СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОРОЗОСТОЙКОСТИ ОЗИМЫХ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР Российский патент 2009 года по МПК A01G7/00 A01H1/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к определению морозостойкости зерновых культур, и может быть использовано при селекции морозостойких генотипов озимых зерновых культур.

Большие потери урожая зерновых культур происходят из-за повреждения и гибели растений при неблагоприятных условиях перезимовки, главным из которых является действие низких температур в позднеосенний, зимний и ранневесенний периоды. Задача определения морозостойкости озимых зерновых культур простым и быстрым способом является актуальной.

Известны способы определения морозостойкости растений, в основе которых лежит изменчивость электропроводности растительных тканей (АС СССР №353684, 1972) интенсивности сверхслабого свечения (АС СССР №488548, 1975) и накопление в листьях связанной воды (Патент РФ №21451943, 1999).

Для реализации названных способов требуется наличие современной лаборатории, оснащенной сложным оборудованием, а также высокая квалификация исполнителей, что существенно препятствует их широкому использованию в селекционном процессе.

Известен способ определения морозостойкости растений путем промораживания целых растений при постепенно снижающейся с интервалом в одни сутки температуре (-7°С, -10°С, -13°С, -16°С). Затем их переносят для оттаивания в камеру с температурой 2°С. Через сутки эти растения высаживают в почву, а спустя три недели учитывают число отросших растений. Морозостойкость выражают в процентах от числа промороженных при определенной температуре. (Алексидзе Г.Я., Королев Н.П., Семенов И.Л., Выскребенцева Э.И. // Физиология растений. 1983. Т. 30. В. 6. С.1069.)

Недостатком способа являются длительность и трудоемкость. Известен способ оценки морозостойкости растений по содержанию связанной воды в листьях. Для оценки морозостойкости растений проводят проращивание семян в термостате в течение 20 суток на фильтровальной бумаге при круглосуточном освещении 5 тыс.лк. Закаливание проводят в холодильной камере в специальном режиме: первые семь суток при 1=0…+2°С, последующие трое суток при Т=-4…-5°С. В качестве оценочного показателя морозостойкости используют степень устойчивости, которая выражается соотношением содержания связанной воды в третьем листе проростков после и до закаливания, что обеспечивает большую степень объективности оценки. Для сравнительной оценки применяют сорта-дифференциаторы с известной степенью морозостойкости. (Патент РФ №2143194, кл. А01H 1/04, on. 27.12.99).

Недостатком способа являются длительность и трудоемкость. Наиболее ближайшим к заявляемому способу - прототипом - является способ определения морозостойкости растений путем помещения высечек из листьев на определенный срок при отрицательных температурах и определения с помощью микроскопа жизнеспособности клеток. Из листьев исследуемых растений острым бритвенным лезвием нарезают высечки размером 5-7 мм, которые насаживают на иглу и помещают в полупроводниковый микрохолодильник. После промораживания высечки микроскопируют.(С.Н.Дроздов, В.К.Курец, Н.П.Будыкин, Н.И.Балагурова, «Определение устойчивости растений к заморозкам.». В кн.: «Методы оценки устойчивости растений к неблагоприятным условиям среды». Л.: Колос, 1976). Данные, полученные методом промораживания высечек из листьев, хорошо согласуются с результатами прямого промораживания целых растений в холодильных камерах.

Недостатками прототипа являются сложность, необходимость использования специального микрохолодильника и микроскопа, большая длительность экспозиции (около 40 мин. при каждом изменении температуры), общая трудоемкость.

Технической задачей изобретения является упрощение способа определения морозостойкости растений, уменьшение его длительности и повышение производительности.

Поставленная техническая задача достигается заявляемым способом, заключающимся в том, что морозостойкость озимых зерновых культур определяют промораживанием фрагментов листьев, наклеенных на липкую ленту и помещенных между двумя металлическими пластинами в морозильной камере. После наклеивания всех листьев на липкую ленту острым скальпелем по линейке отрезают верхушку листьев шириной 3-4 мм и переносят в емкость с 0,1-0,5% раствора резорцина. Эта полоска служит контролем, так как не промораживалась и, соответственно, не окрашивается красителем. Промораживание ведут, начиная с выбранной экспериментально оптимальной температуры -13°С с постепенным понижением до -19°С за период 6 часов. Через определенные интервалы времени, преимущественно через 1, 3, 9, 30, 60, 120, 240, 480 минут ленту с наклеенными листьями достают из морозильной камеры, острым скальпелем отрезают часть липкой ленты с фрагментами листьев шириной 2-3 мм и помещают в резервуар с 0,1-0,5% раствором резорцина, который окрашивает убитые холодом фрагменты листьев в темно-синий цвет. Оставшуюся ленту с листьями помещают обратно между металлическими пластинами в морозильную камеру для дальнейшего промораживания. Промораживание продолжают до тех пор, пока все фрагменты листьев на очередной обрезанной полоске не окрасятся.

Оценочным показателем морозостойкости является степень устойчивости растений к холоду, которая выражается во времени промораживания, при котором происходит необратимое повреждение фрагментов листьев холодом, проявляющееся в растворе резорцина окрашиванием в темно-синий цвет, а также выделяют три группы растений по морозостойкости: морозостойкую (время промораживания 60 мин и выше), среднеморозостойкую (время промораживания 9-30 мин) и слабоморозостойкую (3 мин и ниже). Для сравнительной оценки морозостойкости используют предварительно срезанные верхушки испытываемых листьев, которые не подвергают промораживанию.

Изобретение позволяет определять морозостойкость срезанных листьев растений на любой стадии развития, начиная со стадии проростка высотой 5-10 см и до состояния зрелого растения. При этом анализируемые растения легко переносят потерю отрезанных фрагментов листьев и продолжают расти. За один прием можно проанализировать от 100 до 300 фрагментов листьев.

Определяющими отличиями заявляемого способа от прототипа являются:

- для наклейки анализируемых листьев используют липкую ленту, что позволяет повысить производительность способа, так как за один прием можно анализировать большое количество образцов листьев;

- перед промораживанием отрезают верхушку листьев шириной 3-4 мм и переносят в емкость с 0,1-0,5% раствора резорцина для использования в качестве контроля;

- промораживание ленты с наклеенными листьями осуществляют между металлическими пластинами при экспериментально подобранном оптимальном температурном режиме (-13°С -19°С), что позволяет ускорить способ и обеспечить хорошую повторяемость результатов анализа;

- через определенные интервалы времени, преимущественно через 1, 3, 9, 30, 60, 120, 240, 480 минут, ленту с наклеенными листьями достают из морозильной камеры, острым скальпелем отрезают часть липкой ленты с фрагментами листьев шириной 2-3 мм и выявляют убитые холодом растения;

- выявление убитых холодом фрагментов листьев растений осуществляют с использованием 0,1-0,5% раствора красителя - резорцина, что позволяет получить быстрое и стойкое окрашивание;

- в качестве оценочного показателя морозостойкости растений используют время промораживания, при котором происходит необратимое повреждение фрагментов листьев холодом, проявляющееся в растворе резорцина окрашиванием в темно-синий цвет.

Процедура промораживания не требует дорогостоящего оборудования. Можно использовать бытовую морозильную камеру или холодильник. Все это позволяет упростить известный способ определения морозостойкости и значительно увеличить его производительность.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

Проводили определение морозостойкости листьев 10-дневных проростков двух сортов озимой пшеницы и 10 различных генотипов пырея сизого.

Семена пшеницы и пырея высаживали по 25 шт. в пластиковые стаканчики объемом 200 мл, заполненные почвой. После 10 суток выращивания при комнатной температуре +20°С, у каждого проростка отрезали верхнюю часть листа длиной 3 см и наклеивали на полосу липкой ленты (скотч) (фиг.1). После наклеивания всех листьев острым скальпелем по линейке отрезали верхнюю полоску шириной 3 мм с кончиками листьев и переносили в резервуар с красителем - 0,1% раствором резорцина. Эта полоска служила контролем, так как не промораживалась и не окрашивалась красителем. Остальную полосу с листьями помещали между двумя металлическими пластинами, имеющими размер 100×400×3 мм с зазором 2,5 мм, которую предварительно охлаждали в морозильном отделе холодильника до исходной температуры -13°С. После этого включали секундомер, переводили холодильник в режим непрерывного охлаждения с постепенным понижением температуры на 1°С в час за период 6 часов. Через интервалы времени 1, 3, 9, 30, 60, 90, 120, 240 и 480 минут полосу с листьями вынимали и, отрезав очередную полоску шириной 3 мм, опять помещали между пластинами для дальнейшего промораживания. Отрезанные полоски с фрагментами листьев укладывали в емкость с 0,1% раствором резорцина ниже контрольной полоски в порядке, в каком они были срезаны. Уже через несколько минут погружения в краситель убитые холодом фрагменты листьев окрашивались в темно-синий цвет, тогда как контрольные и не убитые фрагменты не окрашивались и выглядели более светлыми. Это различие в окраске сохраняется очень долго - вплоть до полного испарения красящего раствора, поэтому определение морозостойкости можно вести как в процессе, так и через несколько суток после окончания промораживания. На фиг.2 представлен результат одного из экспериментов по определению морозостойкости.

Пример 2.

Предлагаемым способом, аналогично примеру 1, определили морозостойкость листьев 27 растений 5 генотипов пырея сизого. Для отдельных растений были получены значения морозостойкости листьев от М=3 мин. до М=90 мин. Далее, растения двух контрастных по значению М групп: с низкой (М≤3) и высокой (М≥60) морозостойкостью листьев переносили из тепла в холодильник на 10 суток при температуре +2°С. Результаты, приведенные в таблице 1 показывают, что в группе растений с низкой (М≤3) морозостойкостью листьев выжили 45% растений, тогда, как в группе растений с высокой (М≥60) морозостойкостью выжили 95% растений. Полученные данные показывают, что морозостойкость листьев растения коррелирует с морозостойкостью целого растения.

Пример 3.

Предлагаемым способом, аналогично примеру 1, определили морозостойкость листьев 10-дневных проростков озимой пшеницы двух морозостойких сортов: сорта Багратионовка, который в России длительное время был чемпионом по морозостойкости, и сорта Филатовка и 10 генотипов пырея сизого. В таблице 2 приведены средние значения морозостойкости листьев (Мср) и процент растений с низкой (МЗ) и высокой (М60) морозостойкостью. Как видно из табл.2, сорт озимой пшеницы Багратионовка имеет в среднем в 1,7 раза большую морозостойкость листьев (Мср=29), чем сорт Филатовка (Мср=17,2). Из исследованных генотипов пырея сизого только один генотип А-1 по морозостойкости листьев (Мср=37,5) в 1,3 раза превышал сорт озимой пшеницы Багратионовка (М=29). Генотип пырея А-2 имел среднюю морозостойкость листьев (М=26) незначительно уступающую сорту Багратионовка, но одно из 12 исследованных растений генотипа А-2 имело в 14 раз более высокую морозостойкость (М=540). Таким образом, предлагаемым способом обнаружены генотипы пырея сизого, со значительно большей морозостойкостью, чем у наиболее морозостойкого сорта озимой пшеницы Багратионовка. Выбранные морозостойкие генотипы пырея являются ценными донорами признака морозостойкости и могут быть использованы в технологии отдаленной гибридизации для получения морозостойких форм и сортов пшенично-пырейных гибридов.

Таким образом, предлагаемый способ можно использовать в качестве простого и быстрого метода анализа морозостойкости растений для отбора высокоморозостойких форм.

Способ определения морозостойкости озимых зерновых культур.

Таблица 1 Группы растений пырея сизого Исследовано растений Кол-во растений, выживших после обработки холодом Процент живых растений с высокой морозостойкостью листьев М≥60 40 38 95 с низкой морозостойкостью листьев М≤3 42 19 45

Таблица 2 Вид злака Пырей сизый Озимая пшеница Генотип 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Багратионовка Филатовка Кол-во растений 20 12 16 10 20 11 14 22 11 14 10 12 Морозостойкость М ср (мин) 38 26 15 9 13 7 12 9 2 12 29 17 % растений М≥60 75 58 19 10 20 18 29 19 0 36 60 34 М≤3 25 42 81 90 80 82 71 81 100 64 40 66

Способ определения морозостойкости озимых зерновых культур включает промораживание листьев растений. Листья исследуемых растений наклеивают на липкую ленту - скотч, отрезают верхушку листьев шириной 3-4 мм в качестве контроля, а оставшиеся фрагменты листьев помещают между двумя металлическими пластинами в морозильной камере. При этом промораживание ведут, начиная с температуры -13°С, с постепенным понижением последней на 1°С в час за период 6 часов. Далее через определенные промежутки времени отрезают часть липкой ленты шириной 2-3 мм с фрагментами листьев и помещают в емкость с 0,1-0,5% раствором резорцина, который окрашивает убитые холодом фрагменты листьев в темно-синий цвет, а оставшуюся часть ленты с листьями помещают обратно в морозильную камеру для дальнейшего промораживания. При этом в качестве оценочного показателя морозостойкости используют время промораживания, при котором происходит необратимое повреждение фрагментов листьев холодом. Заявленное изобретение обеспечивает упрощение способа определения морозостойкости растений, уменьшение его длительности и повышение производительности. 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 ил.

1. Способ определения морозостойкости озимых зерновых культур, включающий промораживание листьев растений, отличающийся тем, что листья исследуемых растений наклеивают на липкую ленту - скотч, отрезают верхушку листьев шириной 3-4 мм в качестве контроля, оставшиеся фрагменты листьев помещают между двумя металлическими пластинами в морозильной камере, а промораживание ведут начиная с температуры -13°С с постепенным понижением последней на 1°С в час за период 6 ч, далее через определенные промежутки времени отрезают часть липкой ленты шириной 2-3 мм с фрагментами листьев и помещают в емкость с 0,1-0,5% раствором резорцина, который окрашивает убитые холодом фрагменты листьев в темно-синий цвет, а оставшуюся часть ленты с листьями помещают обратно в морозильную камеру для дальнейшего промораживания, при этом в качестве оценочного показателя морозостойкости используют время промораживания, при котором происходит необратимое повреждение фрагментов листьев холодом.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что выявление необратимого повреждения фрагментов листьев холодом проводят через 1, 3, 9, 30, 60, 120, 240, 480 мин.