ФОСФОЛИПИДНАЯ ЭМУЛЬСИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИН, И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2009 года по МПК A61K9/107 A61K9/127 A61K31/353 A61K47/16 A61J3/00 A61P17/02 

Изобретение относится к области химии, пищевой, парфюмерно-косметической и фармацевтической промышленности, в частности к липосомным биологически активным формам и способам их получения.

В данной области известно множество активных веществ, слаборастворимых или нерастворимых в воде. Их практическое применение требует разработки механизмов и средств доставки гидрофобных агентов в водосодержащие среды. Были разработаны различные системы в качестве таких носителей: смеси воды и диспергирующих средств, смеси воды с органическим растворителем, инкапсулирование, использование эмульсий, суспензий, липосом и мицелл. Однако каждая из указанных систем имеет ряд ограничений, связанных с коэффициентом захвата активного вещества, стабильностью агента в системе, сроком жизни системы, селективностью доставки агента и т.д.

Например, в патенте США №4,776,991 (Farmer et al.) описана широкомасштабная инкапсуляция гемоглобина, где представлены гидрофобные агенты в липосомах; Kappas et al. в патенте США №5,010,073 описывают получение липосом, содержащих металлопорфирин с яичным фосфатидилхолином, используемьм в качестве липида; Parikh et al. в патенте США №5,922,355 описывает микрочастицы, включающие нерастворимые вещества; Lasic (Nature, vol.355, pp.379-380 (1992)) описывает применение агрегированных мицелл, включающих лекарственное средство и биологические липиды.

Аналогичным образом мицеллы применялись для доставки лекарственных средств при лечении пациентов (Brodin et al., Acta Pharm. Seuc. 19267-284)); мицеллы применялись в качестве носителей препаратов и целевой доставки лекарственных средств (Supersaxo et al., Pharm. Res. 8:1286-1291 (1991)), включая противораковые лекарственные средства (Fung et al., Biomater. Artif. Cells. Artif. Organs 16:439 et.seq. (1988) & Yokoyama et al., Cancer Res. 51:3229-3236 (1991)).

В патенте США №6,984,395 (Bok R.D. et al.) заявляется фосфолипидная композиция, в которую включены гидрофобные фотосенсибилизаторы. Композиция может перерабатываться в устойчивый липосомный продукт, который может быть стерилизован фильтрацией, лиофилизирован для хранения и который быстро растворяется в водной среде для введения. И хотя авторам изобретения удалось решить ряд проблем, связанных с устойчивостью системы и эффективностью воздействия, однако способ получения продукта остался сложным, и требуются дополнительные операции и условия для его хранения, и дополнительная подготовка перед использованием.

Настоящее изобретение направлено на создание устойчивой фосфолипидной эмульсии на основе дигидрокверцетина (ДГК), а также предложен достаточно простой и экономичный способ получения такой эмульсии.

Техническим результатом изобретения является улучшение биодоступности и селективности воздействия активных соединений при повышении стабильности и увеличения срока хранения самой эмульсии.

Заявленный результат достигается тем, что фосфолипидная эмульсия включает дигидрокверцетин, по крайней мере, один мембранообразующий фосфолипид (МФЛ), глицин, водный раствор этилового спирта, при этом выполняется следующее соотношение компонентов, мас.%:

Дигидрокверцетин 0,01-3 Фосфолипид 0,15-10 Глицин 1-8 Водный раствор этилового спирта 75-98,84

при содержании спирта от 0,05 до 20%.

Эмульсия может также содержать дополнительные компоненты в количестве от 0 до 23,84%.

Эффект использования эмульсии определяется свойствами фосфолипидов и дигидрокверцетина, а также других биологически активных веществ, соединенных в липосоме. При этом каждый из компонентов выполняет свою функцию, органично дополняя и усиливая свойства другого.

Дигидрокверцетин является соединением группы флавоноидов, оказывающим ангиопротективное, регенирирующее, дезинтоксикационное, противоотечное, антиоксидантное действие (здесь под термином «дигидрокверцетин» понимается само вещество, его соединения и производные, структурно являющихся тесными родственниками и обладающими сходными физико-химическими свойствами. Необходимо отметить, что в препаратах ДГК, выделенных из природных субстратов, всегда присутствуют в количествах 12-20% близкородственные соединения и производные ДГК).

ДГК тормозит преждевременное старение клеток и развитие различных заболеваний; укрепляет стенки сосудов, улучшает микроциркуляцию; угнетает воспалительные процессы, оказывает противоотечное действие; благоприятно влияет на кожные покровы, нормализует синтез коллагена/эластина в коже и т.д.

Основная проблема использования ДГК в качестве биологически активного вещества и лекарственного средства заключается в «доставке» препарата к «месту действия» в организме. Вследствие высокой молекулярной массы ДГК его проникновение через роговой слой кожи минимально. ДГК плохо растворим в воде и чувствителен к действию ионов металлов, вследствие чего инъекционное введение часто бывает невозможно, а пероральное введение чревато потерей активности при прохождении желудочно-кишечного тракта.

Фосфолипиды (ФЛ) являются главным структурным компонентом всех клеточных мембран организма. К ФЛ относятся фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилэтаноламин (ФЭ), фосфатидилглицерин (ФГ), фосфатидилинозитол (ФИ), фосфатиилглицерин (кардиолипин). Уникальные поверхностно-активные свойства ФЛ позволяют при использовании препаратов, их содержащих, восстановить разрушенные участки мембран и таким образом предотвратить развитие структурных патологий клеток. Результатом может быть повышение осмотической резистентности клеток, в том числе и эритроцитов, что является своеобразным признаком "омоложения" клеток. Клеточные стенки делаются при этом более упругими и эластичными, что характерно для молодых клеток.

Несмотря на положительные свойства, существует ряд объективных причин, затрудняющих их использование: низкая водорастворимость; чувствительность к изменению рН и высокая реакционоспособность; окисляемость, что влечет за собой сложность в применении и повышенные требования к условиям хранения и использования.

Введение аминокислот в эмульсию, в соответствии с настоящим изобретением, обеспечивает, помимо известных позитивных эффектов биологического воздействия, стабильность реологических параметров эмульсии, не допуская ее разделение на фракции. Стабильность эмульсии возникает за счет цвиттерионных свойств молекулы аминокислоты, В качестве аминокислоты предпочтительно использовать глицин, однако дополнительно могут быть использованы и другие аминокислоты, например: глутамин, аспарагин, аланин, валин, гистидин, серии, изолейцин, треонин, пролин, цистеин, лизин, тирозин, фенилаланин, аргинин, метионин, триптофан, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, цистеин, лейцин и их производные (под производными здесь понимаются, прежде всего, соответствующие эфиры, которые могут образовываться при получении эмульсии в результате реакции этерификации или быть введенными в эмульсию дополнительно).

Дополнительно в эмульсии может присутствовать аминоуксусный эфир в количестве от 0 до 4 мас.%. Его присутствие является следствием естественной реакции молекул глицина с молекулами этилового спирта, которая протекает в процессе приготовлении эмульсии - смешения водного раствора глицина с этиловым спиртом, на котором готовят растворы ДГК, фосфолипида и иных компонентов. Реакция этерификации (⁺NH₃CH₂COO^-+С₂Н₅OН<=>NH₂CH₃COOC₂H₅+H₂O) является обратимой и наличие аминоуксусного эфира определяется свойствами эмульсии. Реакцию образования аминоуксусного эфира можно реализовать также и вне процесса приготовления эмульсии и в дальнейшем полученный эфир добавлять до заданного рецептурного соотношения в эмульсионную смесь.

Основная цель включения в состав эмульсии аминоуксусного эфира заключается в использовании одного из главных свойств этого эфира - проявление бактериостатического эффекта при отсутствии противопоказаний для клеток организма человека.

Для придания эмульсии дополнительных биологических и физических свойств, обусловленных конкретной областью применения, в нее могут быть добавлены различные биологически активные вещества в количестве не более 6 мас.%, например: антиоксиданты, витамины и минералы, консерванты, красители, ароматизаторы, загустители, полиеновые кислоты и т.д.

Размер липосом в эмульсии составляет от 20 до 500 нм, в зависимости от условий приготовления эмульсии, при этом в каждом случае можно добиться высокой однородности частиц по размерам. Наибольшее применение нашли эмульсии, в которых 70% липосом имеют размеры в диапазоне от 20 до 100 нм.

Липосомная форма организации биологически активных веществ обеспечивает доставку действующих компонентов в нужное место организма, к органам и тканям, позволяет при этом самой эмульсии сохранять свои свойства в течение длительного времени при обычных условиях хранения, отличаясь высокой устойчивостью и стойкостью к окислению. Эмульсия сохраняет свой состав и свойства в широком диапазоне кислотности от 3,0 до 10,0 рН и выдерживает нагрев до 65°С в течение часа.

Введение ДГК в состав липосом оказывает двоякое действие:

- с одной стороны, ДГК обуславливает активное биологическое действие липосом;

- с другой стороны, ДГК защищает от окисления фосфолипиды липосом, являясь мощным антиоксидантом, и обеспечивает структурную устойчивость липидного бислоя.

Причина здесь в особенностях включения ДГК в липосомы. Расчеты, проведенные на основании массового анализа содержания ДГК в фосфолипидной и водной фракциях, а также определения коэффициентов захвата ДГК липосомами показали, что при изготовлении эмульсии в соответствии с предложенным способом ДГК встраивается в липидный бислой, химически реагируя с молекулами фосфолипида. Поэтому содержание активного вещества в липосомах будет определяться не коэффициентом захвата, а соответствующими молярными соотношениями исходных компонентов.

Способ получения фосфолипидной эмульсии, в соответствии с настоящим изобретением, заключается в том, что

- готовят раствор дигидрокверцетина и, по крайней мере, одного фосфолипида в этиловом спирте; и дисперсную среду, включающую деионизованную воду;

- раскручивают дисперсионную среду до образования в ней стабильной воронки вращения;

- вводят раствор в воронку вращения;

- разделяют полученную смесь на концентрат дисперсной фазы (липосомы) и дисперсионную среду в соотношении от 1:2 до 1:5;

- добавляют в концентрат водный раствор, по крайней мере, одной аминокислоты.

При приготовлении дисперсионной фазы в спиртовой раствор фосфолипида дополнительно вводятся те спирторастворимые биологически активные вещества, которые практически малорастворимы в воде (например - дигидроквертицин, антиоксиданты, полиеновые кислоты и др.) и способны непосредственно взаимодействовать с цвиттерионном конкретного фосфолипида или взаимодействовать с ним через водорастворимого «посредника», также обладающего цвиттериоными свойствами (например - глицин).

Предлагаемый способ аналогичен инжекционному методу приготовления липосом, когда под давлением дисперсная фаза (спиртовой раствор) впрыскивается в дисперсионную среду. Однако в заявленном способе учитываются гидродинамические характеристики дисперсионной среды при ее перемешивании. При вращении перемешивающего ротора образуется воронка с центром вращения на роторе. При достаточном количестве оборотов на поверхности ротора образуется тонкий слой дисперсионной водной среды, в который через капилляр впрыскивается дисперсионная фаза. Образование липосом происходит в тонком слое на роторе и за счет центробежных сил полученные липосомы сразу же распределяются по всему объему жидкости. Таким способом удается получать липосомы требуемых размеров и высокой однородности с использованием относительно небольших скоростей вращения ротора - 700-1500 об/мин.

Для приготовления некоторых косметических средств бывает также необходимо удалить из готового продукта растворитель - этиловый спирт, стабилизировать реологические свойства препарата и исключить разделения взвеси на фракции.

В рамках предложенного способа эти задачи решаются путем замены дисперсионной среды, т.е. водно-спиртового раствора с небольшим содержанием самых мелких фракций после отстаивания нативного раствора, на водный раствор глицина. После ресуспендирования получается стабильный раствор, не расслаивающийся на фракции. При соблюдении условий хранения препарат сохраняет свойства на протяжении нескольких месяцев (до года).

Возможность осуществления настоящего изобретения иллюстрируется следующими примерами, но не ограничивается ими:

Пример 1

Для приготовления 1 литра фосфолипидной эмульсии, носящей коммерческое название «Фламена D», используют 200 мл раствора, который готовят следующим образом:

4 г дигидрокверцетина (94-96% степени очистки) растворяют в 166 мл этилового спирта 96% чистоты. Затем к раствору добавляют 30 г лецитина, обычно используют лецитин яичный с содержанием фосфатидилхолина не менее 80%. Перемешивают полученную смесь до полного растворения лецитина. Предпочтительно одновременно подогревать смесь до температуры 50°С. Полученный раствор можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких дней.

Для приготовления дисперсионной среды - 5% раствора глицина, используют дистиллированную деионизованную воду (0,5 микросименс). Раствор глицина помещается в емкость объемом до 2 л, которая устанавливается на магнитной мешалке. Частота вращения ротора магнитной мешалки постепенно доводится до 700-1000 об/мин. Толщина слоя жидкости в центре образовавшейся воронки не должна превышать 10 мм. В это место вносится спиртовой раствор ДГК и ФХ (дисперсная фаза). Скорость подачи дисперсной фазы должна быть равномерной и составлять от 3 до 4 мл/сек.

После выключения мешалки смесь отстаивают. Полученная эмульсия содержит: ДГК - 0,4; ФХ - 3 мас.%; глицина - 4 мас.%; этилового спирта - 16,6 мас.%; воды - 76 мас.%. Размеры липосом, определенные методами нефелометрии, составляют от 20 до 500 нм, причем до 70% липосом имеют размеры от 50 до 250 нм.

В случае необходимости (для изменения концентрации активных компонентов) излишки спирта могут быть отогнаны, например, на ротационном испарителе, тогда после этого к полученной смеси добавляют раствор глицина в требуемом количестве, чтобы довести объем эмульсии до 2000 мл. При этом максимальное содержание глицина в эмульсии может быть доведено до 8 мас.%.

Фосфолипидная эмульсия в зависимости от области применения может быть использована в виде жидкостей (различной вязкости), кремов, мазей и т.д.

Изменение консистенции препарата производят, например, путем разделения полученной смеси на фракции. Смесь отстаивают в течение суток при пониженной температуре (не более 10°С). В результате образуются две фракции: нижняя плотная, белого цвета (составляющая 25-28% по объему) и верхняя полупрозрачная жидкость. Верхняя фракция сливается, а к образовавшемуся продукту добавляют 5% раствор глицина в дистиллированной деионизованной воде, в количестве, необходимом, чтобы довести объем эмульсии до 2000 мл. Концентрация активных и липидообразующих веществ в эмульсии может быть доведена до значений: ДГК - 3 мас.%, фосфолипид (фосфатидилхолин) - 10 мас.%. После чего продукт перемешивают и разливают в готовую тару.

Тесты на биоактивность. Эксперименты in vivo с использованием меченного ДГК показали эффективное преодоление рогового слоя и эпидермального барьера липосомами с ДГК. Высокая степень усвояемости ДГК клетками кожных покровов была показана и при исследовании действия липосом на регенерацию кожных покровов при моделировании как ожеговых повреждений, так и асептических полнослойных кожных ран. Эксперименты проводились на базе Института экспериментальной и теоретической биофизики РАН (Пущино) и ФГУ «Институт хирургии им. А.В.Вишневского Росмедтехнологий" (Москва) с препаратом "Фламена D" и его модификациями.

Эффективность введения ДГК в липосомальной форме при пероральном применении исследовалась в ходе исследований проведенных в «ГУ НИИ фармакологии РАМН». В эксперименте на лабораторных крысах исследовалась фармакокинетика ДГК в чистом виде и в липосомальной форме, по времени и уровню содержания активного вещества в плазме крови.

Было показано, что ДГК в липосомальной форме более пролонгировано всасывается в кровь, чем ДГК в чистом виде. Время достижения максимальной концентрации для ДГК в чистом виде составило 0,5 ч, в то время как для липосомальной формы этот показатель составил 1 ч. Максимальная концентрация ДГК, определяемая в плазме крови крыс после введения липосомальной формы, была в 1,37 раза выше, чем для ДГК в чистом виде. Для «Фламены» этот показатель составил 9,56 мг/мл, а для ДГК - 6,97 мг/мл.

Дополнительные эксперименты по сравнению биодоступности ДГК в свободном и эмульсионно-связанном состоянии проводились на препарате «Фламена-D». Данные, полученные при изучении реакции глюкуроноконъюгации показывают, что основной показатель, характеризующий степень биологической доступности действующего вещества для липосомальной формы ДГК, в 1,59 раза выше, чем для ДГК в чистом виде.

Применение.

Приготовленная эмульсия была испытана в косметологической практике в качестве средства для ускорения регенерации кожных покровов, улучшение подкожного капиллярного кровообращения, стабилизация процессов обмена и т.д. Было отмечено значимое ускорение восстановительных процессов в коже и улучшение состояния по всем перечисленным позициям по сравнению с контрольной группой, где это средство не применялось.

Была проведена научно-исследовательская работа по изучению действия эмульсии на заживление ран и ожогов в эксперименте in vivo. Эмульсия наносилась поверхностно на искусственно сформированные раны с асептическим воспалением. Эксперимент проводился на белых крысах-самцах. Первоначально крысам в межлопаточной области формировали полнослойные кожные раны. У животных моделировали раны с негнойным (асептическим) воспалением. Для формирования ран на спинках животных (крысы) после депиляции под эфирным наркозом иссекали полнослойный участок кожи диаметром до 2,5 см до подлежащей фасции и приступали к лечению ран перевязочными средствами различного состава. В зависимости от вида повязки, применяемой для лечения ран, животные были распределены по группам:

1 - марлевая повязка с эмульсией «Фламена» (первая опытная группа);

2 - марлевая повязка с раствором ДГК (вторая опытная группа);

3 - марлевая повязка с физраствором (контрольная группа).

Контроль течения раневого процесса производили на основании:

1) данных клинического наблюдения за характером течения раневого процесса:

- наличия или отсутствия в области ран отека краев и тканей раны, гиперемии, болезненности при манипуляциях;

- наличия или отсутствия на поверхности ран некротического детрита и раневого экссудата;

- констатации сроков очищения ран от гнойно-некротического детрита, сроков купирования воспаления, появления грануляционной ткани, степени ее зрелости, начала эпителизации.

2) объективных критериев оценки течения раневого процесса:

- планиметрического метода оценки сокращения площади раневого дефекта.

- динамического морфологического анализа биоптатов ран экспериментальных животных

- микробиологического анализа.

По результатам клинического наблюдения течения раневого процесса экспериментальных ран и эффективности перевязочных средств с эмульсией «Фламена» и ДГК установлено:

1. В сравнительном аспекте эмульсия «Фламена» имеет более благоприятное воздействие на течение раневого процесса по сравнению с растворами ДГК и контрольной группой, приводящее к незначительному воспалению на ранних сроках течения раневого процесса.

2. По клиническим данным создается стабильное впечатление о благотворном влиянии препарата «Фламена» на ангиогенез на всех сроках наблюдения экспериментальных ран.

3. Анализируя результаты лечения экспериментальных полнослойных кожных ран, можно заключить, что препарат «Фламена» обеспечивает выраженное противовоспалительное и стимулирующее воздействие на ангиогенез и рост грануляционной ткани, что обеспечивает его эффективность с точки зрения положительного влияния на купирование процесса воспаления, развития регенераторных процессов и динамику сокращения раневого дефекта.

Проведенное морфологическое исследование показало эффективность применения эмульсии «Фламена» при лечении кожных ран. Раневое покрытие наиболее эффективно в конце I фазы, начале II фазы раневого процесса (2-5 сутки). «Фламена» стимулирует процессы ангиогенеза и пролиферации фибробластов значительно эффективнее, чем раневое покрытие ДГК (по морфологическим данным и количественному анализу). В результате применения «Фламена» степень зрелости грануляционной ткани на 5 сутки лечения ран была значительно выше, чем при лечении ран ДГК.

Также в эксперименте in vivo изучалось действие эмульсии «Фламена» при лечении химических и термических ожогов. На коже животного после депиляции под эфирным наркозом моделировался химический либо термический ожог 2-й степени. Далее на пораженное место опытным животным через определенные промежутки времени наносилась эмульсия «Фламена». Для контрольной группы использовали физ. раствор. Эффективность действия эмульсии «Фламена» оценивали по результатам морфологических и гистологических исследований. Полученные данные показывают значительное ускорение процессов заживления ожогов у животных. Отмечено также более благоприятное течение процессов регенерации кожного покрова - отсутствие рубца и более быстрое восстановление волосяного покрова.

Пример 2

Целью настоящей работы являлось определение оптимальных диапазонов концентрации активных веществ фосфолипидной эмульсии, при которых она сохраняет заявленные свойства.

Изучение процесса окисления эмульсии с различным содержанием ДГК было разделено на несколько этапов:

- исследование ТБК-активных продуктов в липосомальном препарате,

- исследование накопления непредельных соединений в липидной части препарата,

- изучение динамики рН вне липосомального окружения.

Приготовление фосфолипидной эмульсии производилось аналогично способу, описанному в примере 1, при изменении концентрации ДГК в двух диапазонах: 0,1-10,0 мг/мл и 10-30,0 мг/мл (что соответствовало % содержанию компонентов эмульсии 0,01-1,0 и 1,0-3,0 мас.%). Приготовление эмульсии во втором диапазоне изменений концентрации ДГК производилось при изменении концентрации того же фосфолипида (ФХ) в диапазоне 3-10 мас.%. с целью сохранения отношения содержаний фосфолипид/ДГК в пределах, близких к оптимальному (от 3 до 7,5). (Оптимальный диапазон был определен по положительным результатам клинических испытаний препарата "Фламена-D", полученного как это описано в Примере 1). Для определения нижнего предела допустимых концентраций ДГК (ниже 0,01 мас.%) готовились отдельные образцы, используемые только для изучения стрессовых вариантов окисления (см. ниже).

Материалы и методы:

Пробоподготовка образцов

Образцы препарата "Фламена-D" инкубировались при температуре 37°С по 3- схемам: 1) в атмосфере воздуха; 2) в присутствии 150 мкМ пероксида водорода; 3) с ежедневными добавками в образцы 150 мкМ пероксида водорода - варианты стрессовое окисление. На 1, 2, 6, 10 и 16 сутки производился забор образцов в объеме по 1 мл и до экспериментов хранились при -20°С.

В образцах определяли следующие параметры: в группе А - содержание ТБК-активных продуктов, в группе Б - содержание непредельных соединений, в группе В- изменение рН внелипосомальной среды. Для этих же образцов методом центрифугирования определяли реологическую устойчивость эмульсии.

А. Определение ТБК-актиных продуктов

К 50 мкл суспензии липосом добавляли 450 мкл раствора тиобарбитуровой кислоты (2,5 мг/мл) в 2% орто-фосфорной кислоте. Полученный раствор инкубировался при 100°С в течение 1 часа и затем после добавления 500 мкл 96% этилового спирта регистрировался спектр в диапазоне 450-650 нм (спектрофотометр UV-Vis "Specord-M40", Carl Zeiss, Германия). Математическими методами определялась оптическая плотность при 460, 500 и 532 нм, которые характерны для максимумов поглощения соответствующих ТБК-КС (карбонильных соединений).

Б. Определение содержания непредельных групп в липиде

К 50 мкл суспензии липосом добавляли 5 мкл спиртового раствора (5%) иода. После 1 часа инкубации к образцам добавляли 945 мкл 96% этанола и регистрировали спектр в диапазоне 450-700 нм (спектрофотометр UV-Vis "Specord-M40", Carl Zeiss, Германия).

Наличие пиков адсорбции, характерных для образования аддуктов с ТБК, при 490 и 510 нм обусловлено образованием монокарбонильных соединений (альдегидов) реагирующих с ТБК, тогда как для продукта конденсации ТБК-МДА характерно поглощение при 532 нм [Knight J.A., et.al., 1988; Kosugi H., et.al., 1985].

В. Измерение рН в образцах

Образцы липосом объемом 10 мл инкубировали при 37°С в атмосфере воздуха, насыщенной водяными парами (для предотвращения испарения образца). Ежедневно измерялось значение рН для данных образцов и соответствующих (по концентрации) растворов дигидрокверцетина в воде (рН-метр/ионометр "Mettler Toledo", Швейцария).

Анализ данных спектрофотометрии и рН-метрии проводился с помощью программ MS Excel и TableCurve 2D v. 5.0.

Полученные результаты в исследованиях по группе А (процессы накопления малонового диальдегида в зависимости от концентраций ДГК и фосфолипида, в том числе в длительной (до 10 суток при 37°С) инкубации при стрессовых окислителях с ежедневной нагрузкой эмульсии пероксидом водорода), по группе Б - изменениям (в зависимости от концентраций ДГК и фосфолипида) содержания ненасыщенных групп в составе липидов от добавок иода, вводимого к образцам через определенное время их инкубации при 37°С и по процессу деградации/формирования ненасыщенных групп в составе липида, определяемого по скорости изменения количества непредельных связей), и по группе В (изменения рН в процессе хранения препарата с разной концентрацией ДГК с достоверным установлением ингибирования процесса накопления карбоновых кислот в диапазоне концентрации ДГК 0,03-0,79 мг/мл, в пределах которой рН препарата составляет - 6,23±0,05), включая оценку реологической устойчивости эмульсии при верхних пределах концентраций ДГК и фосфолипидов, а также анализ всего полученного позволяют сделать следующие выводы:

- при прочих равных условиях, изменение в образцах концентрации ДГК в диапазоне от 0,01 мас.% до 3,0 мас.% допустимы при изменении концентрации фосфолипида в диапазоне от 0,15 мас.% до 10,0 мас.%, что не является фатальными для биохимической, реологической и рН устойчивости эмульсии;

- в первом диапазоне изменения ДГК (0,01-1,0 мас.%) и концентрации фосфолипида до 3,0 мас.% выявлена достоверная зона реологической и рН устойчивости эмульсии с дисперсионной средой как без глицина, так и с глицином в виде до 5,0%-ного раствора глицина в водной фазе;

- во втором диапазоне изменения ДГК (1,0-3,0 мас.%) в отсутствии глицина наблюдалось существенное нарушение реологической устойчивости эмульсии, особенно ярко выраженное при нижнем пределе концентрации фосфолипида (0,15 мас.%), при этом нарушения реологической устойчивости уменьшались с увеличением фосфолипидной фракции до 3,0 мас.% и глицина в диапазоне 0-5,0 мас.%.

- введение глицина в дисперсионную среду в диапазоне от 5,0% (при концентрации ДГК - 1,0 мас.%) и до 8,0 мас.% (при концентрации ДГК 3,0 мас.%) при одновременном повышении концентрации фосфолипида до 10,0 мас.% позволяет регулировать и добиться реологической устойчивости эмульсии, вполне удовлетворительной для практического ее использования.

Таким образом, для каждого конкретного случая практического использования препарата «Фламена-Д» его состав по содержанию ДГК, фосфолипидам и глицину может быть установлен, как преимущественный, в указанном диапазоне их концентраций.

Пример 3

Фосфолипидную эмульсию с другими МФЛ, получали аналогично способу, описанному в Примере 1. В качестве МФЛ использовали: фосфатидилэтаноламин (ФЭ), фосфатидилглицерин (ФГ), фосфатидилинозитол (ФИ) и фосфатиилглицерин (кардиолипин) при концентрации 3 мас.% в каждом случае.

Все четыре полученные фосфолипидные эмульсии испытывали на биохимическую, реологическую и рН устойчивости, аналогично описанному выше.

Данные по эмульсиям с разными МФЛ показали сходные результаты, достаточные для практического использования.

Пример 4

Препарат «Фламена-D» использовали на 100 пациентах (волонтерах) с различной патологией кожи: жирная себорея, акне 1-2 стадий - 30 пациентов; демодикоз - 20 пациентов; разацеа - 20 пациентов; старческая атрофия - 20 пациентов; пластическая хирургия - 10 пациентов. При проведении дерматокосметологических процедур использовались следующие аппаратные методики: «Skin Master Plus» - ультразвуковой пилинг, УЗ-увлажнение, «Biogenie» - микротоковый миолифтинг.

Получение фосфолипидной эмульсии соответствовало способу, описанному в примере 1. В зависимости от состояния кожных покровов пациентов и вида процедур, используемых при лечении кожи, выбиралось разное соотношение компонентов, входящих в состав фосфолипидной эмульсии, при их изменениях в следующих диапазонах (в мас.%): ДГК - 0,01-3,0; фосфолипид (лецитин) - 0,15-10,0; глицин 0,1-8,0; этиловый эфир аминоуксусной кислоты - процесс этерификации Gly спиртом (EtOH, 96-98,84%) был совмещен с процессом образования эмульсии и имел выход до 4,0 мас.%; содержание спирта в эмульсии - 0,05-20,0%. Дополнительно в эмульсию вводились загустители (препарат использовался в виде косметического молочка или крема) и ароматизаторы. Кремы для различных патологий были окрашены в разный цвет, для удобства использования.

Статистически обобщенные результаты испытаний показали следующее:

УЗ -ПИЛИНГ

Препарат «Фламена D» наносили на кожу пациентов до и после процедур УЗ-пилинга, механической чистки кожи и микротокового миолифтинга.

УЗ-пилинг осуществлялся по классической схеме. Частота процедур 1 раз в неделю. В 96% случаев отмечался значительный положительный эффект: сужение пор, появление румянца, подтяжка кожи лица, более быстрое заживление и исчезновение элементов сыпи.

В 4% случаев отмечался незначительный положительный эффект.

МЕХАНИЧЕСКАЯ ЧИСТКА ЛИЦА

Чистка лица проводилась по классической методике. Перед чисткой кожу очищали и наносили препарат «Фламена D». После снятия классически используемых масок наносили препарат «Фламена D».

В 100% случаев наблюдался выраженный положительный эффект. Отмечалась схожесть действия препарата «Фламена D» с эффектом процедуры криомассажа лица: подсушивание и более быстрое заживление элементов сыпи, сужение пор, уменьшение салотечения, уменьшение эритемы, улучшение цвета лица.

Микротоковый миолифтинг

Процедура осуществлялась по классической методике с использованием косметических препаратов фирмы «Biogenie». Препарат «Фламена D» наносили вместо классической маски «Biogenie» в конце процедуры.

В 100% случаев наблюдался положительный эффект: подсушивание и усиление лифтинга лица, улучшение цвета кожи, стягивание пор.

ХИРУРГИЯ

Препарат «Фламена D» наносили 10 пациентам на эрозивные поверхности при вялотекущем заживлении в области голени после иссечения рубцов. Наблюдалось формирование сочных грануляций с краевой эпителизацией на 7-10 дней раньше по сравнению с классическими способами отработки раневых поверхностей.

Пример 5

Оценка перспективности применения в терапевтических целях антиоксидантно-фосфолипидного комплекса препарата «Фламена-D».

Получение фосфолипидной эмульсии соответствовало способу и составу, описанным в примере 1, но с низким содержанием в эмульсии ЕtOН: до 5,0%. Для общеукрепляющего и тонизирующего воздействия в эмульсию был включен комплекс витаминов (А, В, Е, К, F, D.) в количествах, соответствующих рекомендуемой норме.

Предварительно были проведены диагностические обследования десяти больных с использованием эзофагогастроскопии. В результате обследований у всех больных были установлены различные формы патологий желудочно-кишечного тракта. В 80% случаев диагностированы одна или несколько эрозий и язвы 12-перстной кишки и желудка диаметром от 2 до 5 мм в острой и простой фазах, сопровождающиеся острым эрозивным или простым гастритом. При этом другие патологии желудочно-кишечного тракта находились пределах допустимых значений. В целях терапии выявленных патологий пациентам с эрозиями и язвами было назначено применение антиоксидантно-фосфолипидного комплекса перорально без назначения специальных диет. Курс приема определен в 6 недель с повторным осмотром. Во время курса больным рекомендован отказ от приема других терапевтических средств.

По окончании курса приема препарата все больные прошли аналогичное диагностические обследования с использованием эзофагогастроскопии.

В ходе обследования установлено, что в 100% случаев у больных отсутствуют аллергические и другие патологические проявления на прием перорально антиоксидантно-фосфолипидного комплекса.

В 50% случаев формы простых гастритов больных, а также другие сопровождающие патологии не претерпели изменений. В 25 процентах случаев острый и острый эрозивный гастрит изменил форму на простой гастрит. В оставшихся 25 процентах больных острый гастрит сохранился. При этом в 80 процентах случаев у больных зафиксирована полная эпитализация эрозий и язв, рубцы и другие патологические образования не обнаружены. В 20 процентах случаев отмечены сокращения размеров поверхностей язв более чем в два раза с исчезновением налета фибрина и некротических тканей. Курс приема антиоксидантно-фосфолипидного комплекса был продлен еще на 4 недели до окончательной эпитализации язв.

Проведенные исследования дают основание предположить высокую терапевтическую эффективность фосфолипидной эмульсии «Фламена-D» при эрозивно-язвенных патологий 12-перстной кишки и желудка.

Пример 6

Использование препарата «Фламена-D» для лечения пациентов с воспалительными заболеваниями век различного генеза

Получение фосфолипидной эмульсии соответствовало способу и составу, описанным в примерах 1 и 5, но с предельно низким содержанием в эмульсии ЕtOН: 0,05-1,0%.

Всего в исследование включены 32 пациента, в возрасте от 18 до 63 лет, со следующими видами патологий: хронические неспецифические блефароконъюнктивиты; аллергические блефароконъюнктивиты; постожоговые блефариты; блефарит на фоне псориаза; блефароконъюнктивальная форма синдрома «сухого глаза» (ССГ).

Препарат «Фламена-D» (100% раствор в ампулированной форме) назначался всем пациентам, вошедшим в исследование, для нанесения на поверхность кожи век, предварительно очищенную теплой водой с мылом, 2 раза в день (утром и вечером). Длительность лечения составляла от 7 до 10 дней, в зависимости от динамики патологического процесса. Контрольную группу составили 12 пациентов, с аналогичными заболеваниями, за исключением пациентов с постожоговыми блефаритами, которым проводилась сходная терапия, не включающая препарат «Фламена D».

У всех пациентов, основным параметром клинической эффективности являлась скорость исчезновения симптомов раздражения кожи век, гиперемии, отека век, формирование гладкой и чистой кожной поверхности. Оценивалась динамика выздоровления по данным биомикроскопии.

При опросе пациентов проводилась субъективная оценка качества и эффективности проводимого лечения. Субъективными критериями служили следующие показатели: «плохо», «удовлетворительно», «хорошо» и «отлично».

По данным проведенных исследований на фоне курса комплексной терапии блефароконъюнктивитов различной этиологии, включающей препарат «Фламена D», отмечено уменьшение симптоматики воспаления век и конъюнктивы во всех группах пациентов. Наибольшее влияние исследуемого препарата было отмечено при терапии аллергического блефароконъюнктивита и в группе пациентов с блефароконъюнктивальной формой ССГ.

Наши наблюдения позволяют сделать вывод о том, что препарат «Фламена D» дает хороший терапевтический эффект. При проведении биомикроскопии отмечалось исчезновение признаков воспаления век (наличие чешуек, корочек, гиперемии кожных покровов, отечности век).

В ходе проведенного исследования токсико-аллергических реакций на препарат «Фламена D» выявлено не было. По окончании курса лечения проводили опрос пациентов о переносимости препарата «Фламена D» в лечении всех групп пациентов. Оценка «отлично» и «хорошо» по данным наших исследований определена в 79% случаев.

Разработаны фосфолипидные комплексы в виде разных лекарственных форм: глазных капель, глазного геля, мазей и т.д.

Пример 7

Был проведен ряд экспериментов по использованию заявленного способа для создания полиаминокислотных препаратов на основе фосфолипидной эмульсии. Такие препараты показаны для применения при гипопротеинемии различного генеза, обширных глубоких ожогах, различных травмах, нагноительных процессах и т.д. (например, «Полиамин»).

Способ получения эмульсии был аналогичен, описанному в Примере 1, только при получении дисперсной среды к 5% раствору глицина добавляли смесь аминокислот в количестве до 0,8% по весу.

Сбалансированная смесь аминокислот включала на 1 л воды: аланин - 6,4 г, аргинин - 6,4 г, валин - 4,9 г, гистидин - 3,2 г, глицин - 8 г, изолейцин - 4,4 г, лейцин - 9,8 г, лизин - 11,5 г, метионин - 5,7 г, пролин - 6,4 г, треонин - 4,3 г, триптофан - 1,44 г, фенилаланин - 7 г.

Изучение полученной эмульсии позволило сделать следующие выводы:

- все аминокислоты вошли в состав липосом;

- эксперименты на крысах показали удовлетворительные результаты по времени и уровню содержания активных веществ в плазме крови;

- исследование стабильности и срока хранения такой эмульсии показало результаты, сходные с таковыми для базового препарата «Фламена-Д» (пример 1).

Проведенные эксперименты позволяют сделать вывод о получении заявленным способом устойчивых фосфолипидных эмульсий на основании различных аминокислот или их смесей.

Изобретение относится к области химии, пищевой, парфюмерно-косметической и фармацевтической промышленности, в частности к липосомной биологически активной форме дигидрокверцетина и способу ее получения. Фосфолипидная эмульсия содержит дигидрокверцетин, по меньшей мере, один мембранообразующий фосфолипид, глицин и водный раствор этилового спирта при содержании спирта от 0,05 до 20%. Для получения фосфолипидной эмульсии готовят раствор дигидрокверцетина и фосфолипида в этиловом спирте и дисперсионную среду, включающую раствор глицина в деионизованной воде, раскручивают дисперсионную среду до образования в ней стабильной воронки вращения, вводят раствор дигидрокверцетина в воронку вращения и разделяют полученную смесь на концентрат дисперсной фазы и дисперсионную среду. Техническим результатом является повышение стабильности и увеличение срока хранения эмульсии, а также улучшение биодоступности и селективности воздействия активных соединений. 2 н. и 11 з.п. ф-лы.

1. Фармацевтическая и косметическая фосфолипидная эмульсия, включающая дигидрокверцетин (ДГК), по крайней мере, один мембранообразующий фосфолипид (МФЛ), глицин, водный раствор этилового спирта, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Дигидрокверцетин 0,01-3% Фосфолипид 0,15-10% Глицин 1-8% Водный раствор этилового спирта 75-98,84%,

при содержании спирта от 0,05 до 20%.

2. Эмульсия по п.1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит аминоуксусный эфир в количестве не более 4 мас.%.

3. Эмульсия по любому из пп.1 и 2, отличающаяся тем, что ДГК содержится в стенках липосом.

4. Эмульсия по п.1, отличающаяся тем, что в качестве фосфолипида используют вещества из группы: фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилэтаноламин (ФЭ), фосфатидилглицерин (ФГ), фосфатидилинозитол (ФИ), фосфатидилглицерин (кардиолипин) или их смеси.

5. Эмульсия по п.1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит вещества из группы: глутамин, аспарагин, аланин, валин, гистидин, серин, изолейцин, треонин, пролин, цистеин, лизин, тирозин, фенилаланин, аргинин, метионин, триптофан, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, лейцин.

6. Эмульсия по п.1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит до 6% веществ, выбранных из группы: антиоксиданты, витамины и минералы, консерванты, красители, ароматизаторы, загустители.

7. Эмульсия по п.1, отличающаяся тем, что размер липосом лежит в пределах от 20 до 500 нм.

8. Эмульсия по п.7, отличающаяся тем, что 70% липосом имеют размер от 20 до 100 нм.

9. Эмульсия по п.1, отличающаяся тем, что имеет водородный показатель в диапазоне от 3,0 до 10,0 рН.

10. Способ получения фосфолипидной эмульсии по любому из пп.1-9, заключающийся в том, что готовят раствор дигидрокверцетина и, по крайней мере, одного мембранообразующего фосфолипида в этиловом спирте и дисперсионную среду, включающую раствор глицина в деионизованной воде; раскручивают дисперсионную среду до образования в ней стабильной воронки вращения; вводят раствор дигидрокверцетина в воронку вращения; разделяют полученную смесь на концентрат дисперсной фазы и дисперсионную среду в соотношении от 1:2 до 1:5; при необходимости, добавляют в концентрат водный раствор, по меньшей мере, одного вещества, выбранного из группы: глутамин, аспарагин, аланин, валин, гистидин, серин, изолейцин, треонин, пролин, цистеин, лизин, тирозин, фенилаланин, аргинин, метионин, триптофан, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, лейцин.

11. Способ получения фосфолипидной эмульсии по п.10, отличающийся тем, что раскручивают дисперсионную среду посредством вращения ротора в магнитном поле с частотой от 700 до 1500 об/мин.

12. Способ получения фосфолипидной эмульсии по п.10, отличающийся тем, что раствор дигидрокверцетина вводят в центр воронки вращения.

13. Способ получения фосфолипидной эмульсии по п.10, отличающийся тем, что разделяют полученную смесь на фракции путем отстаивания при температуре от 0 до 20°С.