СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ОБНАРУЖЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ВНУТРИБОЛЬНИЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ Burkholderia cepacia И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЕГО ОТ ДРУГИХ ВИДОВ БУРКХОЛЬДЕРИЙ И ПСЕВДОМОНАД Российский патент 2006 года по МПК G01N33/48 C12N1/20 

Изобретение относится к медицине и касается лабораторной диагностики возбудителя внутрибольничных инфекций B.cepacia и дифференциации его от близкородственных микроорганизмов рода буркхольдерий (В. mallei, В. pseudomallei, B.thailandensis, В. gladioli) и псевдомонад.

Среди микроорганизмов рода Burkholderia важное медицинское значение имеют В.mallei и В.pseudomallei - возбудители тяжелых заболеваний человека и животных - сапа и мелиоидоза и B.cepacia - возбудитель внутрибольничных инфекций у больных с кистозным фиброзом легких и хроническим гранулематозом. B.thailandensis, В. gladioli являются возбудителями редко встречающихся оппортунистических инфекций. Патогенные свойства первых двух микроорганизмов, как представителей 2 группы патогенности, изучены довольно полно. Свойства B.cepacia и механизмы его взаимодействия с макроорганизмом изучены слабо. Описаны многочисленные случаи инфекций, вызываемых этим микроорганизмом. Отмечено, что внутрибольничное инфицирование пациентов происходило при использовании катетеров, дезинфектантов и растворов для внутривенных инъекций, которые были контаминированы B.cepacia. Установлено, что этот микроорганизм обладает высокой резистентностью к антибиотикам (аминогликозидам, колистину, карбенициллину, тикарциллину и имипенему). Благодаря геному большого размера (длина хромосомы B.cepacia в 1,5 раза больше длины хромосомы Pseudomonas aeroginosa) этот микроорганизм быстро адаптируется к внешним условиям при смене экологических ниш.

Идентификация бактерий B.cepacia является многоэтапной, с применением методов определения фенотипических и генотипических признаков. На первом этапе проводится выделение комплекса бактерий B.cepacia с помощью селективных сред. Далее идентифицируют с применением коммерческих систем API 20 NE, Cristal N/F и др., дополнительных фенотипических тестов, выявляют эпидемически значимые штаммы ПЦР-тест-системами и пульс-электрофорезом. Большое значение при лечении инфекций, вызываемых B.cepacia, ввиду высокой их резистентности к антибиотикам имеет быстрота идентификации этого микроорганизма. Вышеперечисленные методы требуют дорогостоящих препаратов и оборудования и продолжительны по времени. Наиболее близким аналогом предлагаемого способа является «Бактерии комплекса Burkholderia cepacia: особенности диагностики, организации генома и метаболизма» Шагинян И.А., Чернуха М.Ю. Молек. генетика микробиол. вирусол. 2002. - N 2. - С.7-11. В статье описаны применяемые способы идентификации бактерий комплекса B.cepacia. В доступных источниках литературы сведений о способах идентификации с применением сывороток против B.cepacia не обнаружено.

Целью предлагаемого изобретения является способ экспресс-обнаружения B.cepacia и дифференциации этого микроорганизма от других видов буркхольдерий (В. mallei, В. pseudomallei, B.thailandensis, В. gladioli) и псевдомонад на основе полученных иммуноглобулинов.

Поставленная цель достигается иммунолюминесцентным исследованием мазков-препаратов из исследуемых проб, окрашенных иммуноглобулинами диагностическими флуоресцирующими против B.cepacia, взаимодействующими с B.cepacia и не реагирующими на присутствие других видов буркхольдерий и псевдомонад.

Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие получают на основе гамма-глобулиновой фракции, изолированной из гипериммунной сыворотки кролика против B.cepacia методом переосаждения сульфатом аммония и меченной флуорохромом. Гипериммунную сыворотку выделяют из крови кроликов, которых иммунизируют смесью антигенов B.cepacia и адъюванта Фрейнда. Антигены получают из клеток штамма B.cepacia 25416 АТСС, которые выращивают на твердой питательной среде, смывают 0,9% раствором NaCl pH 7,2, стерилизуют охлажденным до -40°С ацетоном и высушивают под тягой. Затем сухие клетки B.cepacia суспендируют в 0,9% растворе NaCl, обрабатывают ультразвуком. Дезинтегрант используют для иммунизации кроликов. Активность сывороток оценивают в реакции иммунодиффузии в геле с антигенным комплексом. Животных обескровливают при титре сыворотки 1:32.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Получение иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих против B.cepacia.

Для получения антигенного материала бактерии B.cepacia выращивают на плотной питательной среде (F - агаре "Difco", USA) при 37°С в течение 18 ч. Микробные клетки (м.к.) смывают 0,9% раствором NaCI, pH 7,2. Полученную взвесь бактерий обеззараживают охлажденным до -40°С ацетоном при соотношении компонентов 1:3. Гибель бактерий завершается через 3 суток инкубации взвеси в условиях холодильника. Затем стерильную бактериальную массу освобождают от ацетона центрифугированием в течение 20 мин при 8000 g и 4°С. Осадок высушивают под тягой и растирают до гомогенного состояния.

Для иммунизации кроликов готовят суспензию сухих клеток в 0,9% растворе NaCl, pH 7,2, с концентрацией 20 мг/мл. Полученную взвесь бактерий подвергают обработке ультразвуком мощностью 100 Вт и частотой 20 кГц. Проводят 5 циклов обработки (1 цикл: 1 мин - воздействие ультразвуком, 3 мин - охлаждение).

Для получения гипериммунных сывороток используют кроликов массой 2 -3 кг в возрасте до двух лет. Животных иммунизируют ультразвуковым дезинтегратом бактерий B.cepacia, проводя три цикла введения данного антигена. Антиген для иммунизации готовят на 0,9% растворе NaCI, pH 7,2 с добавлением неполного адъюванта Фрейнда ("Difco", USA) в соотношении 1:1 в объеме 2,0 мл. В первый и третий циклы антигены вводят в объеме 1 мл в возрастающих дозах: 1,25, 2,5, 5, 10 млрд м.к. по стандарту мутности. Во втором цикле антигены вводят в объеме 1 мл в уменьшающих дозах: 10, 5, 2,5, 1,25 млрд. м.к. Одно введение состоит из паравертебральных внутрикожных инъекций 0,2 мл приготовленной смеси антигена и адъюванта в 10 точек каждому животному. Интервалы между введениями составляют 7 суток, между циклами - 30 суток. Активность сывороток оценивают после каждого цикла в реакции иммунодиффузии в геле с антигенным комплексом (разведение 1:2). Животных обескровливают при титре сыворотки 1:32.

Из гипериммунной сыворотки методом осаждения белка сульфатом аммония изолируют фракцию гамма-глобулинов. На основе выделенных антител против B.cepacia готовят препарат иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих. Гамма-глобулин метят флуорохромом флуоресцеин-изотиоцианатом (ФИТЦ). Конъюгирование белка с флуорохромом проводят в течение 2,5 ч в условиях постоянного перемешивания реагентной смеси на магнитной мешалке при pH среды 9,0-9,5 и нагрузке ФИТЦ 25 мг на 1 г белка. Полученный конъюгат ФИТЦ-белок освобождают от непрореагировавших компонентов смеси на колонке с сефадексом G-25. Очищенный препарат иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих ампулируют по 0,2-0,5 мл и хранят в холодильнике при +4°С в течение месяца. Хранение в течение более длительного промежутка времени осуществляют при -20°С.

Пример 2. Оценка специфической активности сырья для изготовления иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих против В. cepacia с помощью непрямого метода флуоресцирущих антител (НМФА).

НМФА проводится в стандартных условиях. Все микроорганизмы выращивают в идентичных условиях на плотной питательной среде в течение 18 ч при 37°С. Мазки-препараты готовят из клеточных суспензий в 0,9% растворе NaCl, pH 7,2 с концентрацией 5-10⁸ м.к./мл по ОСО мутности. Сыворотку против B.cepacia разводят 1:200, 1:400, 1:800 и т.д. 0,9% раствором NaCl, pH 7,2, обрабатывают ей мазки-препараты исследуемых штаммов и окрашивают конъюгатом флуоресцирующих антител против иммуноглобулинов кролика. В качестве конъюгата используют коммерческий препарат производства Института эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи. Препараты просматривают в люминесцентном микроскопе.

Полученные данные представлены в таблице 1.

Таблица 1
Диагностические возможности гипериммунной сыворотки против B.cepacia.№№п/пОбъект исследованияМинимальные разведения сыворотки, обеспечивающие получение положительного результата НМФА (идентификация вида)1B.cepacia 254161:40002B.cepacia 82351:25003B.cepacia 82361 8004B.cepacia 82371 8005B.cepacia 82381 8006B.cepacia 82401 8007B.cepacia 31811 10008B.cepacia 31891 8009B.cepacia Vang1 80010B.pseudomallei 568301 20011B.mallei 102301 20012B.thailandensis 2641 200

Установлено, что использование полученной сыворотки в разведении 1:800 и более против В. cepacia в НМФА позволяет идентифицировать 90% имеющихся типичных штаммов (представлены в Коллекционном центре ВолгНИПЧИ). При разведении 1:800 возможно дифференцировать B.cepacia от B.pseudomallei, B.mallei и B.thailandensis.

Пример 3. Применение предлагаемого способа для идентификации B.cepacia.

В качестве диагностического препарата используют иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие к антигенам B.cepacia, полученные на основе гамма-глобулиновой фракции, изолированной из гипериммунной сыворотки кролика против B.cepacia 25416 методом трехкратного переосаждения сульфатом аммония. Гамма-глобулиновую фракцию метят ФИТЦ. Концентрация белка в препарате составляет 5,8 мг/мл. Соотношение М_ФИТЦ/М_белок - 6,5. Рабочее разведение конъюгата - 1:32. Мазки-препараты окрашивают полученным конъюгатом и просматривают на люминесцентном микроскопе (метод флуоресцирующих антител).

Данные по идентификации музейных культур B.cepacia приведены в таблице 2.

Таблица 2 Определение рабочего разведения препарата иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих к антигенам B.cepacia№№п/пНазвание микроорганизмовРазведения конъюгата481632641282561B.cepacia 25416444/33/43/43/222B.cepacia 82354443/433/223B.cepacia 82373333/2---4B.cepacia 82383333/2---5B.cepacia 824033333/2--6B.cepacia 31813333333/27B.cepacia 31893/4333332/38B.cepacia Vang333332/3-

Как следует из представленных данных, применение иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих против B.cepacia позволяет достоверно идентифицировать большинство штаммов этого вида, имеющихся в Коллекционном центре ВолгНИПЧИ, при разведении конъюгата 1:32. Это разведение принимают в качестве рабочего.

Пример 4. Экспресс-обнаружение B.cepacia предлагаемым способом из группы видов родов Burkholderia, Pseudomonas.

Для идентификации микроорганизмов мазки-препараты, окрашенные иммуноглобулинами диагностическими флуоресцирующими против B.cepacia 25416 в рабочем разведении (1:32), просматривают на люминесцентном микроскопе.

Результаты опытов приведены в таблице 3.

Из представленных в таблице 3 данных следует, что предлагаемый способ экспресс-обнаружения B.cepacia позволяет при применении иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих при рабочем разведении 1:32 идентифицировать штаммы этого вида из группы видов рода Burkholderia, Pseudomonas.

Таблица 3
Сводные данные по идентификации B.cepacia иммуноглобулинами диагностическими флуоресцирующими против B.cepacia№№п/пОбъекты исследованияРезультаты МФА1B.cepacia 25416+2B.cepacia 8235+3B.pseudomallei 56830-4B.pseudomallei 57576-5B.pseudomallei С-141-6В. pseudomallei 56770-7В. pseudomallei 56738-8В. mallei 10230-9В. mallei Muksuwar-10В. mallei 8-11В. mallei ц-4-12В. mallei ц-5-13Р. aeruginosa 249-14Р. aeruginosa BP-5812-15Р. aeruginosa H-1-16Р. aeruginosa H-6-17Р. aeruginosa 4000-18Р. maltophilia4131-19Р. alcaligenes BKMB 4138-20Р. mendocina 972-21Р. marginata 1298-22P. myxogenes 878-23P. putida 1608-24P. putida 973-25P. tactorolens BKMB 904-26P. fragia 4002-27P. stutzeri 903-28P. fluorescens A-4125-29Р. fluorescens В-1602-Примечание: "+" - положительный результат МФА
"-" - отрицательный результат МФА.

Таким образом, из приведенных примеров следует, что предложенный способ эффективен при экспресс-обнаружении B.cepacia и идентификации этого микроорганизма от B.pseudomallei, В.mallei, B.thailandensis, В.gladioli. Он позволяет в течение 2-4 ч дать предварительный ответ о наличии/отсутствии в пробе исследуемого материала B.cepacia, имея существенные преимущества в скорости получения ответа по сравнению с бактериологическим методом, требующим для своего воспроизведения в полном объеме не менее 3 суток.

Изобретение относится к области медицины. Изобретение характеризуется иммунолюминесцентным исследованием мазков-препаратов из исследуемых проб, окрашенных иммуноглобулинами диагностическими флуоресцирующими против В.cepacia, взаимодействующими с В.cepacia и не реагирующими на присутствие других видов буркхольдерий и псевдомонад. Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие получают на основе гамма-глобулиновой фракции, изолированной из гипериммунной сыворотки кролика против В.cepacia методом переосаждения сульфатом аммония и меченной флуорохромом. Гипериммунную сыворотку выделяют из крови кроликов, которых иммунизируют смесью антигенов В.cepacia и адъюванта Фрейнда. Антигены получают из клеток штамма B.cepacia 25416 АТСС, которые выращивают на твердой питательной среде, смывают 0,9% раствором NaCl pH 7,2, стерилизуют охлажденным до -40°С ацетоном и высушивают под тягой. Затем сухие клетки B.cepacia суспендируют в 0,9% растворе NaCl, обрабатывают ультразвуком. Дезинтегрант используют для иммунизации кроликов. Активность сывороток оценивают в реакции иммунодиффузии в геле с антигенным комплексом. Животных обескровливают при титре сыворотки 1:32. Изобретение обеспечивает простоту и эффективность дифференциации, позволяет в течение 2-4 ч дать предварительный ответ о наличии/отсутствии в пробе исследуемого материала B.cepacia. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ экспресс-обнаружения возбудителя внутрибольничных инфекций Burkholderia cepacia и дифференциации его от других видов буркхольдерий и псевдомонад, включающий приготовление мазков из материала, подозрительного на зараженность этим возбудителем и последующее их иммунолюминесцентное исследование, отличающийся тем, что для выявления искомых бактерий применены иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие, взаимодействующие с микробными клетками В.cepacia, выделенные из гипериммунной сыворотки кролика, иммунизированного антигенами В.cepacia 25416 АТСС, которые получают из взвеси бактерий, приготовленной суспендированием в 0,9%-ном растворе NaCl, рН 7,2, сухих микробных клеток (м.к.) в концентрации 20 мг/мл 18-часовой культуры В.cepacia, выращенной на твердой питательной среде (F-агаре «Difco», USA) при 37°С, смытой 0,9%-ным раствором NaCl, рН 7,2, и стерилизованной охлаждением до -40°С ацетоном в соотношении 1:3 в течение 3 сут., приведенной до сухого состояния освобождением от ацетона центрифугированием в течение 20 мин при 8000 g, +4°С и высушиванием под тягой, и обработанной ультразвуком мощностью 100 Вт, частотой 20 кГц за 5 циклов (1 цикл 1 мин - обработка ультразвуком, 3 мин - охлаждение), и полученные в результате такой обработки антигены используют для трех циклов иммунизации кроликов, из крови которых получают гипериммунную сыворотку, затем из сыворотки методом трехкратного переосаждения сульфатом аммония выделяют иммуноглобулины и при взаимодействии диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов с антигенами B.cepacia обнаруживают этот возбудитель внутрибольничных инфекций.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что цикл иммунизации включает 4-кратное в течение месяца введение антигена, каждое из которых имеет суммарный объем 2 мл смеси, 1 мл антигенного комплекса B.cepacia и 1 мл неполного адъюванта Фрейнда, и состоит из инъекций по 0,2 мл внутрикожно паравертебрально в 10 точек каждому животному с интервалами между введениями 7 сут, между циклами - 30 сут, при этом в первом и третьем циклах отдельное введение содержит антиген в объеме 1 мл в возрастающих дозах: 1,25; 2,5; 5; 10 млрд м.к. по стандарту ОСО мутности ГИСК им. Тарасевича, во втором цикле отдельное введение содержит антиген в 1 мл в уменьшающей дозе 10; 5; 2,5; 1,25 млрд. м.к.