АНТАГОНИСТЫ CDK2 В КАЧЕСТВЕ АНТАГОНИСТОВ КОРОТКОЙ ФОРМЫ ФАКТОРА ТРАНСКРИПЦИИ C-MAF ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛАУКОМЫ Российский патент 2009 года по МПК A61K31/52 A61F9/00 A61K31/404 A61P27/06 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области профилактических средств и терапевтических агентов для лечения глаукомы, в частности для первичной открытоугольной глаукомы и стероидной глаукомы.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Трабекулярная сеть (ТМ) является комбинированной тканью, включающей в себя эндотелиальные клетки, соединительную ткань и внеклеточный матрикс, расположенной под углом между роговицей и радужной оболочкой глаза, которая обеспечивает нормальное сопротивление, необходимое для поддержания внутриглазного давления (ВГД). Адекватное внутриглазное давление необходимо для поддержания формы глаза и для обеспечения градиента давления, обеспечивающего поток внутриглазной жидкости к лишенным сосудов роговице и хрусталику. Повышенное ВГД, обычно возникающее при глаукоме, обладает разрушительным действием на зрительный нерв, что приводит к потере клеток и аксонов ретинального ганглия и, в результате, к прогрессирующей потере зрения и слепоте в отсутствие лечения. Глаукома является одной из главных причин слепоты во всем мире.

Первичная глаукома возникает вследствие нарушений потока внутриглазной жидкости, которые имеют анатомическую или физиологическую основу. Вторичная глаукома встречается в результате повреждения или травмы глаза или в результате существующего заболевания. В девяноста процентах случаев первичной глаукомы ею является первичная открытоугольная глаукома (POAG), также называемая хронической или простой глаукомой. POAG отличается разрушением трабекулярной сети, что приводит к патологически высокому сопротивлению потоку жидкости из глаза. Следствием такого сопротивления является повышение ВГД, которое необходимо для обеспечения потока жидкости, продуцируемой в норме глазом, при таком повышенном сопротивлении.

Известно, что некоторые лекарственные средства, такие как преднизон, дексаметазон и гидрокортизон, индуцируют глаукому, повышая ВГД. Кроме того, на ВГД влияет, по-видимому, способ введения. Например, введение дексаметазона в глаз ведет к более высокому повышению ВГД по сравнению с системным введением. Глаукому, которая возникает в результате приема стероидных препаратов, называют стероидной глаукомой.

Существующие способы лечения глаукомы включают в себя снижение ВГД, используя супрессоры образования внутриглазной жидкости или средства, которые усиливают увеосклеральное вытекание, лазерную трабекулопластику (лазерную фотокоагуляцию трабекулярной сети глаза) или трабекулэктомию, которая представляет собой фильтрационную хирургию для улучшения дренирования. Фармацевтические подходы для лечения глаукомы обнаружили различные нежелательные побочные эффекты. Например, миотические средства, такие как пилокарпин, могут вызывать неясность зрения и другие отрицательные побочные зрительные эффекты. Системно вводимые ингибиторы карбоангидразы могут также вызывать тошноту, диспепсию, усталость и метаболический ацидоз. Кроме того, некоторые бета-блокаторы все чаще обуславливают серьезные легочные побочные эффекты, приписываемые их действию на бета-2-рецепторы в легочной ткани. Симпатомиметические средства вызывают тахикардию, аритмию и гипертонию. Такие отрицательные побочные эффекты могут привести к ухудшению соблюдения пациентом режима и схемы приема препарата или к прекращению лечения.

Более важным является то, что существующие методы лечения глаукомы не направлены непосредственно на патологическое нарушение в трабекулярной сети, зрительном нерве и на потерю клеток и аксонов ретинального ганглия, которое не ослабевает. Ввиду важности глаукомы и недостаточности предыдущих методов лечения было бы желательно иметь улучшенный способ лечения глаукомы, который был бы направлен на причины, лежащие в основе прогрессирования глаукомы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу лечения первичной открытоугольной глаукомы или стероидной глаукомы у пациента с риском развития первичной открытоугольной глаукомы или стероидной глаукомы или у которого имеются их симптомы. Способ предусматривает введение пациенту эффективного количества композиции, содержащей антагонист короткой формы фактора транскрипции c-Maf и приемлемый носитель.

В соответствии с изобретением было идентифицировано, что короткая форма фактора транскрипции c-Maf положительно регулируется в обработанных стероидами и трансформирующим фактором роста β2 (TGFβ2) клетках трабекулярной сети (ТМ) и присутствует в повышенных уровнях в глаукоматозных клетках по сравнению с клетками нормальной ткани диска глазного нерва, и в повышенных уровнях в глаукоматозной ткани ТМ в сравнении с нормальными клетками ТМ. Экспрессия короткой формы фактора транскрипции c-Maf при этих состояниях указывает на причинную или эффекторную роль этого фактора в патогенезе первичной открытоугольной и стероидной глаукомы. Способы по изобретению включают в себя антагонизм в отношении транскрипции, экспрессии и/или активности укороченной формы фактора транскрипции c-Maf в трабекулярной сети или другой глазной ткани, такой как ткань диска зрительного нерва, для ингибирования или ослабления патогенеза глаукомы.

Антагонист по настоящему изобретению препятствует транскрипции или экспрессии короткой формы фактора транскрипции c-Maf. В одном из вариантов осуществления, антагонист короткой формы фактора транскрипции c-Maf содержит аналог пурина, обладающий ингибиторной активностью в отношении циклин-зависимой киназы cdk2. Этот антагонист может содержать, например, пурваланол А, пурваланол В, аминопурваланол, оломоуцин, N9-изопропилоломоуцин, росковитин, метоксиросковитин, их комбинации или их соли.

Согласно другому варианту осуществления, антагонистом, обладающим ингибиторной активностью в отношении циклин-зависимой киназы cdk2, является непуриновое соединение, такое как, например, индирубин, оксиндол, инденопиразол, пиридопиримидин, анилинохиназолин, аминотиазол, флавопиридол, стауроспорин, пауллон, гимениалдизин, их комбинации и их соли.

Использование антагонистов экспрессии или активности короткой формы c-Maf в качестве терапевтических агентов для защиты или лечения у пациентов повреждения, вызываемого патогенезом глаукомы, направлено на развитие заболевания, наряду с симптомами этого заболевания, т.е. в результате этого лечения изменяется патологический процесс. Антагонисты экспрессии или активности короткой формы c-Maf могут использоваться для лечения POAG и стероидной глаукомы. Идентификация короткой формы фактора транскрипции c-Maf в качестве участника в патогенезе глаукомы и применение представленных здесь ингибиторов экспрессии или активности не было описано ранее.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 - QPCR-анализ экспрессии короткой формы c-Maf в объединенных клетках SGTM2697 демонстрирует экспрессию TGFβ2-индуцируемого гена, повышенную в 16 раз по сравнению с контролем.

Фиг.2 - QPCR-анализ экспрессии короткой формы c-Maf в клетках ТМ70А демонстрирует экспрессию дексаметазон-индуцируемого гена, повышенную в 2,5 раза в первый день и в 3,2 раза на 14-й день по сравнению с контролем.

Фиг.3 - QPCR-анализ экспрессии короткой формы c-Maf в клетках SGTM2697 (Р6) в присутствии и в отсутствие пурваланола А для базальных и TGFβ2-индуцированных клеток.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к применению агентов для антагонистического действия на экспрессию и/или активность короткой формы фактора транскрипции c-Maf для лечения глаукомы. Микромассивы генома человека гибридизовали с нормальными и глаукоматозными РНК, и ген короткой формы фактора транскрипции c-Maf положительно регулировался в клетках глаукомы по сравнению с нормальными клетками.

Maf-зависимые гены были идентифицированы как важные участники в развитии хрусталика и переднего сегмента (Yoshida, et al. (1997), Invest Ophtalmol Vis Sci 38(12): 2679-83; Ogino et al. (1998), Science 280(5360): 115-8; Kawauchi, et al. (1999), J Biol Chem. 274(27): 19254-60; Kim, et al. (1999), Proc Natl Acad Sci USA 96(7); 3781-5; Ring, et al. (2000), Development 127(2): 307-17; Ishibashi et al. (2001), Mech Dev 101(1-2): 155-66; Jamieson, et al. (2002), Hum Mol Genet 11(1): 33-42; Reza, et al. (2002), Mech Dev 116(1-2): 61-73). Было показано, что c-Maf активирует экспрессию гена хрусталика при активации продуктом гена глаукомы Рах6 (Sakai, et al. (2001), Nucleic Acids Res 29(5): 1228-37; Yoshida, et al, (2001) Curr Eye Res 23(2): 116-9) и, возможно, саморегулируется собственным генным продуктом (Kim, et al. (1999), Proc Natl Acad Sci USA 96(7): 3781-5).

c-Maf является фактором транскрипции лейциновой молнии основного района (bZIP). Члены семейства Maf обладают ≤40% гомологией по основному домену их bZIP-мотивов. Существуют короткие формы c-Maf, с одним экзоном, (373 аминокислоты) и длинные формы c-Maf, с двумя экзонами, (403 аминокислоты), но их функциональное различие остается неизвестным. Короткая форма с-Maf заканчивается метионином на С-конце. Дополнительная карбокси-концевая аминокислотная последовательность длинной формы представляет собой ITEPTRKLEPSVGYATFWKPQHRVLTSVFTK, SEQ ID NO:4. Как используется здесь, термин «короткая форма фактора транскрипции c-Maf» обозначает ген, который кодирует короткую форму фактора транскрипции c-Maf или белковый продукт, состоящий из 373 аминокислот последовательности белка, депонированной под номером доступа Gen Bank Accession no. AF55376.

В патенте США №6274339, выданном Glimcher et al., описание которого приведено здесь в качестве ссылки в полном объеме, описана последовательность нуклеиновой кислоты и последовательность белка c-Maf человека, а также антисмысловые молекулы и анти-c-Maf-антитела. Последовательность c-Maf патента США 6274338 помещена в GenPept под номером доступа № ААЕ79064. Эта последовательность соответствует длинной форме c-Maf, за исключением нескольких пропущенных аминокислот, включающих в себя делецию 3 аминокислот в положениях 241-243, по сравнению с последовательностью белка, содержащейся в GenBank под номерами AF055376 (последовательность короткой формы) и AF055377 (последовательность длинной формы).

Антагонисты короткой формы фактора транскрипции c-Maf

Антагонисты короткой формы фактора транскрипции c-Maf включают в себя агенты, которые, например, уменьшают транскрипцию гена короткой формы, ингибируют экспрессию короткой формы или ингибируют активность короткой формы. В частности, было обнаружено, что ингибиторы циклин-зависимой киназы cdk2, в частности аналоги пуринов, отрицательно регулируют транскрипцию короткой формы фактора транскрипции c-Maf. В таблице 1 представлен перечень антагонистов короткой формы фактора транскрипции c-Maf, обладающих ингибиторной активностью в отношении cdk2.

Дополнительные ингибирующие cdk2 агенты описаны в патенте США №6573044, выданном Gray et al., Rosania et al., Exp. Opin. Ther. Patents (2000) 10(2): 215-230, в частности, в разделе 3 относительно низкомолекулярных ингибиторов, Fischer, P.M., Celltransmissions 19:1, pg 3-9, March, 2003. Специалисту в данной области в свете настоящего изобретения будет понятно, что такие агенты могут быть рацемической смесью, или диастереомером, или энантиомером в зависимости от заместителей.

Несмотря на их химическое разнообразие, многие из соединений в Таблице 1 конкурируют с АТФ за сайт связывания в комплексе циклин/сdk2. Например, результаты структурного анализа показали, что пуриновая часть многих пуриновых ингибиторов связывается с аденинсвязывающим карманом cdk2, препятствуя его связыванию с истинным лигандом. Плоскостная система гетероциклического кольца является, по-видимому, структурным признаком, общим для многих ингибиторов cdk2.

Анализ антагониста короткой формы фактора транскрипции c-Maf предусматривает объединение предполагаемого антагониста с геном фактора транскрипции c-Maf в среде, в которой возможна транскрипция и экспрессия. Количество присутствующего фактора транскрипции c-Maf или уровень активности, меньшие, чем это количество и уровень активности в отсутствие предполагаемого антагониста, свидетельствует о том, что этот вероятный антагонист является действительно антагонистом c-Maf.

Способ введения

Антагонист может быть доставлен непосредственно в глаз (например, с использованием глазных капель или мазей для местного применения; устройства для медленного высвобождения в слепом мешке или имплантированного вблизи склеры или внутри глаза; периокулярной, конъюнктивальной, субтенориальной, внутрикамерной инъекцией, инъекцией внутрь стекловидного тела или внутрь каналов) или системно (например, перорально, внутривенной, подкожной или внутримышечной инъекциями; парентерально, дермальной доставкой) способами, хорошо известными специалистам в данной области. Дополнительно рассматривается получение антагонистов по изобретению в виде внутриглазного вкладыша или имлпантируемых устройств. Внутрикамерная инъекция может выполняться через роговицу в переднюю камеру, чтобы позволить агенту достичь трабекулярной сети. Инъекция внутрь канала может быть инъекцией в каналы венозного коллектора, дренирующие канал Шлемма, или в канал Шлемма.

Пациент: Пациентом, проходящим лечение первичной открытоугольной глаукомы или стероидной глаукомы, описанных здесь, может быть человек или животное с риском развития первичной открытоугольной глаукомы или стероидной глаукомы или у которых присутствуют симптомы первичной открытоугольной глаукомы или стероидной глаукомы.

Композиции и доза: Антагонисты по изобретению могут вводиться в виде растворов, суспензий или эмульсий (дисперсий) в подходящем офтальмическом носителе. Далее приведены примеры возможных композиций, воплощаемых данным изобретением.

  Количество в мас.% Ингибитор фактора транскрипции c-Maf 0,01-5; 0,01-2,0; 0,5-2,0 Гидроксипропилметилцеллюлоза 0,5 Хлорид натрия 0,8 Хлорид бензалкония 0,01% ЭДТА 0, 01 NaOH/HCl qs pH 7,4 Очищенная вода qs 100 мл     Количество в мас.% Антагонист транскрипции c-Maf 0,00005-0,5; 0,0003-0,3;   0,0005-0,03; 0,001 Забуференный фосфатом солевой раствор 1,0 Хлорид бензалкония 0,01 Полисорбат 80 0,5 Очищенная вода qs до 100%     Количество в мас.% Антагонист транскрипции c-Maf 0,001 Одноосновный фосфат натрия 0,05 Двухосновный фосфат натрия (безводный) 0,15 Хлорид натрия 0,75 Динатрий-ЭДТА 0,05 Кремофор EL 0,1 Хлорид бензалкония 0,01 НСl и/или NaOH pH 7,3-7,4 Очищенная вода qs до 100%     Количество в мас.% Антагонист транскрипции c-Maf 0,0005 Забуференный фосфатом солевой раствор 1,0 Гидроксипропил-β-циклодекстрин 4,0 Очищенная вода qs до 100%

В следующем варианте осуществления, офтальмические композиции готовят для получения внутриглазной концентрации приблизительно 0,1-100 нМ или, в дополнительном варианте осуществления, 1-10 нМ антагониста. Композиции для местного применения доставляют к поверхности глаза один-четыре раза в день по усмотрению клинициста. рН композиции должен быть 4-9 или 4,5-7,4. Композиции для системного приема могут содержать приблизительно 10-1000 мг антагониста.

Термин «эффективное количество» относится к количеству антагониста c-Maf, которое способно нарушать экспрессию или активность короткой формы c-Maf. Такое нарушение ведет к понижению внутриглазного давления и ослаблению симптомов глаукомы у пациента с симптомами первичной открытоугольной глаукомы или стероидной глаукомы. Такое нарушение задерживает или предотвращает возникновение симптомов у пациента с риском развития глаукомы. Эффективное количество композиции может зависеть от таких факторов, как возраст, раса и пол субъекта или, например, от тяжести глаукомы. В одном из вариантов осуществления, антагонист доставляется локально в глаз и достигает трабекулярной сети, сетчатки или диска зрительного нерва в терапевтической дозе, ослабляя, таким образом, патологический процесс глаукомы.

Хотя точная схема введения остается на усмотрение лечащего врача, полученные раствор или растворы предпочтительно вводят закапыванием одной капли каждого раствора (каждых растворов) в каждый глаз один-четыре раза в день или как указано лечащим врачом.

Приемлемые носители: Офтальмически приемлемым носителем называют носители, которые вызывают по меньшей мере небольшое раздражение или не вызывают его вовсе, обеспечивают подходящее консервирование, если необходимо, и доставляют один или несколько антагонистов c-Maf по изобретению в однородной дозе. Для глазной доставки ингибитор транскрипции c-Maf может быть объединен с офтальмически приемлемыми консервантами, сорастворителями, поверхностно-активными веществами, усилителями вязкости, усилителями проникновения, буферами, хлоридом натрия или водой для образования водной, стерильной офтальмической суспензии или раствора. Композиции офтальмических растворов могут быть приготовлены растворением ингибитора в физиологически приемлемом изотоническом водном буфере. Кроме того, офтальмический раствор может содержать офтальмически приемлемое поверхностно-активное вещество для способствования растворению ингибитора. Для улучшения удерживания соединения в композиции по изобретению могут быть добавлены создающие вязкость агенты, такие как гидроксиметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, метилцеллюлоза, поливинилпирролидон или т.п.

Для приготовления стерильной офтальмической композиции в виде мази антагонист c-Maf объединяют с консервантом в подходящем носителе, таком как минеральное масло, жидкий ланолин или белый вазелин. Стерильные офтальмические композиции могут быть приготовлены суспендированием антагониста c-Maf в гидрофильной основе, приготовленной, например, из комбинации

CARBOPOL®-940 (BF Goodrich, Charlotte, NC) или т.п., в соответствии со способами, известными в данной области для других офтальмических композиций. VISCOAT ® (Alcon Laboratories, Inc. Fort Worth, TX) может быть использован, например, для внутриглазной инъекции. Другие композиции данного изобретения могут содержать усиливающие проникновение агенты, такие как Кремефор и Твин® 80 (монолауреат полиоксиэтиленсорбитана, Sigma Aldrich, St. Louis, МО), в случае, когда антагонисты c-Maf являются менее проникающими в глаз.

Пример 1

Выделение РНК из ткани и клеток трабекулярной сети человека

Клетки трабекулярной сети человека (ТМ) получали из глаз донора (Central Florida Lions Eye and Tissue Bank, Tampa, Fl) и культивировали, как описано ранее (Steely, et al. (1992), Invest Ophtalmol Vis Sci 33(7): 2242-50; Wilson, et al. (1993), Curr Eye Res 12(9): 783-93; Clark, et al. (1994), Invest Ophtalmol Vis Sci 35(1): 281-94; Dickerson, et al. (1998), Exp. Eye Res 66(6): 731-8; Wang, et al. (2001), Mol Vis 7: 89-94). Клетки ТМ получали из пулов четырех, каждый, из нормальных клеточных линий или клеточных линий глаукомы. Суммарную РНК выделяли из клеток ТМ каждого пула с использованием реагента TRIZOL® в соответствии с инструкциями изготовителя (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Пример 2

Анализ с использованием Affymetrix GeneChip

Обратную транскрипцию, синтез второй цепи кДНК и мечение биотином РНК проводили в соответствии со стандартными протоколами Affymetrix. Чипы генов GENECHIPS® U133A и U133B (Affymetrix, Santa Clara, CA) генома человека гибридизовали, промывали и сканировали в соответствии со стандартными протоколами Affymetrix. Гибридизованные массивы GENECHIP® сканировали при помощи GENEARRAY®-сканера (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Необработанные данные собирали и анализировали с использованием программного обеспечения Affymetrix Microarray Suite.

Фильтрацию данных микромассивов выполняли с использованием программы GENESPRING® (Silicon Genetics, Redwood City, CA). Для каждого эксперимента данные нормализовали на один чип делением каждого измерения на 50-й процентиль всех измерений интенсивностей сигналов для этого чипа. Коэффициент экспрессии для каждого гена рассчитывали делением нормализованного сигнала на ген в обработанной или патологической пробе на медиану для этого гена в контрольной пробе для каждого эксперимента. Гены отбирали на уровень экспрессии более высокий, чем статистический фон, с использованием Cross-Gene Error Model и установлением фона, равного величине, пропорциональной уникальному основанию для каждого эксперимента. Для анализа учитывались только гены, которые были маркированы как присутствующие/маргинальные на GENECHIP® U133A Affymetrix во всех экспериментальных условиях. Ген короткой формы c-Maf представлен только один раз на GENECHIP® U133A в виде набора зондов 209348_s_at. Ген короткой формы c-Maf экспрессировался по меньшей мере в два раза больше в случае заболевания или обработки в сравнении с контрольными условиями.

Пример 3

Количественная ПЦР

кДНК первой цепи генерировали из 1 мкг тотальной РНК с использованием случайных гексамеров и реагентов Обратной Транскрипции TAQMAN ® в соответствии с инструкциями изготовителя (Applied Biosystems, Foster City, CA). Затем реакционную смесь 100 мкл разбавляли в 20 раз с получением эффективной концентрации кДНК 0,5 нг/мкл.

Измерение экспрессии гена короткой формы c-Maf выполняли с использованием количественной ОТ-ПЦР реального времени (QPCR) с применением системы детектирования последовательности ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems), по существу, как описано Shepard, et al. (2001) Invest Ophtalmol Vis Sci 42(13): 3173-81. Праймеры для специфической в отношении короткой формы амплификации c-Maf (GenBank accession #AF055376) конструировали с использованием программы PRIMER EXPRESS® (Applied Biosystems). Последовательности прямого и обратного праймеров были TTGGGACTGAATTGCACTAAGATATAA, SEQ ID NO:1, (нуклеотиды 3773-3799) и GCGTTCTAAACAGTTTTGCAATTTT, SEQ ID NO:2, (нуклеотиды 3823-3847) и последовательность зонда связывания малой бороздки была CTGCAAGCATATAATACA, SEQ ID NO:3, (нуклеотиды 3801-3818). 6 FАМ связывали с 5'-концом зонда связывания малой бороздки, и он является типом флуорофора, присоединенного к зонду TAQMAN®. Другим возможным флуорофором является флуорофор JOE™ (Applied Biosystems) или флуорофор VIC™ (Applied Biosystems). «Связывающий малую бороздку нефлуоресцентный гаситель» связывали с 3'-концом этого зонда и использовали для гашения флуоресценции из 6FAM. Амплификацию c-Maf-ампликона 75 п.н. нормализовали относительно уровней рРНК 18S с использованием 1х предварительно полученного набора праймер рРНК 18S/зoнд (20х 18S MASTER MIX®; (Applied Biosystems). QPCR c-Maf состояла из Универсальной Смеси 1x TAQMAN® (Applied Biosystems), концентраций 900 нМ и 100 нМ праймеров и зондов, соответственно, и 2,5 нг кДНК в конечном объеме 50 мкл. Условия термоциклов состояли из 50°С, 2 мин, 95°С, 10 мин с последующими 40 циклами при 95°С, 15 с, 60°С, 1 мин. Количественное определение концентраций кДНК выполняли с использованием способа получения кривых относительных стандартов, описанного в РЕ Biosystems User Bulletin #2, ABI PRISM® 7700 Sequence Detection System, 2001 (Applied Biosystems) и MS Excel 97 (Microsoft). Ссылочную тотальную РНК человека (Stratagene, La Jolla, CA) использовали для получения кривой стандартов. Данные количественной ПЦР (QPCR) представлены в виде среднего значения ± SEM c-Maf/18S-нормализованного отношения.

Пример 4

TGFβ2-индуцированная экспрессия гена c-Maf в клетках трабекулярной сети

Пример с использованием количественного ПЦР-анализа демонстрирует, что короткая форма c-Maf дифференциально положительно регулировалась в индуцированных трансформирующим фактором роста бета 2 глаукоматозных клетках.

Экспрессию гена короткой формы c-Maf анализировали с использованием Affymetrix U133 GENECHIP®-анализа, описанного в примере 2, пула глаукоматозных клеток трабекулярной сети, названных SGTM2697. Эти глаукоматозные клетки обрабатывали в течение 16 часов 5 нг/мл трансформирующего фактора роста бета 2 (TGFβ2) для индукции экспрессии гена. Экспрессию гена короткой формы c-Maf идентифицировали как положительно регулируемую. Подтверждение положительной регуляции c-Maf выполняли при помощи QPCR, как описано в примере 3, с использованием кДНК, полученной из РНК объединенных ± TGFβ32-обработанных клеток SGTM2697, использованных для Affymetrix СЕNЕСНIP®-анализа. Короткая форма c-Maf положительно регулировалась TGFβ2 с увеличением в 16 раз в сравнении с контролем, как показано на фиг.1. Данные фиг.1 представлены в виде нормализованного отношения c-Maf к уровням рибосомной мРНК 18S (Среднее ± SEM (стандартная ошибка среднего), n=3)).

Пример 5

Дексаметазон-индуцированная экспрессия гена c-Maf в клетках трабекулярной сети

Данный пример с использованием количественного ПЦР-анализа демонстрирует, что короткая форма c-Maf дифференциально положительно регулировалась в индуцированных дексаметазоном глаукоматозных клетках.

Экспрессию гена короткой формы c-Maf анализировали с использованием Affymetrix U133 GЕNЕСНIР®-анализа, описанного в примере 2, для глаукоматозных клеток трабекулярной сети, названных ТМ70А. Эти клетки обрабатывали в течение 1 дня или 14 дней 10^-7 М дексаметазоном (Dex). Экспрессию гена короткой формы c-Maf идентифицировали как положительно регулируемую. Подтверждение положительной регуляции c-Maf выполняли при помощи QPCR, как описано в примере 3, с использованием кДНК, полученной из РНК ± Dex-обработанных клеток ТМ70А, использованных для Affymetrix GЕNЕСНIР®-анализа. Короткая форма c-Maf положительно регулировалась TGFβ2 с увеличением в 2 раза в 1-й день и в 3,2 раза в 14-й день Dex-обработки в сравнении с контролем, как показано на фиг.2. Данные представлены в виде нормализованного отношения c-Maf к уровням рибосомной РНК 18S (Среднее ± SEM (стандартная ошибка среднего), n=3).

Пример 6

Ингибирование малой молекулой базальной и TGFβ2-индуцированной экспрессии гена c-Maf в клетках трабекулярной сети

Данный пример демонстрирует, что ингибитор cdk2 является антагонистом экспрессии короткой формы c-Maf.

Действие ингибирования малой молекулой на экспрессию короткой формы c-Maf анализировали при помощи QPCR-анализа, как описано в примере 2, в глаукоматозных клетках трабекулярной сети (6-й пассаж), названных SGTN2697. Эти клетки обрабатывали 5 нг/мл ТGFβ2 или без TGFβ2 и ингибитором комплекса cdk2/циклин А пурваланолом А в течение 16 часов (Hardcastle, et al. (2002) Annu Rev Pharmacol Toxicol 42: 325-348). Базальные уровни c-Maf отрицательно регулировались в 2,6 раз обработкой пурваланолом А, как показано на фиг.3. TGFβ2-обработанный c-Maf (положительно регулируемый в 17 раз) полностью устранялся одновременной обработкой пурваланолом А, как показано на фиг.3. Данные фиг.3 представлены в виде нормализованного отношения c-Maf к уровням рибосомной РНК 18S (Среднее ± SEM (стандартная ошибка среднего)), n=6). y-ось фиг.3 имеет нижнюю шкалу 0,00-0,03 и верхнюю шкалу 0,08-0,48.

Как подтверждено ингибированием пурваланолом А экспрессии гена короткой формы c-Maf, представленным выше, данное изобретение обеспечивает дополнительные ингибиторы циклин-зависимой киназы 2, как описано здесь, для применения в качестве антагонистов экспрессии короткой формы c-Maf. Такие антагонисты применимы в качестве профилактических или терапевтических агентов для защиты от повреждения или лечения повреждения, вызываемого патологическим процессом глаукомы.

Пример 7

Короткая форма фактора транскрипции c-Maf в глаукоматозной ткани диска зрительного нерва

Короткая форма фактора транскрипции c-Maf присутствует в повышенных уровнях в глаукоматозной ткани диска зрительного нерва в сравнении с нормальной тканью диска зрительного нерва, как показано с использованием Affymetrix GENECHIP® microarray-анализа. Ткань диска зрительного нерва получали из пулов глаз либо четырех нормальных, либо пяти глаукоматозных доноров. Тотальную РНК выделяли из ткани дисков зрительных нервов с использованием реагента TRIZOL® в соответствии с инструкциями изготовителя (Invitrogen). Экспрессия c-Maf короткой формы в этих условиях дополнительно свидетельствует о причинной или эффекторной роли со стороны этого фактора в патогенезе глаукомы. Обеспечен антагонизм в отношении экспрессии и/или активности фактора транскрипции c-Maf короткой формы для ингибирования или ослабления патогенеза глаукомы и для обеспечения нейрозащиты для сетчатки и зрительного нерва.

Цитируемые здесь ссылки в той степени, что они обеспечивают примеры процедур или другие подробности, дополняющие примеры, представленные здесь, приведены здесь в качестве ссылки.

Специалистам в данной области будет понятно, что могут быть произведены очевидные модификации описанных здесь вариантов осуществления без отклонения от идеи и объема данного изобретения. Все описанные здесь варианты осуществления могут быть произведены и выполнены без чрезмерного экспериментирования в свете данного описания. Полный объем данного изобретения представлен в данном описании и его эквивалентных вариантах осуществления. Это описание не должно рассматриваться как сужающее ненужным образом полный объем защиты, на который имеет право данное изобретение.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной офтальмологии, и может быть использовано для подавления положительной регуляции короткой формы фактора транскрипции с-Maf в обработанных стероидами или трансформирующим фактором роста β2 (TGF β2) клетках трабекулярной сети. Для этого вводят антагонист c-Maf, обладающий также ингибирующей активностью в отношении циклинзависимой киназы cdk2, например пурваланол А. Изобретение раскрывает механизм и возможный новый подход к лечению первичной открытоугольной и стероидной глаукомы. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 ил.

1. Способ подавления положительной регуляции короткой формы фактора транскрипции c-Maf в обработанных стероидами или трансформирующим фактором роста β2 (TGF β2) клетках трабекулярной сети (ТМ), включающий введение антагониста c-Maf, где указанный антагонист обладает ингибирующей активностью в отношении циклинзависимой киназы cdk2.

2. Способ подавления положительной регуляции короткой формы фактора транскрипции c-Maf в обработанных стероидами или трансформирующим фактором роста β2 (TGF β2) клетках трабекулярной сети (ТМ), включающий введение ингибитора циклинзависимой киназы cdk2.

3. Способ по п.1 или 2, где положительная регуляция короткой формы фактора транскрипции c-Maf вызывает первичную открытоугольную и стероидную глаукому.

4. Способ по п.2, где ингибитором циклинзависимой киназы cdk2 является пурваланол А.