СРЕДСТВО, УСИЛИВАЮЩЕЕ ЭФФЕКТ ОБРАБОТКИ ФОКУСИРОВАННЫМ УЛЬТРАЗВУКОМ ВЫСОКОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ, И СПОСОБ СКРИНИНГА ДАННОГО СРЕДСТВА Российский патент 2009 года по МПК A61K49/00 A61P35/00 

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к области медицины и медицинской техники, особенно к области ультразвуковой техники, более конкретно к средству, усиливающему эффект обработки HIFU, которое может увеличивать депонирование акустической энергии в целевом участке в процессе обработки HIFU, а также к способу скрининга средства, усиливающего эффект обработки HIFU.

Уровень техники

Уже известны случаи клинического применения фокусированного ультразвука высокой интенсивности (HIFU) в качестве нового способа лечения опухолей и других заболеваний. В методе HIFU используется фокусированный ультразвук, который обеспечивает депонирование непрерывной высокоинтенсивной энергии в фокусе, что приводит к мгновенному термическому эффекту (65-100°С), эффекту пустотообразования, механическим эффектам и звукохимическим эффектам, вызывая селективный коагуляционный некроз в фокусе и предотвращая пролиферацию, инвазию и метастазирование опухолей.

Показано, что акустическая энергия уменьшается экспоненциально по мере увеличения расстояния передачи ультразвука в организме (Baoqin Lui et al., Chinese Journal of Ultrasound in Medicine, 2002, 18(8):565-568). Кроме того, энергия, высвобождающаяся в процессе передачи ультразвука, в мягких тканях уменьшается вследствие абсорбции, рассеивания, рефракции, дифракции и т.п. в тканях, причем наибольшую ответственность за уменьшение энергии несут тканевые абсорбция и рассеивание (главные редакторы Ruo Feng и Zhibiao Wang, Practical Ultrasound Therapeutics, Science and Technology Reference Publisher of China, Beijing, 2002.14). Следовательно, если HIFU используется для лечения глубоких опухолей большого размера, мишень получает относительно низкое количество акустической энергии. А в результате уменьшения акустической энергии снижается терапевтическая эффективность и увеличивается время обработки.

Хотя терапевтическую эффективность можно повысить путем увеличения мощности передачи медицинского преобразователя, при этом возрастает вероятность ожога тканей, находящихся на пути передачи ультразвука.

Кроме того, в настоящее время в клинике при применении техники HIFU для лечения опухоли печени, передача ультразвука к которой блокируется ребрами, ребра обычно удаляют, чтобы увеличить депонирование энергии в нужном участке и, как следствие, уменьшить время обработки и улучшить терапевтические эффекты. Таким образом, неинвазивность метода HIFU является сомнительной, что нежелательно и для пациентов и для врачей.

Вышеуказанные проблемы ограничивают применение метода HIFU в клинике. Следовательно, технические задачи, связанные с увеличением депонирования энергии в нужном участке и эффективности лечения глубоких опухолей без повреждения окружающей нормальной ткани, находящейся на пути передачи акустической энергии, а также с лечением опухолей печени, блокированных ребрами, без удаления ребер, требуют неотложного решения.

Сущность настоящего изобретения

Целью настоящего изобретения является предоставление средства, усиливающего эффект обработки фокусированным ультразвуком высокой интенсивности (HIFU), которое может увеличивать депонирование акустической энергии в целевом участке в процессе обработки HIFU.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление способа скрининга средства, усиливающего эффект обработки HIFU.

Следующей целью настоящего изобретения является применение средства, усиливающего эффект обработки HIFU, для повышения эффективности техники HIFU.

Для достижения вышеуказанных целей в одном воплощении настоящее изобретение предлагает средство, усиливающее эффект обработки HIFU, где усиливающее средство представляет собой вещество, которое может увеличивать абсорбцию акустической энергии в целевом участке, подлежащем обработке HIFU, после введения в биологический организм, т.е. вещество, которое можно использовать для уменьшения количества акустической энергии, необходимого для повреждения ткани-мишени (как опухолевой, так и неопухолевой ткани), в единице объема ткани в процессе обработки HIFU. В настоящем изобретении типы веществ, используемых в качестве средств, усиливающих эффект обработки HIFU, особо не ограничиваются при условии, что данные вещества могут изменять акустическую среду ткани-мишени и стимулировать абсорбцию и депонирование терапевтической энергии в ткани-мишени, значительно увеличивая показатель эффективности использования энергии (EEF) в ткани-мишени. Итак, средства, усиливающие эффект обработки HIFU, в соответствии с настоящим изобретением могут быть твердыми, жидкими или газообразными.

В данном описании термин "повреждение" относится к существенному изменению физиологического состояния опухолевой ткани, как правило, к коагулирующему некрозу опухолевой ткани. С помощью показателя эффективности использования энергии (EEF) можно определить количество акустической энергии, требующееся для повреждения ткани-мишени, на единицу объема ткани. EEF описывается выражением EEF=ηPt/V (единицы измерения: Дж/мм³) и относится к количеству акустической энергии, требующемуся для повреждения опухолевой ткани, на единицу объема ткани, где η обозначает коэффициент фокусирования преобразователя HIFU, который отражает способность преобразователя фокусировать ультразвуковую энергию, здесь η=0,7; Р обозначает общую акустическую мощность источника HIFU (единицы измерения: Вт), t обозначает общее время обработки HIFU (единицы измерения: сек), а V обозначает объем вызванных HIFU повреждений (единицы измерения: мм³). Вещество, которое после введения значительно снижает EEF ткани-мишени, больше подходит для применения в качестве средства, усиливающего эффект обработки HIFU.

В одном предпочтительном воплощении средство, усиливающее эффект обработки HIFU, уменьшает EEF ткани-мишени после введения. В результате отношение EEF ткани-мишени до введения усиливающего средства (т.е. EEF_{(исходн.)}) к EEF ткани-мишени после введения усиливающего средства (т.е. EEF_{(опытн.)}) выше 1, предпочтительно выше 2 и более предпочтительно выше 4. Верхний предел отношения конкретно не ограничивается, причем предпочтительными являются более высокие значения.

В другом предпочтительном воплощении средство, усиливающее эффект обработки HIFU, представляет собой биосовместимое вещество с размером частиц в интервале от 10 нм до 8 мкм, которое можно вводить путем внутривенного, внутриартериального или местного введения и которое может уменьшать EEF ткани-мишени после введения. Соответственно отношение EEF ткани-мишени до введения усиливающего средства (т.е. EEF_{(исходн.)}) к EEF ткани-мишени после введения усиливающего средства (т.е. EEF_{(опытн.)}) выше 1, предпочтительно выше 2 и более предпочтительно выше 4. Верхний предел отношения конкретно не ограничивается, причем предпочтительными являются более высокие значения.

Средства настоящего изобретения, усиливающие эффект обработки HIFU, могут быть заключены в капсулу из липидной мембраны, белковой мембраны или сахаридной мембраны, или они могут находиться в оголенной, некапсулированной форме. Например, в случае тканей, обогащенных ретикулоэндотелиальными клетками, такими как клетки печени, селезенки и костного мозга, средство, усиливающее эффект обработки HIFU, может быть заключено к капсулу из липидной мембраны, чтобы улучшить специфичность усиливающего средства к мишени. Средство, усиливающее эффект обработки HIFU, можно вводить в оголенном виде, не заключенным в капсулу из липидной мембраны, белковой мембраны или сахаридной мембраны, при условии что внутривенное введение средства, усиливающего эффект обработки HIFU, не вызывает блокады со стороны кровеносных сосудов. Кроме того, чтобы придать средству настоящего изобретения, усиливающему эффект обработки HIFU, специфичность к конкретной опухолевой ткани, такой как опухоль печени, опухоль почек, опухоль костей, рак молочной железы и фиброма матки, к указанному средству можно добавить вещества, имеющие специфическое сродство к опухолевой ткани или опухолевому очагу, такие как опухолеспецифичные антитела.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения средство, усиливающее эффект обработки HIFU, содержит дискретную фазу, состоящую из ядра, заключенного в капсулу из вещества, образующего мембрану, и непрерывную фазу, состоящую из водной фазы. Дискретная фаза однородно распределена в непрерывной фазе, причем размер частиц дискретной фазы варьирует от 10 нм до 8 мкм; вещество, образующее мембрану, является биосовместимым, а ядро состоит из газообразного, жидкого или биосовместимого твердого вещества с частицами нанометрового размера. Такое средство, усиливающее эффект обработки HIFU, подходит для внутривенного введения. Для ясности и удобства средство, усиливающее эффект обработки HIFU, которое состоит из биосовместимого газообразного вещества, заключенного в капсулу из вещества, образующего мембрану, в данном описании называют усиливающим средством в виде "микропузырьков"; средство, усиливающее эффект обработки HIFU, которое состоит из жидкости, заключенной в капсулу из вещества, образующего мембрану, в данном описании называют усиливающим средством в виде "частиц", где жидкость подразделяют на две категории: жидкости, которые не подвергаются фазовому переходу жидкость-газ в интервале температур 38-100°С, и жидкости, которые подвергаются фазовому переходу жидкость-газ в интервале температур 38-100°С (а именно, жидкости, которые превращаются в газ в организме животного или человека в процессе обработки HIFU); средство, усиливающее эффект обработки HIFU, которое состоит из биосовместимого твердого вещества с частицами нанометрового размера, заключенного в капсулу из вещества, образующего мембрану, в данном описании называют "плазмидным" усиливающим средством.

В описанном ранее воплощении количество мембранообразующего вещества, содержащегося в усиливающем средстве, составляет 0,1-100 г/л, предпочтительно 0,5-50 г/л и более предпочтительно 0,5-20 г/л. Мембранообразующее вещество включает в себя: липиды, такие как 3-sn-фосфатидилхолин, 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилглицерина натриевая соль, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин, 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидат натрия, 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин, фосфатидилсерин и гидрированный фосфатидилсерин, холестерин и гликолипид; сахариды, включающие в себя, например, глюкозу, фруктозу, сахарозу, крахмал и продукты его деградации; белки, такие как альбумин, глобулин, фибриноген, фибрин, гемоглобин, продукты деградации растительных белков и т.п.

При использовании усиливающего средства в виде микропузырьков количество газа, содержащегося в усиливающем средстве, составляет 5-200 мл/л, предпочтительно 20-150 мл/л, более предпочтительно 20-100 мл/л. Газ включает в себя, например, воздух, азот, диоксид углерода, газообразный фторуглеводород, такой как перфторэтан, перфторпропан, перфторбутан, газообразные алканы, такие как бутан, циклобутан, гексан, гексафторид серы и т.п.

Ультразвуковые контрастные средства в виде микропузырьков, часто применяющиеся в ультразвуковой визуализации, можно использовать в качестве средства, усиливающего эффект обработки HIFU, настоящего изобретения. Таким образом, настоящее изобретение предлагает применение ультразвуковых контрастных средств в виде микропузырьков в качестве средства настоящего изобретения, усиливающего эффект обработки HIFU.

Если для получения усиливающего средства в виде частиц используется жидкость, не подвергающаяся фазовому переходу жидкость-газ в интервале 38-100°С, например вода, насыщенные жирные кислоты, ненасыщенные жирные кислоты, такие как соевое масло, арахисовое масло и иодированное масло, то количество жидкости, содержащейся в усиливающем средстве, составляет 5-200 г/л, предпочтительно 10-100 г/л, более предпочтительно 20-80 г/л; если используется жидкость, подвергающаяся фазовому переходу жидкость-газ в интервале 38-100°С, например, С₅-С₆ алканы, такие как н-пентан, изо-пентан и т.п., и С₅-С₁₂ фторуглеводороды, такие как перфторпентан, дигидродекафторпентан и т.п., то количество жидкости, содержащейся в усиливающем средстве, составляет 5-200 мл/л, предпочтительно 10-100 мл/л, более предпочтительно 20-80 мл/л.

Например, эмульсия жира для инъекций представляет собой водную эмульсию жира, состоящего из очищенного соевого масла, заключенного в капсулу из фосфолипидной мембраны и диспергированного в воде, которая может использоваться для внутривенных инъекций. В настоящее время данный вид эмульсий является коммерчески доступным и включает в себя, без ограничения, Intralipos® (эмульсия жира для инъекций), OMNILIPID® (эмульсия жира для инъекций) и "эмульсии жира (длинноцепочечного)" или "эмульсии жира (среднецепочечные триглицериды/длинноцепочечные триглицериды)", перечисленные в государственном (Китайском) каталоге основных лекарственных средств. Указанные эмульсии жира можно использовать в качестве средств настоящего изобретения, усиливающих эффект обработки HIFU. Таким образом, настоящее изобретение предлагает применение эмульсий жира в качестве средства настоящего изобретения, усиливающего эффект обработки HIFU.

Используемые для получения плазмидного усиливающего средства биосовместимые твердые вещества с частицами нанометрового размера включают в себя магнитные биовещества с частицами нанометрового размера, такие как суперпарамагнитный оксид железа (SPIO), имеющий частицы нанометрового размера, гидроксилапатит (HAP) с частицами нанометрового размера, карбонат кальция с частицами нанометрового размера и т.п. Как правило, биосовместимые твердые вещества с частицами нанометрового размера имеют размер частиц в интервале от 1 нм до 500 нм, предпочтительно от 1 нм до 200 нм, более предпочтительно от 10 нм до 100 нм.

Кроме того, биосовместимые твердые вещества с частицами нанометрового размера, как указано выше, можно использовать сами по себе в качестве средства, усиливающего эффект обработки HIFU, настоящего изобретения.

В указанном выше воплощении усиливающее средство может содержать эмульгатор. Эмульгатор, как правило, представляет собой вещество, выбранное из группы, состоящей из сложных эфиров этиленгликоля, содержащих один остаток С₁₆-₁₈-жирной кислоты, сложных эфиров диэтиленгликоля, содержащих один остаток С_16-18-жирной кислоты, сложных эфиров диэтиленгликоля, содержащих два остатка С_16-18-жирной кислоты, сложных эфиров триэтиленгликоля, содержащих один остаток С_16-18-жирной кислоты, эмульгаторов на основе эфиров сорбитана и жирных кислот (типа Span), эмульгаторов на основе полисорбата (типа Tween), эмульгаторов на основе монолаурата полиэтиленгликоля, эмульгаторов на основе лаурата полиоксиэтилена, 3-sn-фосфатидилхолина (лецитина), холевой кислоты и т.п. Количество эмульгатора в усиливающем средстве составляет 5-150 г/л. Кроме того, усиливающее средство также может содержать стабилизирующее средство, такое как карбоксиметилцеллюлоза натрия (CMC-Na), глицерин и т.п. Содержание карбоксиметилцеллюлозы натрия в усиливающем средстве может составлять 0,01-10 г/л, предпочтительно 0,05-0,6 г/л, более предпочтительно 0,1-0,3 г/л. Содержание глицерина в усиливающем средстве может составлять 5-100 г/л.

В более предпочтительном воплощении для регулирования значения рН и, следовательно, повышения растворимости усиливающего средства можно использовать неорганические или органические кислоты или основания. При использовании усиливающего средства в виде частиц, которое распределено в жидкости, подвергающейся фазовому переходу жидкость-газ в интервале температур 38-100°С, рН усиливающего средства в виде частиц может составлять 7,0-9,0 предпочтительно 7,5-8,5. рН плазмидного усиливающего средства обычно находится в интервале 3,0-6,5, предпочтительно 5,0-6,0.

Способы получения средства настоящего изобретения, усиливающего эффект обработки HIFU, находящегося в виде ядра, заключенного в капсулу из мембранообразующего вещества, особо не ограничиваются. Как правило, мембранообразующее вещество, заключаемое в капсулу газообразное, жидкое или твердое вещество, эмульгатор, стабилизирующее средство и т.п. смешивают до получения достаточной степени однородности и эмульгируют. Например, эмульсию жира в виде частиц можно получить с помощью способов, описанных в патентной заявке Китая № 97182319.7 (озаглавленной "Эмульсия жира, содержащая восстанавливающий сахар, и способ стерилизации") или в патентной заявке Китая № 02112860.Х (озаглавленной "Эмульсия жира для инъекций и способ получения такой эмульсии"). Фторуглеродную микропузырьковую эмульсию можно получить с помощью способов, описанных в патентной заявке Китая № 96106566.4 (озаглавленной "Ультразвуковое контрастное средство на основе ангидрида декстрозы-альбумина, содержащее перфторуглероды, и способ получения такого средства"), в патентной заявке Китая № 98119011.1 (озаглавленной "Способ получения частицы, используемой для ультразвукового контрастирования, и ультразвукового контрастного средства").

Мембранообразующее вещество, используемое в сочетании со средством настоящего изобретения, усиливающим эффект обработки HIFU, предпочтительно представляет собой биосовместимое и биодеградируемое вещество, такое как липид, который при внутривенном введении усиливающего средства обеспечивает его бесперебойный транспорт через кровоток с последующим быстрым фагоцитозом в тканях человеческого организма с высоким содержанием ретикулоэндотелиальных клеток. Следовательно, в течение определенного времени в тканях организма может накопиться усиливающее средство, значительно повышающее способность ткани поглощать ультразвук, в результате чего может увеличиться депонирование акустической энергии в ткани-мишени при обработке HIFU и, в конечном счете, эффективность клинической обработки HIFU, направленной на удаление опухолевых клеток.

Настоящее изобретение также направлено на способ увеличения депонирования энергии в целевом участке при обработке HIFU, данный способ включает в себя внутривенное введение эффективной дозы усиливающего средства настоящего изобретения путем непрерывной и быстрой ВВ инстилляции или болюсной инъекции пациенту за 0-168 часов до обработки HIFU. Упомянутая выше эффективная доза варьирует в зависимости от типа опухоли, массы пациента, локализации опухоли, объема опухоли и т.п. Однако врач или фармацевт могут легко определить дозу, подходящую для конкретного пациента. Например, при использовании усиливающего средства в виде микропузырьков доза может быть выбрана из интервала 0,005-0,1 мл/кг, предпочтительно 0,01-0,05 мл/кг. При использовании усиливающего средства в виде частиц, распределенного в жидкости, не подвергающейся фазовому переходу жидкость-газ при 38-100°С, доза может быть выбрана из интервала 0,01-5 мл/кг, предпочтительно 0,01-2,5 мл/кг. При использовании усиливающего средства в виде частиц, распределенного в жидкости, подвергающейся фазовому переходу жидкость-газ при 38-100°С, доза может быть выбрана из интервала 0,005-0,1 мл/кг, предпочтительно 0,01-0,05 мл/кг. При использовании плазмидного усиливающего средства доза может быть выбрана из интервала 0,1-10 мл/кг, предпочтительно 0,1-5 мл/кг.

Настоящее изобретение также направлено на способ скрининга средства, усиливающего эффект обработки HIFU, который включает в себя:

(a) измерение показателя эффективности использования энергии (EEF) в биологической ткани с получением EEF_{(исходн.)};

(b) введение в биологическую ткань усиливающего средства-кандидата;

(c) измерение показателя эффективности использования энергии (EEF) в ткани после введения усиливающего средства-кандидата с получением ЕЕF_{(опытн.)};

(d) сравнение ЕЕF_{(опытн.)} и ЕЕF_{(исходн.)} для конкретной ткани и выбор усиливающего средства-кандидата с отношением ЕЕF_{(исходн.)} к ЕЕF_{(опытн.)} выше 1.

Настоящее изобретение также предлагает способ лечения заболеваний, включающий в себя введение пациенту средства, усиливающего эффект обработки HIFU, перед обработкой HIFU с целью повышения способности ткани, обрабатываемой HIFU, поглощать терапевтическую акустическую энергию.

Подробное описание настоящего изобретения

Способ получения и некоторые физикохимические параметры усиливающего средства настоящего изобретения описаны ниже со ссылкой на нижеследующие примеры, а технические эффекты типичного усиливающего средства настоящего изобретения описаны ниже со ссылкой на нижеследующие тесты, проводимые на животных. Следует понимать, что данные примеры приводятся только для иллюстрации и не предназначаются для ограничения объема настоящего изобретения.

Пример I. Получение средства, усиливающего эффект обработки HIFU, в виде частиц

Пример I-1. Капсулирование с применением жидкости, не подвергающейся фазовому переходу жидкость-газ при 38-100°С

Пример I-1-1

Смешивают следующие вещества: 4 г иодированного масла для инъекций (поставляемого Shanghai Chemical Reagent Company), 0,6 г лецитина яичного желтка для инъекций (поставляемого Shanghai Chemical Reagent Company) и 1,25 г глицерина для инъекций (поставляемого Shanghai Chemical Reagent Company), затем полученную смесь растворяют и после нагревания при 70°С получают масляную фазу. К масляной фазе добавляют дистиллированную воду, содержащую 1% (мас./об.) эмульгатора F-68 (поставляемого Sigma Company) с получением конечного объема 17,5 мл. Смесь перемешивают, получая грубодисперсную эмульсию. Грубодисперсную эмульсию выливают в пробирку для кипячения и эмульгируют путем обработки ультразвуком при мощности 350 Вт в течение 2 минут. Полученную однородную эмульсию иодированного масла стерилизуют в потоке пара при 100°С в течение 30 минут. Конечный продукт имеет рН 7,5-8,5, содержание иода 0,13 г/мл, размер частиц менее 1 мкм и осмотическое давление 350 мосм/кг Н₂О.

Примеры I-1-2 - I-1-4

Средства примеров I-1-2 - I-1-4 получают, используя способ и процедуры, описанные в примере I-1-1, за исключением того, что иодированное масло для инъекций заменяют на соевое масло для инъекций, используемое как вещество ядра, а лецитин яичного желтка для инъекций заменяют на лецитин как мембранообразующее вещество. Состав средства, усиливающего эффект обработки HIFU, в виде частиц приведен ниже в таблице 1. Усиливающие средства получают в виде белых эмульсионных жидкостей, которые можно вводить животным и людям путем внутривенной инъекции. Характеристики продуктов также приведены в таблице 1.

Таблица 1   Пример
I-1-2 Пример
I-1-3 Пример
I-1-4 Концентрация соевого масла для инъекций в усиливающем средстве 10% 20% 10% Количество соевого масла для инъекций 100 г 200 г 100 г Количество лецитина для инъекций 12 г 12 г 12 г Количество глицерина для инъекций 22 г 22 г 16,7 г Конечный объем после добавления воды для инъекций 1000 мл 1000 мл 1000 мл рН (c.a.) 8 8 8 Размер частиц дискретной фазы 0,1-2 мкм 1-5 мкм 0,5-2 мкм Осмотическое давление (мосм/кг Н₂О) 300 350 310 Энергия мДж (ккал) 4,6 (1100) 8,4 (2000) 12,6 (3000)

Пример I-2. Капсулирование с применением жидкости, подвергающейся фазовому переходу жидкость-газ при 38-100°С

Пример I-2-1

Нижеследующие вещества смешивают с получением конечного объема 1000 мл: 3% (мас./об.) эмульгатора Pluronic F-68 (поставляемого Sigma Company), 0,5% (мас./об.) лецитина яичного желтка (поставляемого Shanghai Chemical Reagent Company), 5% (об./об.) перфторпентана (поставляемого Sigma Company) и дистиллированную воду. Смесь инкубируют на льду, разминают и диспергируют при 10000 об/мин, получая грубодисперсную эмульсию. Грубодисперсную эмульсию дважды эмульгируют в гомогенизаторе высокого давления при 4°С. Конечную эмульсию с размером частиц менее 1 мкм получают путем фильтрования через мембранный фильтр с диаметром пор 1 мкм. Полученную эмульсию разделяют, помещают во флаконы объемом 15 мл и затем облучают с использованием Co₆₀ при 20 кГр в течение 10 часов. Перед хранением эмульсию, имеющую концентрацию частиц 10⁹/мл, охлаждают.

Пример I-2-2

Нижеследующие вещества смешивают с получением конечного объема 1000 мл: 6% (мас./об.) эмульгатора Pluronic F-68 (поставляемого Sigma Company), 1% (мас./об.) лецитина яичного желтка (поставляемого Shanghai Chemical Reagent Company), 10% (об./об.) перфторпентана (поставляемого Sigma Company) и физиологический раствор. Смесь инкубируют на льду, разминают и диспергируют при 10000 об/мин, получая грубодисперсную эмульсию. Грубодисперсную эмульсию дважды эмульгируют в гомогенизаторе высокого давления при 4°С. Конечную эмульсию с размером частиц менее 1 мкм получают путем фильтрования через мембранный фильтр с диаметром пор 1 мкм. Полученную эмульсию разделяют, помещают во флаконы объемом 15 мл и затем облучают с использованием Co₆₀ при 20 кГр в течение 10 часов. Перед хранением эмульсию, имеющую концентрацию частиц 10⁹/мл, охлаждают.

Примеры I-2-3 - I-2-6

Средства настоящего изобретения на основе фторуглеродсодержащей эмульсии, усиливающие эффект обработки HIFU, получают с помощью способа и процедур, описанных в примере I-2-1, используя указанные в таблице 2 вещества и количества веществ. Характеристики продуктов приведены в таблице 2.

Таблица 2   Пример
I-2-3 Пример
I-2-4 Пример
I-2-5 Пример
I-2-6 Вещество ядра 2% (об./об.)
перфторпентан 5% (об./об.)
перфторгексан 10% (об./об.)
перфторгексан 10% (об./об.)
дигидродекафторпентан Лецитин 1% (мас./об.) 2% (мас./об.) 2% (мас./об.) 2% (мас./об.) Глицерин 1% (мас./об.) 1% (мас./об.) 1% (мас./об.) 1% (мас./об.) Pluronic F-68 5% (мас./об.) 3% (мас./об.) 5% (мас./об.) 5% (мас./об.) Конечный объем после добавления дистиллированной воды 1000 мл 1000 мл 1000 мл 1000 мл рН (c.a.) 6,98 7,01 6,99 7,00 Размер частиц дискретной фазы 0,5-2 мкм 0,5-2 мкм 0,1-2 мкм 1-2 мкм

Пример II. Получение средства, усиливающего эффект обработки HIFU, в виде плазмид

Пример II-1

Смешивают следующие вещества: 2,5 г НАР с размером частиц от 1 нм до 100 нм (поставляемого Engineering Research Center for Biomaterials of Sichuan University), 0,3 г лецитина яичного желтка для инъекций (поставляемого Shanghai Chemical Reagent Company), 0,3 г КМЦ-Na (поставляемой Shanghai Chemical Reagent Company) и дистиллированную воду с получением конечного объема 100 мл. После перемешивания до однородного состояния рН смеси доводят до 5,0 с помощью уксусной кислоты. Смесь обрабатывают ультразвуком в течение 2 минут при мощности 400 Вт, причем излучатель ультразвука находится на 1,5 см ниже поверхности смеси. После обработки ультразвуком получают молочно-белую однородную и стабильную суспензию. Размер частиц дисперсной фазы полученного усиливающего средства варьирует от 10 нм до 1000 нм, как правило, в интервале от 100 нм до 500 нм.

Пример II-2

Смешивают следующие вещества: 2,5 г НАР с размером частиц от 1 нм до 100 нм (поставляемого Engineering Research Center for Biomaterials of Sichuan University), 0,3 г лецитина яичного желтка для инъекций (поставляемого Shanghai Chemical Reagent Company), 1 мл глицерина для инъекций и дистиллированную воду с получением конечного объема 100 мл. После перемешивания до однородного состояния рН смеси доводят до 5,0 с помощью уксусной кислоты. Смесь обрабатывают ультразвуком в течение 2 минут при мощности 400 Вт, причем излучатель ультразвука находится на 1,5 см ниже поверхности смеси. После обработки ультразвуком получают молочно-белую однородную и стабильную суспензию. Размер частиц дисперсной фазы полученного усиливающего средства варьирует от 10 нм до 1000 нм, как правило, в интервале от 100 нм до 500 нм.

Примеры II-3 - II-5

Плазмидные средства настоящего изобретения, усиливающие эффект обработки HIFU, получают с помощью способа и процедур, описанных в примере II-1, используя указанные в таблице 3 вещества и количества веществ. Характеристики продуктов приведены в таблице 3.

Таблица 3   Пример II-3 Пример II-4 Пример II-5 HAP нанометрового размера (размер частиц 25 г/л
(1-500 нм) 25 г/л
(1-500 нм) 50 г/л
(1-500 нм) Лецитин 0,3 г 0,3 г 0,6 г КМЦ-Na 0,3 г 0,6 г 0,3 г Глицерин для инъекций 1 мл 1 мл 2 мл Конечный объем после добавления дистиллированной воды 100 мл 100 мл 100 мл рН (c.a.) 5,0 5,0 5,0 Размер частиц дискретной фазы 10-1000 нм 10-1000 нм 10-1000 нм Осмотическое давление (мосм/кг Н₂О) 275 (изоосмотический) 275 (изоосмотический) 275 (изоосмотический)

Пример III

Гидроксилапатит (НАР) с частицами нанометрового размера, поставляемый Engineering Research Center for Biomaterials of Sichuan University, представляет собой белый порошок, содержащий частицы размером от 10 нм до 200 нм с нормальным распределением. НАР растворяют в 9% физиологическом растворе, получая две молочно-белые суспензии с концентрацией 25 г/л и 50 г/л соответственно. Чтобы достичь однородного диспергирования, перед применением суспензии обрабатывают ультразвуком мощностью 600 Вт.

Тест на животных 1. Совместное применение усиливающего эффект обработки HIFU средства в виде частиц, полученного по способу примера I-1-3, и терапевтического устройства HIFU

Пятьдесят новозеландских белых кроликов (возрастом приблизительно 3 месяца) любого пола, полученных от Laboratory Animals Center of Chongqing University of Medical Sciences, распределяют поровну в группу А и группу В. Кролики в группе А и в группе В весят 2,22±0,21 кг и 2,24±0,19 кг (Р>0,05) соответственно.

Новозеландских белых кроликов анестезируют путем внутримышечной инъекции, прикрепляют их к платформе для обработки системы для лечения опухолей с помощью фокусированного ультразвука высокой интенсивности, модель JC, производимой Chongqing Haifu (HIFU) Technology Co. Ltd., и затем обрабатывают с помощью данной системы. Система для лечения опухолей с помощью фокусированного ультразвука высокой интенсивности, модель JC, состоит из регулируемого источника энергии, двумерной системы контроля ультразвука, терапевтического преобразователя, системы управления механическим движением, платформы для обработки и акустического контактного устройства. Терапевтический преобразователь системы, имеющий рабочую частоту 1 мГц, диаметр 150 мм и фокусное расстояние 150 мм, функционирующий с использованием стандартной дегазированной циркулирующей воды с содержанием газа не более 3 м.д., может доставлять акустическую энергию со средней интенсивностью 5500 Вт/см² в фокальную область 2,3×2,4×26 мм.

Печени кроликов предварительно сканируют с помощью двумерного сканера терапевтической системы HIFU. Анализируют два слоя с интервалом по меньшей мере 2 см при глубине воздействия 2,0 см. У каждого кролика в группе А левая сторона печени (левая/средняя доля) считается контрольной долей (в которую вводят физиологический раствор), а правая сторона печени (правая) считается экспериментальной долей (в которую вводят средство, усиливающее эффект обработки HIFU, полученное по способу примера I-1-3, и которую также называют стороной усиливающего средства). В группе В контрольная и экспериментальная доли располагаются наоборот. Глубина воздействия обработки HIFU (т.е. расстояние от поверхности кожи до фокусной точки) также составляет 2,0 см. После того как слои печени выбраны, физиологический раствор вводят через краевую вену уха со скоростью 50-60 капель/мин. Через 20 минут левую (группа А) или правую (группа В) сторону печени кролика подвергают однократному или многократному импульсу HIFU (длина линии: 1 см, скорость сканирования: 3 мм/сек) и регистрируют изменения в шкале серых тонов и время воздействия на целевой участок. Затем фокусную точку терапевтической системы HIFU перемещают на противоположную сторону. Вместо физиологического раствора внутривенно вводят средство, усиливающее эффект обработки HIFU, полученное в примере I-1-3, при этом скорость и время инъекции остаются такими же, как и для контрольной доли печени. Затем правую (группа А) или левую (группа В) сторону печени кролика подвергают воздействию HIFU. Для обеих сторон печени одного кролика используют одинаковый режим обработки.

Кроликов умерщвляют и анатомируют через 24 часа после обработки. Измеряют размеры (длину, ширину и толщину) участков повреждения зоны коагуляционного некроза печени кроликов. Объем коагуляционного некроза рассчитывают по формуле V=4/3π×1/2 длины×1/2 ширины×1/2 толщины. EEF (показатель эффективности использования энергии) рассчитывают по формуле EEF=ηPt/V (Дж/мм³). Сравнивают значения EEF внутри групп А и В и между группами А и В. η обозначает коэффициент фокусирования преобразователя HIFU, который отражает способность преобразователя фокусировать ультразвуковую энергию, здесь η=0,7; Р обозначает общую акустическую мощность источника HIFU (Вт); t обозначает общее время обработки HIFU (сек); V обозначает объем вызванных HIFU повреждений (мм³). Вещество, которое после введения снижает EEF ткани-мишени, больше подходит для применения в качестве средства настоящего изобретения, усиливающего эффект обработки HIFU. Результаты приведены в таблице 4.

Таблица 4
EEF контрольной и экспериментальной доли   Группа А Группа В Объединенный результат Значение Р Контрольная доля 7,09±4,11 6,67±3,13 6,87±3,60 >0,5* Экспериментальная доля 2,73±1,64 3,43±2,07 3,10±1,89 >0,5* Значение Р <0,001 <0,001 <0,001  

Результаты, приведенные в таблице 4, показывают, что не существует значительных различий между кроликами из группы А и кроликами из группы В, которым вводят физиологический раствор; кроме того, не существует значительных различий между кроликами из группы А и кроликами из группы В, которым вводят средство, усиливающее эффект обработки HIFU, в виде частиц, полученное в примере I-1-3. Однако наблюдаются существенные различия в результатах, полученных для контрольной и экспериментальной доли как в группе А, так и в группе В. При объединении результатов группы А и группы В можно видеть, что EEF в экспериментальной доле значительно ниже. Фактически EEF контрольной доли, в которую вводят физиологический раствор, приблизительно в 2,22 раза выше, чем EEF в экспериментальной доле.

Тест на животных 2. Совместное применение средства, усиливающего эффект обработки HIFU, в виде частиц, полученного по способу примера I-1-1, и терапевтического устройства HIFU

Тридцать новозеландских белых кроликов весом приблизительно 2 кг, полученных от Laboratory Animals Center of Chongqing University of Medical Sciences, произвольно распределяют в экспериментальную и контрольную группы по 15 кроликов в каждой группе. На каждом кролике определяют два участка воздействия. Кроликам контрольной группы вводят физиологический раствор (доза: 2,5 мл/кг) путем быстрой инъекции через краевую вену уха. Кроликам экспериментальной группы вводят эмульгированное иодированное масло, полученное в примере I-1-1 (доза: 2,5 мл/кг) путем быстрой инъекции через краевую вену уха с последующим введением 1 мл физиологического раствора, чтобы удостовериться, что эмульгированное иодированное масло полностью поступило в организм. Через час, используя систему для лечения опухолей с помощью фокусированного ультразвука высокой интенсивности, модель JC, производимую Chongqing Haifu (HIFU) Technology Co. Ltd., облучают печени кроликов контрольной и экспериментальной групп посредством одиночного импульса. Мощность воздействия составляет 220 Вт; частота составляет 1,0 мГц; глубина воздействия составляет 20 мм, обработку останавливают, когда начинается коагуляционный некроз. Результаты измерений обрабатывают с помощью программного обеспечения для статистических вычислений SPSS 10.0 для Windows с использованием теста независимых и парных выборок и выражают в виде среднего значения ± SD. Итоговые данные определяют с помощью критерия хи-квадрат (χ²). Сравнение значений EEF в контрольной и экспериментальной группах приведено в таблице 5.

Таблица 5
Сравнение значений EEF в контрольной и экспериментальной группах Группа N EEF (χ±s) (Дж/мм³) Контрольная группа 30 31,05±2,68 Экспериментальная группа 30 7,16±1,38*

N обозначает число обрабатываемых участков.

* Р<0,001 по сравнению с контрольной группой.

Результаты, приведенные в таблице 5, показывают, что эмульгированное иодированное масло, полученное в примере I-1-1, может значительно уменьшать уровень EEF, необходимый для индуцирования повреждения ткани печени под действием HIFU.

Тест на животных 3. In vitro анализ средства, усиливающего эффект обработки HIFU, в виде частиц, полученного по способу примера I-1-3

Новозеландских белых кроликов (возрастом приблизительно 3 месяца) любого пола, полученных от Laboratory Animals Center of Chongqing University of Medical Sciences, распределяют случайным образом в экспериментальную группу (которой вводят средство, усиливающее эффект обработки HIFU, полученное по способу примера I-1-3), и контрольную группу (которой вводят физиологический раствор). Вес кроликов в двух указанных группах составляет 2,40±0,45 кг и 2,32±0,08 кг (Р>0,5), соответственно. Перед экспериментом кроликов держат на голодной диете в течение 24 часов. Для облучения печени кроликов используют гинекологический терапевтический аппарат HIFU CZF-1, производимый Chongqing Haifu (HIFU) Technology Co. Ltd. Гинекологический терапевтический аппарат HIFU CZF-1 состоит из источника энергии, аппликатора и циркулирующей воды, как описано в патенте Китая № 01144259.Х. В данном тесте используют следующие параметры: мощность 4,05 Вт; частота 11 мГц; импульс 1000 Гц.

Белых кроликов анестезируют путем внутримышечной инъекции и затем кроликам экспериментальной группы через краевую вену уха вводят средство, усиливающее эффект обработки HIFU, полученное по способу примера I-1-3, со скоростью 50-60 капель/мин в течение 20 минут, кроликам контрольной группы вводят физиологический раствор со скоростью 50-60 капель/мин в течение 20 минут.

Через час после трансфузии кроликов прикрепляют к рабочему столу в положении лежа на спине. Всех кроликов подвергают лапаратомии с надрезом 4-5 см в средней части, печень выводят в брюшную полость и извлекают сразу после послойного открывания брюшной стенки. Для каждого воздействия продолжительностью 3 сек, 6 сек и 9 сек определяют один или два участка обработки на каждой доле печени. Затем проводят эксперименты с использованием указанных выше параметров. После генерации повреждений печени кроликов помещают обратно в брюшную полость и брюшную стенку зашивают слой за слоем.

На следующий день кроликов умерщвляют путем введения избыточного количества анестезирующего средства. Печени удаляют и фотографируют. Измеряют размеры повреждения и рассчитывают значения EEF. Все результаты обрабатывают с помощью программного обеспечения для статистических вычислений SPSS 10.0 для Windows с использованием теста независимых выборок и выражают в виде среднего значения ±SD. Результат считается статистически значимым, если значение Р меньше 0,05. В данном тесте контрольная группа содержит 21 участок обработки для каждого воздействия продолжительностью 3 сек, 6 сек и 9 сек, всего 63 (21×3) участка обработки; а экспериментальная группа содержит 30 участков обработки для каждого воздействия продолжительностью 3 сек, 6 сек и 9 сек, всего 90 (30×3) участков обработки. EEF рассчитывают с помощью указанного выше уравнения, результаты приведены в таблице 6.

Таблица 6
EEF в контрольной и экспериментальной группах     Длительность воздействия n 3 сек 6 сек 9 сек Контрольная группа 21 0,2749±0,2409 0,1783±0,0733 0,1846±0,0896 Экспериментальная группа 30 0,1177±0,0609 0,1367±0,0613 0,1463±0,069 Значение Р   <0,01 <0,05 >0,05

Результаты, приведенные в таблице 6, показывают, что при продолжительности воздействия 3 сек, 6 сек и 9 сек EEF в контрольной группе превышает EEF в экспериментальной группе в 2,34, 1,30 и 1,26 раз соответственно. Фактически среднее значение EEF в контрольной группе (3 сек, 6 сек и 9 сек) в 1,59 раз превышает среднее значение EEF в экспериментальной группе (3 сек, 6 сек и 9 сек). Если не учитывать результаты, полученные при продолжительности воздействия 9 сек, когда различие значений EEF в контрольной и экспериментальной группах не является статистически значимым, среднее значение EEF в контрольной группе (3 сек и 6 сек) в 1,78 раз превышает среднее значение EEF в экспериментальной группе (3 сек и 6 сек).

Тест на животных 4. Совместное применение усиливающего эффект обработки HIFU средства в виде частиц, полученного по способу примера I-2-1, и терапевтического устройства HIFU

(1) Исследование повреждения печени новозеландских белых кроликов

Используют двадцать новозеландских белых кроликов весом 2,21±0,56 кг, полученных от Laboratory Animals Center of Chongqing University of Medical Sciences. Кроликам выбривают нижнюю часть груди и за день до исследования делают срединный разрез. Для облучения этих белых кроликов используют систему для лечения опухолей с помощью фокусированного ультразвука высокой интенсивности, модель JC, производимую Chongqing Haifu (HIFU) Technology Co. Ltd. Система для лечения опухолей с помощью фокусированного ультразвука высокой интенсивности, модель JC, состоит из регулируемого источника энергии, двумерной системы контроля ультразвука, терапевтического преобразователя, системы управления механическим движением, платформы для обработки и акустического контактного устройства. Терапевтический преобразователь системы, имеющий рабочую частоту 1 мГц, диаметр 150 мм и фокусное расстояние 150 мм, функционирующий с использованием стандартной дегазированной циркулирующей воды с содержанием газа не более 3 м.д., может доставлять акустическую энергию со средней интенсивностью 5500 Вт/см² в фокальную область 2,3×2,4×26 мм. Используемый в данном исследовании преобразователь имеет диаметр 150 мм, фокусное расстояние 135 мм, рабочую частоту 1,0 мГц и акустическую мощность 200 Вт. Глубина воздействия составляет 20 мм; используют прерывистый одиночный импульс с продолжительностью воздействия 3 сек и интервалом 5 сек. Каждому кролику через краевую вену уха быстро вводят физиологический раствор (0,02 мл/кг) и через 60 сек контрольную сторону печени подвергают воздействию одиночного импульса HIFU. Каждому кролику через краевую вену уха быстро вводят средство, усиливающее эффект обработки HIFU, полученное по способу примера I-2-1 (0,02 мл/кг), и через 60 сек экспериментальную сторону печени того же кролика подвергают воздействию одиночного импульса HIFU. Воздействие ультразвука прекращают, когда в целевом участке регистрируют изменения в шкале серых тонов. Если изменения в шкале серых тонов не наблюдаются, общая продолжительность воздействия не должна превышать 20 сек. Через три дня после обработки ультразвуком кроликов умерщвляют путем перерезания горла и затем анатомируют. Измеряют объем (V) коагуляционного некроза печени кроликов. EEF рассчитывают по формуле EEF=ηPt/V, где t обозначает время воздействия, η=0,7. Среднее значение EEF для контрольной стороны составляет 6,0160, а для экспериментальной стороны - 1,2505. С использованием знакового критерия суммы рангов Уилкоксона определяют Z=-2,485 и Р=0,013. Результаты данного исследования показывают, что фторуглеродная эмульсия увеличивает эффективность HIFU, вызывая повреждение печени кроликов. Фактически среднее значение EEF для контрольной стороны в 4,81 раз выше, чем среднее значение EEF для экспериментальной стороны.

(2) Исследование повреждений печени коз

Используют двадцать Нанкинских желтых коз весом 22,25±4,51 кг. В день исследования козам выбривают правую часть груди и правую часть брюшной полости. Для облучения желтых коз используют систему для лечения опухолей с помощью фокусированного ультразвука высокой интенсивности, модель JC, производимую Chongqing Haifu (HIFU) Technology Co. Ltd. Используемый в данном исследовании преобразователь имеет диаметр 150 мм, фокусное расстояние 135 мм, рабочую частоту 0,8 мГц и акустическую мощность 220 Вт. Глубина воздействия составляет 30 мм; используют прерывистый одиночный импульс с продолжительностью воздействия 3 сек и интервалом 5 сек. Ребра ни у одной козы не удаляют. Перед воздействием HIFU проводят предварительное сканирование и выбирают области воздействия, включающие в себя 4 плоскости. На каждой плоскости устанавливают один участок обработки и определяют уровень прозрачности ребер с помощью двумерного ультразвука. Каждой козе через краевую вену уха быстро вводят физиологический раствор (0,02 мл/кг) и через 60 сек два участка обработки на контрольной стороне печени каждой козы подвергают воздействию HIFU. Каждой козе через краевую вену уха быстро вводят средство, усиливающее эффект обработки HIFU, полученное по способу примера I-2-1 (0,02 мл/кг), и через 60 сек два участка обработки на экспериментальной стороне печени каждой козы подвергают воздействию HIFU. Если в целевом участке регистрируют изменения в шкале серых тонов, воздействие повторяют еще 4 или 5 раз. Если изменения в шкале серых тонов не наблюдаются, общая продолжительность воздействия не должна превышать 200 сек. Через три дня после обработки ультразвуком коз умерщвляют и анатомируют. Измеряют объем (V) коагуляционного некроза печени коз. EEF рассчитывают по формуле EEF=ηPt/V, где t обозначает время воздействия, η=0,7. При использовании сочетания HIFU и фторуглеродной эмульсии среднее значение EEF для контрольной стороны является очень большим, а для экспериментальной стороны составляет 5,1904. С использованием знакового критерия суммы рангов Уилкоксона определяют Р=0,004. Результаты данного исследования показывают, что эффективность индуцирования повреждений печени коз под действием HIFU значительно повышается при использовании фторуглеродной эмульсии без удаления ребер.

(3) Исследование повреждений почек коз

Используют двадцать Нанкинских желтых коз весом 22,25±4,51 кг. В день исследования козам выбривают правую часть груди и правую часть брюшной полости. Для облучения желтых коз используют систему для лечения опухолей с помощью фокусированного ультразвука высокой интенсивности, модель JC, производимую Chongqing Haifu (HIFU) Technology Co. Ltd. Используемый в данном исследовании преобразователь имеет диаметр 150 мм, фокусное расстояние 135 мм, рабочую частоту 0,8 мГц и акустическую мощность 220 Вт. Глубина воздействия составляет 20 мм; используют прерывистый одиночный импульс с продолжительностью воздействия 3 сек и интервалом 5 сек. Ребра ни у одной козы не удаляют. Перед воздействием HIFU проводят предварительное сканирование и выбирают области воздействия, включающие в себя 1 плоскость в верхней части почки и 1 плоскость в нижней части почки соответственно. На каждой плоскости устанавливают один участок обработки и осуществляют наблюдение с помощью двумерного ультразвука. Если правые ребра становятся помехой, их обходят. Каждой козе через краевую вену уха быстро вводят физиологический раствор (0,02 мл/кг) и через 30 сек контрольную сторону почек козы подвергают одиночному импульсу HIFU. Каждой козе через краевую вену уха быстро вводят средство, усиливающее эффект обработки HIFU, полученное по способу примера I-2-1 (0,02 мл/кг), и через 60 сек экспериментальную сторону почек козы подвергают воздействию HIFU. Если в целевом участке регистрируют изменения в шкале серых тонов, воздействие повторяют еще 3 или 4 раза. Если изменения в шкале серых тонов не наблюдаются, общая продолжительность воздействия не должна превышать 150 сек. Через три дня после обработки ультразвуком коз умерщвляют и анатомируют. Измеряют объем (V) коагуляционного некроза печени коз. EEF рассчитывают по формуле EEF=ηPt/V, где t обозначает время воздействия, η=0,7. Значение EEF для экспериментальной стороны составляет 10,58±3,95, а для контрольной стороны - 486,37±215,41. С использованием знакового критерия суммы рангов Уилкоксона определяют Р=0,008. Результаты данного исследования показывают, что фторуглеродная эмульсия увеличивает способность HIFU вызывать повреждения в нормальных почках коз. Фактически среднее значение EEF для контрольной стороны более чем в 40 раз превышает среднее значение EEF для экспериментальной стороны.

Тест на животных 5. Совместное применение плазмидного средства, усиливающего эффект обработки HIFU, полученного по способу примера II-1, и терапевтического устройства HIFU

Тридцать шесть новозеландских белых кроликов весом приблизительно 2 кг, полученных от Laboratory Animals Center of Chongqing University of Medical Sciences, произвольно распределяют в контрольную и две экспериментальные группы, получающие средство, усиливающее эффект обработки HIFU, по 12 кроликов в каждой группе. Кроликам контрольной группы вводят физиологический раствор (2 мл/кг) путем быстрой инъекции через краевую вену уха. Кроликам экспериментальной группы вводят средство, полученное в примере II-1 (2 мл/кг), путем быстрой инъекции через краевую вену уха с последующим введением 1 мл физиологического раствора, чтобы удостовериться, что средство полностью поступило в организм. Две экспериментальные группы подвергают воздействию HIFU через 24 часа и через 48 часов после введения средства. Группу, которую подвергают воздействию HIFU через 24 часа после инъекции, называют первой экспериментальной группой, а группу, которую подвергают воздействию HIFU через 48 часов после инъекции, называют второй экспериментальной группой. Печени кроликов контрольной и двух экспериментальных групп облучают посредством одиночного импульса, используя систему для лечения опухолей с помощью фокусированного ультразвука высокой интенсивности, модель JC, производимую Chongqing Haifu (HIFU) Technology Co. Ltd. Система для лечения опухолей с помощью фокусированного ультразвука высокой интенсивности, модель JC, состоит из регулируемого источника энергии, двумерной системы контроля ультразвука, терапевтического преобразователя, системы управления механическим движением, платформы для обработки и акустического контактного устройства. Терапевтический преобразователь системы, имеющий рабочую частоту 1 мГц, диаметр 150 мм и фокусное расстояние 150 мм, функционирующий с использованием стандартной дегазированной циркулирующей воды с содержанием газа не более 3 м.д., может доставлять акустическую энергию со средней интенсивностью 5500 Вт/см² в фокальную область 2,3×2,4×26 мм. В данном исследовании акустическая мощность, используемая для обработки, составляет 220 Вт, частота составляет 1,0 мГц, глубина воздействия составляет 20 мм, а продолжительность воздействия составляет 15 секунд. После обработки HIFU животных умерщвляют и анатомируют. Измеряют размеры коагуляционного некроза в целевом участке. Значения EEF, необходимые для продуцирования определенного коагуляционного некроза в печени кроликов контрольной и двух экспериментальных групп, приведены в таблице 7.

Таблица 7 Группа Число участков обработки V(мм³) EEF
(Дж/мм³) Контрольная группа 24 582,50±353,93 7,39±4,99 Первая экспериментальная группа 45 1281,56±884,56 2,71±1,29 Вторая экспериментальная группа 17 1525,63±1007,46 2,25±1,61

Как показано в таблице 7, объем коагуляционного некроза, индуцированного в обеих экспериментальных группах под действием обработки HIFU, проводимой в одинаковых условиях либо через 24 часа, либо через 48 часов после инъекции, с одинаковой длительностью воздействия, превышает объем коагуляционного некроза, наблюдающегося в контрольной группе, а требуемое значение EEF в экспериментальных группах значительно ниже, чем в контрольной группе. Различия в значениях объема коагуляционного некроза и EEF в контрольной и экспериментальных группах являются статистически значимыми (Р<0,05).

Тест на животных 6. In vivo исследование плазмидного средства, усиливающего эффект обработки HIFU, полученного по способу примера III

Сорок новозеландских белых кроликов любого пола весом приблизительно 2,7±0,3 кг, полученных от Laboratory Animals Center of Chongqing University of Medical Sciences, произвольно распределяют в три группы, получающие НАР, и одну контрольную группу по 10 кроликов в каждой группе.

За двадцать четыре часа до обработки HIFU каждому кролику в группах, получающих НАР, вводят суспензии, содержащие разные концентрации НАР, полученного по способу примера III, путем быстрой инъекции (<5 сек) через краевую вену уха в количестве 2-3 мл на 1 кг массы тела. Затем им вводят 1 мл физиологического раствора, чтобы удостовериться, что суспензия полностью поступила в организм. Каждому кролику контрольной группы вводят физиологический раствор (2 мл/кг) путем быстрой инъекции через краевую вену уха. У кроликов оголяют правую сторону груди и живота путем обработки 8% раствором сульфида натрия. Перед обработкой HIFU кроликов анестезируют внутримышечной инъекцией сумианксина (0,2 мл/кг) и в асептических условиях разрезают брюшную стенку, полностью открывая печень.

Для облучения печени кроликов используют гинекологический терапевтический аппарат HIFU CZF-1, производимый Chongqing Haifu (HIFU) Technology Co. Ltd. Гинекологический терапевтический аппарат HIFU CZF-1 состоит из источника энергии, аппликатора и циркулирующей воды, как описано в патенте Китая № 01144259.Х. В данном тесте используют следующие параметры: частота: 9,85 мГц, мощность: 5 Вт, фокусное расстояние: 4 мм, режим обработки: воздействие одиночного импульса. Для каждой печени устанавливают три участка воздействия для одного цикла и применяют 2 или 3 цикла воздействия. Продолжительность воздействия составляет 10 секунд. После обработки HIFU разрез зашивают. Через двадцать четыре часа кроликов умерщвляют путем быстрой инъекции 10 мл воздуха через краевую вену уха. Измеряют размеры коагуляционного некроза в целевом участке и рассчитывают EEF.

Для сравнения значений, полученных в разных группах, используют t-тест и сравнительный анализ.

Серо-белая зона коагуляционного некроза, имеющая форму горошины, появляется в обрабатываемом участке сразу после воздействия HIFU, причем наблюдаются четкие границы между поврежденной и нормальной тканью. Кроликов в указанных группах подвергают воздействию HIFU с одинаковой продолжительностью, после этого объем фокальных участков (коагуляционного некроза) в группах, получающих разные дозы НАР, превышает объем фокальных участков в контрольной группе, получающей физиологический раствор; требуемое значение EEF в группах, получающих НАР, значительно ниже, чем в контрольной группе, причем различия в значениях, полученных для групп, получающих НАР, и для контрольной группы являются в высокой степени статистически значимыми (Р<0,001). Путем сравнения групп, получающих разные дозы НАР нанометрового размера, показано, что при повышении дозы НАР объем образующихся фокальных участков (зон коагуляционного некроза) значительно увеличивается; требуемые значения EEF в группах, получающих НАР, значительно ниже, причем различия имеют высокую статистическую значимость (Р<0,001). В таблице 8 приведены значения объема фокальных участков (зон коагуляционного некроза) и EEF в группах, получающих разные дозы НАР, после обработки HIFU

Таблица 8 Группа Доза n V
(мм³) EEF
(Дж/мм³) Контрольная группа 2 мл/кг 30 95,3±21,6 0,39±0,09 Группа 1, получающая НАР 50 мг/кг 30 153,1±41,8 0,24±0,05 Группа 2, получающая НАР 100 мг/кг 25 223,2±55,1 0,19±0,01 Группа 3, получающая НАР 150 мг/кг 21 287,7±47,9 0,13±0,00

Примечание: "n" в данной таблице обозначает число участков обработки.

Проведенное исследование позволяет сделать вывод, что НАР нанометрового размера может значительно усиливать терапевтические эффекты HIFU in vivo и что эффективность обработки HIFU возрастает при увеличении дозы НАР.

Тест на животных 7. In vitro анализ плазмидного средства, усиливающего эффект обработки HIFU, полученного по способу примера III

Восемьдесят здоровых новозеландских кроликов весом 2,5±0,3 кг любого пола, полученных от Laboratory Animals Center of Chongqing University of Medical Sciences, держат на голодной диете в течение 24 часов перед обработкой HIFU. Затем каждому кролику вводят молочно-белую суспензию НАР с концентрацией 25 г/л, полученную в примере III (2 мл/кг), путем быстрой инъекции через краевую вену уха с последующим введением 1 мл физиологического раствора. Печени кроликов сканируют с помощью HIFU через 24 часа (20 кроликов), 48 часов (25 кроликов), 72 часа (10 кроликов) и 168 часов (15 кроликов) после введения НАР соответственно. Десяти кроликам контрольной группы вводят физиологический раствор (2 мл/кг) и печени сканируют с помощью HIFU через 24 часа после введения физиологического раствора. Перед обработкой HIFU у кроликов оголяют правую сторону груди и живота путем обработки 8% раствором сульфида натрия. Кроликов анестезируют внутримышечной инъекцией сумианксина (0,2 мл/кг) и обрабатывают с использованием системы для лечения опухолей с помощью фокусированного ультразвука высокой интенсивности, модель JC-А.

Система для лечения опухолей с помощью фокусированного ультразвука высокой интенсивности, модель JC-А, поставляется Institute of Ultrasound Engineering in Medicine, Chongqing University of Medical Sciences, производство данной системы утверждено State Food and Drug Administration in China с регистрационным № 99-301032. Данная система состоит из устройства позиционирования и контролирования ультразвука в режиме реального времени и терапевтического аппарата. В качестве акустического контактного средства используется циркулирующая дегазированная вода, содержание газа в которой составляет менее 3×10⁶. Используют следующие терапевтические параметры: мощность 220 Вт, частота: 1 мГц, фокусное расстояние: 150 мм и фокусная длина: 12 мм. Терапевтический аппликатор может свободно передвигаться в направлении осей X, Y и Z.

Область груди и живота каждого кролика погружают в циркулирующую дегазированную воду и с помощью двумерного ультразвука получают четкое изображение печени. В каждой печени можно установить один или два участка, которые подвергают воздействию одиночного импульса. Каждый участок обработки подвергают воздействию с фиксированной продолжительностью 15 сек и глубиной 20 мм. Через 24 часа после обработки HIFU кроликов умерщвляют путем быстрой инъекции 10 мл воздуха через краевую вену уха, после чего печень выводят на поверхность и надрезают вдоль пути ультразвука, чтобы показать сечение участка максимального коагуляционного некроза. Затем определяют форму участка максимального коагуляционного некроза и измеряют его размеры путем окрашивания ТТС. Затем рассчитывают EEF.

Для сравнения значений, полученных в разных группах, используют t-тест и сравнительный анализ.

После обработки в одинаковых условиях размеры участков коагуляционного некроза в группах, получающих НАР нанометрового размера, превышают размеры участков в контрольной группе (р<0,05); значения EEF, необходимые для обработки HIFU, в группах, получающих НАР, значительно ниже, чем в контрольной группе. Кроме того, в группах, получающих НАР, максимальный размер участков коагуляционного некроза и соответственно минимальные значения требуемого EEF наблюдаются через 24 часа и через 48 часов после введения НАР. Вероятно, наивысшей эффективности можно достичь при проведении HIFU через 24 и 48 часов после инъекции НАР. Если период времени между введением НАР и воздействием HIFU увеличивается, то размер образующихся участков некроза становится меньше. Тем не менее, показано, что даже через две недели после инъекции НАР обработка HIFU имеет более высокую эффективность, чем в контрольной группе (р<0,05) (см. таблицу 9).

Таблица 9
Сравнение групп НАР, получающих воздействие HIFU через разные промежутки времени после введения НАР, с контрольной группой Интервалы времени после введения НАР n Средний период воздействия (сек) Средний объем фокального участка
(мм³) Среднее значение EEF
(Дж/мм³) Контрольная группа 16 15 546,67 7,39±4,99 24 часа 57 15,88 1291,56 2,68±1,29 48 часов 17 15,6 1525,63 2,32±1,61 72 часа 27 16,15 1153,26 3,28±1,35 168 часов 26 15 920 2,51±0,87

Примечание: "n" в данной таблице обозначает число участков обработки.

Проведенные эксперименты позволяют сделать вывод, что НАР нанометрового размера может значительно усиливать терапевтические эффекты HIFU in vitro и что обработка HIFU является более эффективной, если ее проводят через 48-72 часа после введения НАР.

Тест на животных 8. Совместное применение средства, усиливающего эффект обработки HIFU, в виде микропузырьков, и терапевтического устройства HIFU

Сорок новозеландских белых кроликов весом приблизительно 2 кг произвольно распределяют в контрольную и экспериментальную группы по 20 кроликов в каждой группе. Кроликам контрольной группы вводят физиологический раствор (0,05 мл/кг). Кроликам экспериментальной группы вводят ультразвуковое контрастное средство в виде микропузырьков Quanfuxian, полученное от Nan Fang Hospital (0,05 мл/кг), путем быстрой инъекции через краевую вену уха с последующим введением 1 мл физиологического раствора, чтобы удостовериться, что средство полностью поступило в организм. Через одну минуту, используя систему для лечения опухолей с помощью фокусированного ультразвука высокой интенсивности, модель JC, производимую Chongqing Haifu (HIFU) Technology Co. Ltd., облучают печени кроликов. Мощность воздействия составляет 200 Вт при частоте 1,0 мГц, глубина воздействия составляет 20 мм при конкретном периоде воздействия. Через три дня измеряют размеры повреждений, индуцированных в печени кроликов, и рассчитывают значения EEF. Результаты измерений обрабатывают с помощью программного обеспечения для статистических вычислений SPSS 10.0 для Windows с использованием теста независимых и парных выборок и выражают в виде среднего значения ±SD. Итоговые данные определяют с помощью критерия хи-квадрат (χ²). Результаты приведены в нижеследующей таблице 10.

Таблица 10
Значения EEF в контрольной и экспериментальной группах Группа EEF (Дж/мм³) Контрольная группа 12,83±10,99 Экспериментальная группа 2,70±1,29*

* Р<0,001 по сравнению с контрольной группой.

Результаты, приведенные в таблице 10, показывают, что средство, усиливающее эффект обработки HIFU, в виде микропузырьков может значительно уменьшать уровень EEF, необходимый для индуцирования повреждения ткани печени под действием HIFU.

Применение в промышленности

Средство, усиливающее эффект обработки фокусированным ультразвуком высокой интенсивности (HIFU), настоящего изобретения может изменять акустическую среду в целевом участке и уменьшать акустическую энергию, необходимую для индуцирования повреждений в ткани-мишени (как опухолевой, так и неопухолевой ткани) на единицу объема ткани под действием HIFU. Соответственно глубокие опухоли большого размера можно лечить с помощью HIFU более эффективно при определенной мощности звука, не вызывая при этом повреждения нормальных тканей, находящихся на пути ультразвука. Средство, усиливающее эффект обработки HIFU, настоящего изобретения позволяет эффективно использовать HIFU для лечения пациентов с опухолью печени, путь ультразвука к которой блокируется ребрами, без удаления ребер.

Хотя настоящее изобретение описано со ссылкой на предпочтительные воплощения, приведенное выше описание воплощений не предназначено для ограничения объема настоящего изобретения. Следует понимать, что специалисты в данной области могут легко осуществить разные модификации и изменения в пределах объема настоящего изобретения. Объем настоящего изобретения определяется формулой изобретения.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к средствам, усиливающим эффект обработки фокусированным ультразвуком высокой интенсивности (HIFU). Средство, усиливающее эффект обработки HIFU, предназначенное для HIFU-терапии, представляет собой вещество, которое может уменьшать уровень энергии HIFU в целевом участке (EEF), содержащее дискретную фазу, состоящую из ядра, заключенного в капсулу из мембранообразующего вещества; и непрерывную фазу, состоящую из водной среды, при этом дискретная фаза однородно распределена в непрерывной фазе. Способ обработки целевого участка методом HIFU заключается во внутривенном введении эффективной дозы указанного усиливающего средства посредством непрерывной и быстрой внутривенной инсталляции или болюсного вливания пациенту за 0-168 часов до применения HIFU-терапии. Способ скриннинга средства, усиливающего эффект обработки HIFU, заключается в применении HIFU-терапии к конкретной ткани, вычислении энергии ЕЕF_{(исходн.)}, введении в биологическую ткань усиливающего средства-кандидата, измерении энергии ЕЕF_{(опытн.)}, сравнении ЕЕF_{(исходн.)} и ЕЕF_{(опытн.)} и в выборе усиливающего средства-кандидата, имеющего отношение ЕЕF_{(исходн.)} к ЕЕF(_опытн.) больше 1. Данная группа изобретений позволяет уменьшить количество акустической энергии, необходимой для повреждения ткани-мишени, в единице объема ткани в процессе обработки HIFU, уменьшить время обработки целевой области и улучшить терапевтические эффекты. 3 н. и 16 з.п. ф-лы, 10 табл.

1. Средство, усиливающее эффект обработки фокусированным ультразвуком высокой интенсивности (HIFU), где усиливающее средство представляет собой вещество, которое вводят пациенту перед применением обработки HIFU, и которое может уменьшать уровень EEF в целевом участке, подлежащем обработке HIFU, EEF=ηPt/V, Дж/мм³, обозначает количество энергии HIFU, требующееся для эффективного лечения опухоли на единицу объема опухоли, где η=0,7; Р обозначает общую акустическую мощность источника HIFU (единицы измерения: Вт); t обозначает общее время обработки HIFU (единицы измерения: с); V обозначает объем индуцированных HIFU повреждений (единицы измерения: мм³);
где EEF в целевом участке до введения усиливающего средства обозначают
ЕЕF_{(исходн.)}, EEF в целевом участке после введения усиливающего средства обозначают
ЕЕF_{(опытн.)}, а отношение ЕЕF_{(исходн.)} к ЕЕF_{(опытн.)} составляет больше 1; и
где усиливающее средство содержит дискретную фазу, состоящую из ядра, заключенного в капсулу из мембранообразующего вещества, и непрерывную фазу, состоящую из водной среды, дискретная фаза однородно распределена в непрерывной фазе, причем размер частиц дискретной фазы варьирует от 10 нм до 8 мкм; мембранообразующее вещество является биосовместимым, а ядро состоит из газообразного, жидкого или биосовместимого твердого вещества с частицами нанометрового размера.

2. Усиливающее средство по п.1, где отношение ЕЕF_{(исходн.)} к ЕЕF_{(опытн.)} больше 2.

3. Усиливающее средство по п.1, где отношение ЕЕF_{(исходн.)} к ЕЕF_{(опытн.)} больше 4.

4. Усиливающее средство по п.1, где усиливающее средство, которое можно использовать для внутривенного введения, внутриартериального введения и местного введения имеет размер частиц в интервале от 10 нм до 8 мкм.

5. Усиливающее средство по п.1, где мембранообразующее вещество представляет собой одно или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей из белков, сахаридов или липидов.

6. Усиливающее средство по п.4, где липид включает в себя фосфолипин, выбранный из группы, состоящей из 3-sn-фосфатидилхолина, натриевой соли 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилглицерина, натриевой соли 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолина, натриевой соли 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидата, 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолина, фосфатидилсерина и гидрированного фосфатидилсерина.

7. Усиливающее средство по п.1, где газообразное вещество выбрано из группы, состоящей из воздуха, диоксида углерода, газообразного фторуглеводорода и газообразного алкана.

8. Усиливающее средство по п.7, где усиливающее средство представляет собой ультразвуковое контрастное средство.

9. Усиливающее средство по п.1, где жидкость выбрана из группы, состоящей из С₅-С₆алканов, С₅-С₁₂фторуглеводородов, насыщенных жирных кислот, ненасыщенных жирных кислот и иодированного масла.

10. Усиливающее средство по п.9, где усиливающее средство представляет собой эмульсию жира для внутривенного введения.

11. Усиливающее средство по п.9, где усиливающее средство представляет собой эмульгированное иодированное масло для внутривенного введения.

12. Усиливающее средство по п.9, где усиливающее средство представляет собой эмульсию C₅-C₁₂ перфторуглеводорода для внутривенного введения.

13. Усиливающее средство по п.1, где твердое вещество выбрано из группы, состоящей из магнитных биовеществ, гидроксилапатита и карбоната кальция, и имеет размер частиц в интервале от 1 до 500 нм.

14. Усиливающее средство по п.13, где твердое вещество представляет собой гидроксилапатит с размером частиц в интервале от 1 до 200 нм.

15. Усиливающее средство по любому из пп.1-14, где целевым участком является орган, к которому усиливающее средство доставляется через кровоток.

16. Способ обработки целевого участка методом HIFU, который включает в себя:
внутривенное введение эффективной дозы усиливающего средства по любому из пп.1-14 путем непрерывной и быстрой ВВ инстилляции или болюсной инъекции пациенту за 0-168 ч до обработки методом HIFU целевого участка пациента.

17. Способ скрининга средства, усиливающего эффект обработки HIFU, который включает в себя:
(а) применение фокусированного ультразвука высокой интенсивности (HIFU) к конкретной ткани, затем вычисление EEF ткани в Дж/мм³, в соответствии с уравнением EEF=ηPt/V, с получением ЕЕF_{(исходн.)}, где η=0,7; Р обозначает общую акустическую мощность источника HIFU (единицы измерения: Вт); t обозначает общее время обработки HIFU (единицы измерения: с); V обозначает объем индуцированных HIFU повреждений (единицы измерения: мм³);
(b) введение в биологическую ткань усиливающего средства-кандидата;
(c) вычисление EEF ткани после введения усиливающего средства с получением
ЕЕF_{(опытн.)}; и
(d) сравнение ЕЕF_{(опытн.)} и ЕЕF_{(исходн.)} для конкретной ткани и выбор усиливающего средства-кандидата, имеющего отношение ЕЕF_{(исходн.)} к ЕЕF_{(опытн.)} больше 1.

18. Способ по п.17, включающий в себя сравнение ЕЕF_{(опытн.)} и ЕЕF_{(исходн.)} для заданной ткани и выбор усиливающего средства-кандидата, имеющего отношение ЕЕF_{(исходн.)} к ЕЕF_{(опытн.)} больше 2.

19. Способ по п.17, включающий в себя сравнение ЕЕF_{(опытн.)} и ЕЕF_{(исходн.)} для заданной ткани и выбор усиливающего средства-кандидата, имеющего отношение ЕЕF_{(исходн.)} к ЕЕF_{(опытн.)} больше 4.