СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ Российский патент 2009 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к клинической лабораторной диагностике и может быть использовано для определения резистентности эритроцитов пациентов при различных заболеваниях, для оценки результатов терапии, при изучении действия эффекторов эритроцитарной мембраны.

Известен способ определения общей резистентности эритроцитов, включающий кислотный гемолиз 0,1 N раствором соляной кислоты (Терсков И.А., Гительзон И.И. Метод химических (кислотных) эритрограмм // Биофизика. - 1957. - Т.2, №2. - С.259-266). О резистентности эритроцитов судят по времени 50%-ного гемолиза. Способ позволяет определить общую кислотную резистентность эритроцитарных плазматических мембран. К недостаткам способа следует отнести невозможность оценки качества билипидного мембранного слоя.

Известен способ определения общей резистентности эритроцитов, включающий осмотический гемолиз. В качестве гипотонического раствора используют 0,45% раствор хлористого натрия и регистрируют светопоглощение с временным интервалом 15 секунд до момента пятикратного повторения одного и того же значения, которое обозначают как длительность осмотического гемолиза t (Медицинские и лабораторные технологии. Справочник. / Под общ. ред. А.И. Карпищенко. - СПб.: Интермедика, 1998. - Т.1. - С.283-284).

Резистентность эритроцитов (R_эр) оценивают по формуле

R_эр=(m-d)/(h-d)·100%,

где m - остаточное светопоглощение осмотического гемолиза;

d - остаточное светопоглощение кислотного гемолиза;

h - исходное светопоглощение осмотического гемолиза

Способ позволяет определить общую осмотическую устойчивость эритроцитарных плазматических мембран в гипоосмоляльной среде.

К недостаткам способа, как и в случае кислотного гемолиза, следует отнести невозможность оценки качества билипидного мембранного слоя.

Технический результат, достигаемый изобретением, заключается в оценке состояния билипидного слоя эритроцитарных мембран.

Сущность изобретения заключается в достижении заявленного технического результата в способе определения резистентности эритроцитов, включающем ресуспендирование отмытых от плазмы эритроцитов в физиологичной среде, обработку каналоформером, обеспечивающую формирование неселективных гидрофильных трансмембранных каналов, и определение резистентности по внеклеточной концентрации определяемого иона.

Целесообразно в качестве каналоформера использовать нистатин в концентрации 5,5·10^-5-3·10^-4 M, а резистентность определять по интегральному выходу K⁺ из клеток в период времени от 25 до 35 минуты с момента внесения нистатина в пробу.

Целесообразно в качестве физиологичной среды использовать солевой раствор с осмолярностью 240-290 мосм/л, содержащий KCl в количестве 4-5 ммоль/л и NaCl в количестве 104-141 ммоль/л.

Также целесообразно в качестве физиологичной среды использовать аутологичную плазму крови.

Проведенные авторами исследования показали, что резистентность эритроцитарной мембраны по отношению к внешнему воздействию каналоформера может быть использована как критерий для оценки состояния билипидного слоя эритроцитарных мембран.

Неселективные нистатиновые каналы могут быть сформированы только в холестерин-содержащей мембране, поскольку для организации гидрофильной структуры требуется последовательная сборка молекул полиена и стерана, таким образом, существование указанных структур возможно лишь в пределах билипидного слоя. В процессе построения канала не затрагивается цитоскелет мембраны эритроцита, а также другие ее структуры.

Поскольку скорость изменения внеклеточной концентрации K⁺ напрямую зависит от количества организованных в эритроцитарной мембране каналов и, следовательно, от концентрации каналоформера в пробе, определение проводили в оптимальном диапазоне концентраций нистатина - 5,5·10^-5-3·10^-4 М, которая явилась оптимальной для полной регистрации кинетической зависимости. Продолжительность эксперимента в этих условиях составляет примерно 1 час от момента внесения нистатина в пробу. Допустимо использование в качестве каналоформера также аламетицина, грамицидина или амфотерицина В.

Для оценки резистентности эритроцитов наиболее адекватным оказался временной интервал от 25-й до 35-й минуты от начала воздействия каналоформера, так как этот период соответствует стабилизации транспортных процессов в мембране.

Использование в качестве внеклеточной среды солевого раствора с осмолярностью 240-290 мосм/л, содержащего KCl в концентрации 4-5 ммоль/л и NaCl в концентрации 104-141 ммоль/л обеспечивает наиболее адекватную имитацию условий, в которых эритроцит функционирует in vivo.

Использование в качестве наиболее физиологичной среды аутологичной плазмы крови позволяет оценить состояние мембраны, взаимодействующей с активными компонентами естественной среды пребывания эритроцита. Это позволяет, например, характеризовать происходящее во время диализной процедуры взаимное влияние трансформированных молекул, находящихся на внешней поверхности эритроцитарной мембрваны, и «очищенного» в процессе детоксикации комплекса веществ жидкой фазы.

На чертеже представлена кривая зависимости нормированной концентрации K⁺ от времени.

Способ осуществляют, например, следующим образом.

Эритроциты отделяют от плазмы однократным центрифугированием (3000 об/мин, 10 мин, 4°С); затем отмывают солевым раствором. Для этого может быть использован общеизвестный раствор Тироде (раствор Т) или раствор, предложенный в работе [Cumberbatch M., Zareian К., Morgan D.B., Swamihathan R. The relationship between sodium transport and Na⁺, K⁺-ATPase in human erythrocytes. // Biochem. Med. - 1981. - Vol.26. - P.60-66] (в дальнейшем - раствор M); состав последнего раствора был модифицирован (табл.1).

Таблица 1 Состав раствора, ммоль/л Раствор Т (рH 7,0) Раствор М (рН 7,34) KCl 4 5 NaCl 141 104 NаHСO₃ - 25 Na₂HPO₄ - 5 NaH₂PO₄ - 3.5 CaCl₂ 2 2 MgCl₂ 3 3 Глюкоза 10 10 Сахароза - 27 Осмолярность, мосм/л 240 270

По 1 мл полученной эритроцитарной массы переносят в ячейки и добавляют либо 0,5 мл раствора Т или М, либо 0,5 мл аутологичной плазмы.

В качестве каналоформера - провокатора трансмембранных потоков Na⁺ и K⁺ используют нистатин: 0,04 мл его раствора в перегнанном ДМФА с концентрацией 1-5 мг/мл (5,5·10^-5-3,0·10^-4 М) вносят в ячейку для индуцирования интенсивного выхода внутриклеточного K⁺ во внешнюю среду по сформированным каналам. Концентрация нистатина в пробе, таким образом, составляет 0,044-0,222 мг/мл внеклеточной жидкости (4,68·10^-5-2,34·10^-4 М).

Для регистрации внеклеточных концентраций Na⁺ и K⁺ может быть использована известная установка (Борисов Ю.А., Соболева О.Ю., Суглобова Е.Д., Щербак А.И. Ионометрическое изучение потоков Na⁺ и K⁺ через мембрану эритроцитов человека, модифицированную нистатином. // Цитология. - 1991. - Т.33. - №1. - С.24-32).

Для определения интегрального выхода К⁺ вычисляют площадь области диаграммы (см. чертеж), расположенную под кривой зависимости нормированной концентрации K⁺ от времени в интервале от 25-й до 35-й минуты.

По заявленному способу обследовали группу из 147 человек (78 мужчин и 69 женщин, средний возраст - 43,9±1,4 года), получавших заместительную терапию регулярным гемодиализом. Контрольной группой служили добровольцы (12 мужчин и 12 женщин, средний возраст - 42,3±1,3 года). По возрастному и половому составу исследуемая и контрольная группы достоверно не отличались друг от друга (t=1,09; χ²=0,001 соответственно).

Эритроциты из свежей гепаринизированной крови пациентов гемодиализа (взятой до и после сеанса) и здоровых доноров отделяли от плазмы путем центрифугирования (3000 об/мин, 4°С, центрифуга РС-6) в течение 10 мин. Полученный осадок эритроцитов дважды отмывали от плазмы раствором М при центрифугировании в прежних условиях. По 1 мл полученной эритроцитарной массы переносили в ячейки и добавляли либо 0,5 мл раствора М, либо 0,5 мл аутологичной плазмы, в зависимости от условий эксперимента.

В качестве провокатора трансмембранных потоков Na⁺ и K⁺ использовали нистатин - каналоформер, антибиотик полиенового ряда. 0,04 мл его раствора в перегнанном ДМФА концентрацией 5 мг/мл (3,0·10^-4 М) вносили в ячейку для индуцирования интенсивного выхода внутриклеточного K⁺ во внешнюю среду по сформированным каналам. Концентрация нистатина в пробе, таким образом, составляла 0,222 мг/мл внеклеточной жидкости.

В качестве ячеек применялись фторопластовые бюксы с внутренним диаметром 12 мм, в пластиковых крышках которых закреплялись либо ионоселективные электроды (диаметр корпусов 4 мм), либо ISFET (пластина толщиной 0,8 мм), и электролитические мостики.

Ячейки помещали в жидкостной термостат 1ТЖ-003, снабженный шейкером; все определения, как и предварительные калибровки датчиков, производили при 37°С.

Для оценки резистентности эритроцитов по отношению к нистатину использовали интегральный выход K⁺, который рассчитывали следующим образом:

1. Нормировка внеклеточной концентрации K⁺. Несмотря на то, что рабочие ячейки готовили стандартно, и количество эритроцитов в пробах одной серии было примерно одинаковым (в каждой ячейке определяли значение гематокрита), для нивелирования возникающих различий фиксируемую в каждый следующий момент величину концентрации K⁺ относили к конечному (лизисному) значению.

2. При определении интегрального выхода K⁺ вычисляли площадь области диаграммы, расположенную под кривой зависимости нормированной концентрации

K⁺ от времени в интервале от 25-й до 35-й минуты от начала воздействия каналоформера (см. чертеж).

При исследовании резистентности эритроцитов в качестве эффектора эритроцитарной мембраны использовали уабаин - специфический ингибитор Na⁺, K⁺-АТФазы. 0,04 мл его раствора в деионизированной воде (14,6 мг/мл деионизированной воды) добавляли в ячейку за 10 мин до внесения туда раствора нистатина. В ячейки, куда уабаин не добавлялся, вносили 0,04 мл деионизированной воды.

В таблице 2 представлены значения резистентности эритроцитов контрольной группы здоровых доноров (n=24).

В первом столбце приведены результаты экспериментов, в ходе которых суспензию клеток, отмытых солевым раствором, ресуспендировали в растворе М (столбец Ny). Во втором столбце приведены результаты экспериментов, в ходе которых отмытые от плазмы эритроциты, ресуспендированные в растворе М, перед внесением нистатина предварительно экспонировали с уабаином в течение 10 минут (столбец Ou+Ny). В столбце 3 - результаты экспериментов, в ходе которых суспензию клеток, отмытых солевым раствором, ресуспендировали в аутологичной плазме (столбец Pl+Ny).

Таблица 2 Доноры n=24 t критерий Стьюдента M±m Медиана (min - max) (Ny) (Ou+Ny) (Pl+Ny) 238,5±12,1 272,2±9,4 96,8±10,8   249,7 (125,9-406,5) 282,3 (181,5-345,2)* 85,6 (25,5-227,9)*# p<0,0001 Примечания: * - величина достоверно отличается от значения Ny; # - величина достоверно отличается от значений Ou+Ny.

Как следует из данных, представленных в таблице 2, наблюдалось 14%-ное увеличение скорости выхода K⁺ по сформированным каналам в пробе с уабаином, по сравнению с пробами, в которых отсутствовал специфический ингибитор Na⁺, K⁺-АТФазы.

Распределение величин интегрального нормированного выхода K⁺ для контрольной группы здоровых доноров является нормальным; проведенное сравнение по Стьюденту (попарно сопряженные коварианты) показало высокую достоверность описанных изменений.

Интенсивность выхода K⁺ из клеток, ресуспендированных в модельном растворе М, оказалась в 2,5-3 раза выше, чем эта же величина для проб, в которые добавляли плазму крови. Различия между зафиксированными интегральными величинами высокодостоверны (см. табл.2).

В таблице 3 представлены значения резистентности эритроцитов здоровых доноров и эритроцитов пациентов гемодиализа до и после сеанса.

Таблица 3 Доноры n=24 (Ny) Пациенты n=147 Критерий U Манна-Уитни, р (Ny)_до (Ny) после 1 2 3 238,5±12,1 312,7±12,7 321,3±13,7 p_1,2=0,044 249,7 (125,9- 290,3 (44,1- 330,0(11,1- р_1,3=0,008 406,5) 741,5)* 909,8)* р_2,3=0,616 Примечания: * - величина достоверно отличается от значения, полученного для эритроцитов доноров.

Показатели резистентности у пациентов гемодиализа превышали соответствующие величины для здоровых доноров в 1,3-1,4 раза, и в данном случае различия в каналоформерной резистентности стали достоверными (см. табл.3).

В таблице 4 представлены значения резистентности эритроцитов здоровых доноров и эритроцитов пациентов гемодиализа до и после сеанса при ресуспендировании клеток в аутологичной плазме.

Таблица 4 Доноры n=24 (Pl+Ny) Пациенты n=114 Критерий U Манна-Уитни, р (Pl+Ny)_до (Pl+Ny)_после 1 2 3 96,8±10,8 153,0±12,2 124,7±8,4 p_1,2=0,046 85,6 (25,5-227,9) 121,5 (6,4-713,9)* 95,2 (5,8-550,3)# p_1,3=0,277 p_2,3=0,055 Примечания: * - величина достоверно отличается от значения, полученного для эритроцитов здоровых доноров; # - величина достоверно различается до и после гемодиализа.

Из приведенных в таблице 4 данных следует, что при ресуспендировании эритроцитов в аутологичной плазме характерным оказалось значительное отличие в нормированном выходе K⁺ у больных перед гемодиализной процедурой по сравнению со здоровыми донорами на фоне отсутствия достоверной разницы по этому показателю между донорами и пациентами после сеанса, а при сравнении величин (Pl+Ny)_до=153,0±12,2 и (Pl+Ny)_после=124,7±8,4 р_2,3 оказалась равной 0,055, что весьма близко к критерию достоверности.

Были проанализированы разностные величины интегрального нормированного выхода K⁺ при ресуспендировании эритроцитов в растворе М и при ресуспендировании клеток с добавлением аутологичной плазмы крови (таблица 5). Именно эти переменные характеризуют состояние плазматической мембраны отмытых от плазмы клеток при отсутствии нативного окружения и состояние мембраны, взаимодействующей с активными компонентами естественной среды пребывания эритроцита. Возможность регистрации изменений, происходящих во время диализной процедуры, имеет особую важность, поскольку они отражают модификации поверхностных слоев при движении по экстракорпоральной системе кровообращения и взаимное влияние трансформированных молекул, находящихся на внешней поверхности, и «очищенного» в процессе детоксикации комплекса веществ жидкой фазы.

Таблица 5 (Nу)_до-(Рl+Nу)_до (Ny)_после-(Pl+Ny)_после Критерий Уилкоксона z(p) 134,9±15,3 172,5±14,6 -2,47 (0,014) 137,5 (-525,7-543,5) 172,2 (-283,4-666,8)  

Как видно из представленных данных, рассматриваемые разностные величины оказались достаточно высокими и значимыми, о чем свидетельствуют данные, приведенные в таблице 5.

Использование заявленного способа позволяет оценить состояние билипидного слоя эритроцитарных мембран.

Изобретение относится к клинической лабораторной диагностике и может быть использовано для определения резистентности эритроцитов пациентов при различных заболеваниях, а также для оценки результатов терапии и при изучении действия эффекторов эритроцитарной мембраны. Способ заключается в ресуспендировании отмытых от плазмы эритроцитов в физиологичной среде, обработке каналоформером нистатином

(5,5·10^-5-3·10^-4 M), при этом определение резистентности эритроцитов по интегральному выходу K⁺ из клеток проводят в период времени от 25 до 35 минуты от внесения нистатина в пробу. В качестве физиологичной среды используют солевой раствор с осмолярностью 240-290 мосм/л, содержащий KCL в количестве 4-5 ммоль/л и NaCL в количестве 104-141 ммоль/л, а также можно использовать аутологичную плазму крови. Изобретение обеспечивает возможность оценки состояния билипидного слоя эритроцитарных мембран в способе определения резистентности эритроцитов. 2 з.п. ф-лы, 5 табл., 1 ил.

1. Способ определения резистентности эритроцитов, включающий ресуспендирование отмытых от плазмы эритроцитов в физиологичной среде, обработку каналоформером нистатином в концентрации 5,5·10^-5-3·10^-4 М и определение резистентности по интегральному выходу К⁺ из клеток в период времени от 25 до 35 мин от внесения нистатина в пробу.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве физиологичной среды используют солевой раствор с осмолярностью 240-290 мосм/л, содержащий KCl в количестве 4-5 ммоль/л и NaCl в количестве 104-141 ммоль/л.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве физиологичной среды используют аутологичную плазму крови.