОТ-ПЦР тест-системы для выявления РНК вируса птичьего гриппа, подтип H5N1 (далее - H5N1), диагностикумов для определения антигена H5N1 и антител к нему с помощью иммуноферментного анализа, а также разработки средств и методов биологической защиты в отношении данного возбудителя.

Вспышки высокопатогенного гриппа птиц (H5N1) наблюдались среди домашней птицы в 9 странах Азии (Камбодже, Китае, Индонезии, Японии, Лаосе, Южной Корее, Малайзии, Таиланде и Вьетнаме) в конце 2003 г. и начале 2004 г. За данный период более чем 100 миллионов голов птиц погибли от заболевания или были уничтожены [1-4].

В период с 30 декабря 2003 г. по 17 марта 2004 г. зарегистрировано 12 подтвержденных случаев инфицирования гриппом птиц (H5N1) человека в Таиланде, во Вьетнаме - 23, общее число летальных исходов составило 24 случая.

Начиная с конца июня 2004 г. о новых вспышках гриппа птиц (H5N1) среди домашней птицы сообщалось странами Азии: Камбоджей, Китаем, Индонезией, Малайзией, Таиландом и Вьетнамом. В период с августа по октябрь 2004 г. спорадические случаи инфицирования людей вирусом H5N1 наблюдались в Вьетнаме и Таиланде. В феврале 2005 г. сообщалось об инфицировании человека H5N1 в Камбодже, а в июле 2005 г. - в Индонезии.

По состоянию на 21 июля 2005 г. всего зафиксировано 109 случаев инфицирования человека гриппом птиц (H5N1) во Вьетнаме (87), Таиланде (17), Камбодже (4) и Индонезии (1), в 55 случаях заболевание закончилось летальным исходом [1-4].

По данным Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору в июле 2005 г. заболевание птиц "птичьим гриппом" на территории Российской Федерации установлено в 14 населенных пунктах пяти районов Новосибирской области, а также в Алтайском крае, Тюменской, Омской и Курганской областях.

На территорию Российской Федерации возбудитель "птичьего гриппа", предположительно, занесен дикими водоплавающими птицами (утками) из Юго-Восточной Азии.

Так, в конце июля 2005 года при исследовании патологоанатомического материала от больных птиц из Новосибирской области специалистами ВЦ НИИМ МО РФ был выделен и идентифицирован вирус гриппа птиц типа А, подтип H5N1, получивший название штамм А/Бак/Россия/05.

Возможность распространения эпизоотии H5N1, а также возможность инфицирования данным возбудителем людей обуславливает необходимость разработки средств как экстренной профилактики и лечения, так и идентификации возбудителя и диагностики вызываемого им заболевания, а также поиска эффективных средств и методов биологической защиты с использованием выделенного штамма А/Бак/Россия/05.

В практике диагностических исследований для решения этих задач наиболее часто применяют серологические и молекулярно-биологические методы, чувствительность и специфичность которых во многом определяется качеством антигенсодержащего субстрата.

Необходимым элементом при конструировании вакцин, диагностических тест-систем для идентификации возбудителя и диагностики вызываемого им заболевания, а также поиска эффективных средств и методов биологической защиты в отношении H5N1 является наличие культуры штамма иммунологически полноценного антигена биологически активного вируса, обладающего выраженными патогенными, иммуногенными и протективными свойствами. Такого рода исследования предполагают разработку методики выделения возбудителя из клинического материала, выбор оптимального субстрата накопления вируса H5N1, получения культуры штамма и рабочих культур, способа концентрирования и очистки, а также метода щадящей инактивации. Кроме того, необходимо провести выбор животных - продуцентов гипериммунных сывороток по отношению к возбудителю H5N1 и методов получения высокоочищенных препаратов антител к нему. Для оценки эффективности имеющихся и разработки новых неспецифических и специфических медицинских средств защиты необходимо выбрать наиболее чувствительный вид животного к возбудителю H5N1, воспроизводящий основные патогенетические синдромы и симптомы заболевания.

Выделенный штамм А/Бак/Россия/05 вируса H5N1 не имеет аналогов в Российской Федерации.

Целью настоящего изобретения является получение штамма А/Бак/Россия/05, предназначенного для разработки средств экстренной профилактики и лечения вызываемого им заболевания (вакцин, химиопрепаратов и т.д.); приготовления антигенсодержащего субстрата для идентификации данного возбудителя и диагностики вызываемого им заболевания в ИФА, а также идентификации РНК вируса H5N1 в ОТ-ПЦР и оценки эффективности средств и методов биологической защиты в отношении возбудителя H5N1.

Сущность изобретения состоит в том, что впервые в Российской Федерации в результате вирусологических исследований выделен в июле 2005 г. вирус птичьего гриппа, подтип H5N1, штамм А/Бак/Россия/05 из патологического материала от больных птиц из Новосибирской области. Штамм А/Бак/Россия/05 обладает биологическими характеристиками, позволяющими использовать его при конструировании иммунобиологических препаратов (диагностических тест-систем, иммуноглобулина, вакцины) и оценке их эффективности.

Титр антигена в РГА после проведенного пассажа на РКЭ составил 1:80. Эталонную культуру штамма хранят в виде лиофильно высушенной суспензии аллантоисной жидкости в 10% растворе сахарозы в дистиллированной воде с 10% желтка куриного яйца и антибиотиками при температуре не выше минус (20±2)°С.

Принадлежность к вирусу птичьего гриппа, подтип H5N1, доказана с помощью ОТ-ПЦР тест-системы, а также путем секвенирования фрагмента генома выделенного штамма возбудителя.

Пример выполнения

Полученный штамм А/Бак/Россия/05 вируса птичьего гриппа обладает нижеописанными характеристиками.

1. Родословная штамма А/Бак/Россия/05 вируса птичьего гриппа представлена в соответствии с чертежом.

2. Число пассажей к моменту паспортизации 1.

3. Стандартные условия выращивания in vivo.

Среда культивирования - размножается в развивающихся куриных эмбрионах 9-11-суточного возраста. Температура культивирования вируса H5N1 (36±1)°С.

4. Биологические свойства штамма

Характеристикой вируса H5N1 является высокая репродуктивная способность в развивающихся куриных эмбрионах. Вызывает гибель РКЭ на первые сутки после инфицирования.

5. Устойчивость штамма

Хранение в течение 3 недель (срок наблюдения) лиофилизированной эталонной культуры штамма А/Бак/Россия/05 при температуре минус (20±2,0)°С не вызывает снижения титра антигена в РГА. Хранение в течение двух месяцев (срок наблюдения) жидкой рабочей культуры штамма А/Бак/Россия/05 при температуре минус (20±2)°С также не вызывает снижение титра антигена в РГА.

6. Контроль контаминации культуры штамма

Грибковая и бактериальная микрофлора в культуре штамма А/Бак/Россия/05 вируса H5N1 отсутствуют.

7. Способ лиофилизации

Аллантоисная жидкость на 10% растворе сахарозы в дистиллированной воде с 10% желтка куриного яйца.

8. Характеристика эталонного штамма А/Бак/Россия/05 вируса H5N1 представлена в таблице.

Таблица - Характеристика эталонного штамма А/Бак/Россия/05 вируса H5N1Наименование и обозначение штаммаМесто получения штаммаХарактеристика штаммаУсловия сохранения штамма на предприятииУсловия пассирования штаммаУсловия получения маточной культуры (первичный посевной вирус)Морфологические свойстваКультуральные свойстваИммуногенные свойстваПатогенные свойстваШтамм А/Бак/ Россия/05 вируса H5N1Выделен в июле 2005 г. в Вирусологическом центре НИИ микробиологии МО РФ из патологоанатомического материала от больных птиц из Новосибирской областиВирионы имеют сферическую форму диаметром 80-100 нм, встречаются нитевидные формы с диаметром 80 нм. Поверхность вириона покрыта шипиками длиной около 10 нмРазмножается в РКЭн/дн/дХранят в лиофильно высушенном состоянии при температуре минус (20±2)°С и ниже в ампулах, запаянных под вакуумом, в виде аллантоисной жидкости на 10% растворе сахарозы в дистиллированной воде с 10% желтка куриного яйцаНа РКЭРКЭ, инфицированные эталонным штаммом на уровне не более 2, 3-го пассажа на РКЭ

Примером наилучшего использования штамма А/Бак/Россия/05 вируса H5N1 может являться его использование в качестве основы для конструирования различных медицинских иммунобиологических препаратов, вакцины, предназначенной для иммунизации человека (сельскохозяйственных животных), ИФА и ПЦР тест-систем, предназначенных для определения антигена вируса H5N1 в сыворотке крови и аспиратах больных людей и сельскохозяйственных животных, ИФА тест-системы, предназначенной для определения антител к вирусу H5N1 в сыворотке крови людей и сельскохозяйственных животных.

Ампулу с культурой штамма извлекают из холодильника, температура хранения минус (20±2)°С. РКЭ инфицируют вирусом H5N1 в объеме от 0,1 до 0,2 мл вируссодержащей суспензии. Продолжительность культивирования составляет 48 часов при температуре (32,5±0,5)°С.

После инкубации эмбрионы помещают на 12 часов в холодильник при плюс 4°С. Затем вскрывают РКЭ и отбирают аллантоисную жидкость. Вирус концентрируют при использовании системы полиэтиленгликоль-6000-NaCl (7% - 0,3 М) в течение 24 часов при температуре (4±2)°С и осаждают центрифугированием при 2500 об·мин-1 в течение 20 минут. Осадок ресуспендируют в NTE-буфере и вирус осаждают в линейном градиенте концентрации сахарозы от 10 до 60%. Центрифугирование проводят в роторе SW 27 в течение 2,5 часов при 25000 об·мин-1 при температуре (4±2)°С.

Культуру штамма А/Бак/Россия/05 вируса H5N1 извлекают шприцем из опалесцирующего кольца на границе раздела раствора сахарозы от 10 до 60%-ной концентрации и диализуют против NTE-буфера в течение 24 часов при температуре (4±2)°С.

Полученный препарат представляет собой концентрированный очищенный препарат вируса H5N1 штамм А/Бак/Россия/05, который может быть использован:

- в качестве основы при разработке вакцин для человека и сельскохозяйственных животных;

- в качестве диагностикума в ИФА тест-системах для определения антигена к вирусу H5N1 и антител к нему;

- в качестве положительного контрольного образца в ПЦР тест-системе для выявления РНК вируса H5N1.

Штамм А/Бак/Россия/05 вируса H5N1 депонирован в Специализированную коллекцию вирусов Вирусологического центра НИИ микробиологии Вооруженных сил Российской Федерации за №1141.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Centers for Disease Control and Prevention. Cases of influenza A (H5N1)-Thailand, 2004. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep.- 2004. - Vol.53. - P.100-103.

2. Enserink M., Kaiser J. Avian flu finds new mammal hosts. Science. - 2004.-Vol.305. - P.1385.

3. Keawcharoen J., Oraveerakul K., Kuiken T., Fouchier R., Amonsin A., Payungporn S., et al. Avian influenza H5N1 in tigers and leopards. Emerg. Infect. Dis. - 2004. - Vol.10. - P.2189-2191.

4. Cyranoski D. Bird flu data languish in Chinese journals. Nature. - 2004. - Vol.430. P.955.

Похожие патенты RU2300564C1

название год авторы номер документа
ШТАММ ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ A/common gull/Chany/2006 H5N1 СУБТИПА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ АНТИГЕНСОДЕРЖАЩЕГО ДИАГНОСТИЧЕСКОГО ИЛИ ВАКЦИННОГО ПРЕПАРАТА 2009
  • Шаршов Кирилл Александрович
  • Курская Ольга Григорьевна
  • Шестопалов Александр Михайлович
  • Зайковская Анна Владимировна
  • Дурыманов Александр Гаврилович
  • Рассадкин Юрий Николаевич
  • Дроздов Илья Геннадиевич
RU2400536C1
ШТАММ ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 СУБТИП Н5N1 ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЛЕЧЕБНЫХ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ ВИРУСА ГРИППА 2008
  • Шестопалов Александр Михайлович
  • Зайковская Анна Владимировна
  • Дурыманов Александр Гаврилович
  • Золотых Сергей Иванович
  • Шаршов Кирилл Александрович
  • Евсеенко Василий Александрович
  • Рассадкин Юрий Николаевич
  • Дроздов Илья Геннадиевич
RU2366709C1
ШТАММ А/КУРИЦА/РОССИЯ/22/07 ВИРУСА ГРИППА А ПТИЦ (Pestis galinarum) ПОДТИПА H5N1 ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА БИОПРЕПАРАТОВ И КОНТРОЛЯ ИММУНОГЕННОСТИ ВАКЦИНЫ 2007
  • Смирнов Валерий Николаевич
  • Зубаиров Муртазали Мухтарович
  • Чуфарова Елена Васильевна
  • Кушнир Анатолий Тимофеевич
  • Киселев Олег Иванович
RU2346982C1
Штамм "Ямал" вируса гриппа птиц рода Alphainfluenzavirus вида Influenza A virus подтипа H5N1 для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики гриппа птиц типа А подтипа Н5 2022
  • Мороз Наталья Владимировна
  • Фролов Сергей Владимирович
  • Жестков Павел Дмитриевич
  • Андрейчук Дмитрий Борисович
  • Чвала Илья Александрович
  • Ручнова Ольга Ивановна
RU2796987C1
ШТАММ ВИРУСА ГРИППА ГКВ 2389 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ И ИНАКТИВИРОВАННОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ 2006
  • Дешева Юлия Андреевна
  • Руденко Лариса Георгиевна
  • Александрова Галина Ибрагимовна
RU2318871C1
Штамм вируса гриппа A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2-субтипа для использования в диагностике вируса гриппа методами РТГА и ПЦР и исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro и in vivo 2015
  • Шаршов Кирилл Александрович
  • Гуляева Марина Александровна
  • Алексеев Александр Юрьевич
  • Шестопалов Александр Михайлович
RU2606030C1
Штамм вируса гриппа A/UNL/HK/2:6/2017 (H5N8) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин 2018
  • Грищенко Вера Ивановна
  • Цыбалова Людмила Марковна
RU2702834C1
ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК МЫШИ Mus. musculus - 4F11, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, ИММУНОРЕАКТИВНОЕ С БЕЛКОМ ГЕМАГГЛЮТИНИНА ВЫСОКОПАТОГЕННОГО ШТАММА virus A/duck/Novosibirsk/56/05 Н5N1 2008
  • Кущ Алла Александровна
  • Климова Регина Рафаиловна
  • Масалова Ольга Владимировна
  • Федорова Наталья Евгеньевна
  • Дерябин Петр Григорьевич
  • Ботиков Андрей Геннадьевич
  • Федякина Ирина Тимофеевна
  • Львов Дмитрий Константинович
RU2384617C1
Штамм вируса гриппа A/Shanghai/HK/6:2/2013 (H7N9) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин 2017
  • Потапчук Марина Валентиновна
  • Сергеева Мария Валерьевна
  • Петров Сергей Владимирович
  • Видяева Инна Геннадьевна
  • Цыбалова Людмила Марковна
RU2664460C1
ШТАММ ВИРУСА ГРИППА A/BLACK-HEADED GULL/KAMCHATKA/123/2013 H11N8-СУБТИПА ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ДИАГНОСТИКЕ ВИРУСА ГРИППА МЕТОДАМИ РТГА И ПЦР И ИССЛЕДОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОТИВОВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ IN VITRO и IN VIVO 2016
  • Шаршов Кирилл Александрович
  • Курская Ольга Григорьевна
  • Алексеев Александр Юрьевич
  • Соболев Иван Андреевич
  • Шестопалов Александр Михайлович
RU2631932C1

Реферат патента 2007 года ШТАММ А/БАК/РОССИЯ/05 ВИРУСА ПТИЧЬЕГО ГРИППА, ПОДТИП H5N1, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ СРЕДСТВ И МЕТОДОВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ

Изобретение относится к области вирусологии. Предложен штамм вируса птичьего гриппа, подтип H5N1. Штамм депонирован в Специализированной коллекции вирусов Вирусологического центра НИИ микробиологии Министерства обороны Российской Федерации за №1141. Изобретение может быть использовано в вирусологических, серологических, иммунологических и молекулярно-биологических методах исследования. 1 табл., 1 ил.

Формула изобретения RU 2 300 564 C1

Штамм вируса птичьего гриппа, подтип H5N1, депонированный в Специализированную коллекцию вирусов Вирусологического центра НИИ микробиологии Министерства обороны Российской Федерации за №1141 и предназначенный для приготовления на его основе диагностических тест-систем для специфического выявления РНК вируса птичьего гриппа, подтип H5N1, с помощью полимеразной цепной реакции, определения антигена H5N1, антител к нему с помощью иммуноферментного анализа и вакцины, а также разработки средств и методов биологической защиты в отношении данного возбудителя.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2007 года RU2300564C1

Храповой механизм привода шагового поворота 1989
  • Горелик Георгий Аркадьевич
  • Островский Валерий Давидович
SU1618956A1
РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ, СОДЕРЖАЩИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫЕ АНТИГЕННЫЕ ЭПИТОПЫ БЕЛКОВ КОРОНАВИРУСА (SARS-CoV), СВЯЗАННОГО С ТЯЖЕЛЫМ ОСТРЫМ РЕСПИРАТОРНЫМ СИНДРОМОМ, И ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ СИНТЕТИЧЕСКИХ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ ДИАГНОСТИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫЕ АНТИГЕННЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ БЕЛКОВ КОРОНАВИРУСА (SARS-CoV), СВЯЗАННОГО С ТЯЖЕЛЫМ ОСТРЫМ РЕСПИРАТОРНЫМ СИНДРОМОМ 2004
  • Бурков А.Н.
  • Уланова Т.И.
  • Обрядина А.П.
  • Пузырев В.Ф.
RU2253870C1

RU 2 300 564 C1

Авторы

Марков Виктор Иванович

Меркулов Вадим Анатольевич

Лыков Максим Валерьевич

Кулиш Владислав Сергеевич

Степанов Николай Николаевич

Коконова Мария Сергеевна

Бережной Анатолий Михайлович

Мельников Денис Геннадьевич

Онищенко Геннадий Григорьевич

Васильев Никифор Трофимович

Максимов Владимир Алексеевич

Даты

2007-06-10Публикация

2005-09-19Подача