СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНАПЛАЗМЕННОГО АНТИГЕНА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ У ЖИВОТНЫХ Российский патент 2009 года по МПК A61K39/00 G01N33/50 G01N33/53 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной протозоологии, в частности, к разработке способа приготовления анаплазменного антигена для серологической диагностики.

Анаплазмоз рогатого скота - кровепаразитарная, трансмиссивная, природно-очаговая болезнь, протекающая с явлением глубокой анемии аутоиммунной природы и истощения, вызываемая возбудителями: A. marginale (Theiler, 1910) и A. centrale (Theiler, 1911) - у крупного рогатого скота и A. ovis (F. Lestoguard, 1924) - у мелкого рогатого скота - типичными прокариотами, по структуре близкими к представителям группы пситтакоза - лимфогранулемы - трахомы (хламидии) и риккетсиям.

В СССР гибель крупного рогатого скота и овец от анаплазмоза колебалось от 25% и выше (Гробов О.Ф. 1963; Н.И.Степанова, Л.П.Дьяконов, 1973; Л.П.Артеменко 1977). За рубежом гибель крупного рогатого скота от анаплазмоза значительная и достигает 50-80% (H.Seifert, 1960), а иногда и 96-100% (A.Lubrini, 1969).

Это заболевание является бичом животноводства, подрывая и парализуя работу хозяйств, т.к. поражает наиболее ценное племенное поголовье. Для ликвидации этой болезни требуется длительное время, затраты значительных средств и энергии.

Анаплазмоз рогатого скота - космополит - широко распространен и встречается на всех континентах нашей планеты, за исключением Антарктиды.

Из вышеописанного видно, что проблема диагностики анаплазмоза рогатого скота является актуальной.

Известно, что до недавнего времени единственным способом диагностики на анаплазмоз являлось микроскопическое исследование мазков крови от больных и подозреваемых в заболевании животных, требующее много сил, времени и высокого профессионализма исследователей. Учитывая морфологические особенности и размеры анаплазм, за них можно принять включения в эритроцитах разной природы (тельца Жоли, крупную редкую базофильную зернистость) и просто артефакты - последствия неправильного приготовления мазков крови, связанные с недостадочным обезжириванием предметных стекол, фиксацией и окрашиванием мазков (1).

Известен также способ приготовления анаплазменных диагностикумов, представляющий собой выделение из крови зараженных животных с помощью центрифугирования A. marginale или A. ovis, с последующей 2-3-кратной отмывкой их тем же способом, разрушением путем 2-3-кратного замораживания и оттаивания, концентрированием полученного материала и титрацией его в РДСК с положительными и отрицательными сыворотками. Таким образом получают соматический анаплазменный антиген для серологической диагностики в РДСК анаплазмоза рогатого скота во всем мире. При этом плазму крови зараженных животных, которая образуется после первого центрифугирования, выбрасывают, а из осадка после соответствующей обработки готовят соматический анаплазменный антиген (2) (Прототип).

Нашей задачей была разработка нового способа получения специфического и высокоактивного анаплазменного антигена.

Предложенный способ приготовления антигена (экзоантигена анаплазм) состоит в следующем: из крови овец или крупного рогатого скота, зараженных A. ovis или A. marginale, получают путем однократного центрифугирования (6000 об/мин в течение 10-15 мин) плазму, удаляют осадок анаплазм, обрабатывают 20-25% раствором полиэтиленгликоля - 6000, взятого в равном объеме с плазмой крови; далее полученную смесь оставляют при комнатной температурой на 13-20 мин, повторно центрифугируют при 6000 об/м 16-25 мин, после чего надосадочную жидкость удаляют, а полученный осадок используют как анаплазменный экзоантиген в серологических реакциях, при этом активность его должна состовлять 95-97%.

Полученный экзоантиген используют в РСК (РДСК) для серологической диагностики анаплазмоза овец и крупного рогатого скота.

Анаплазменный экзоантиген, приготовленный предложенным способом, испытан на специфичность и чувствительность в РСК (РДСК) с сыворотками крови от крупного рогатого скота и овец, зараженных бабезиозом и бруцеллезом, а также от здоровых овец и крупного рогатого скота.

Ни в одном случае эти сыворотки, кроме сывороток от зараженных анаплазмозом животных, не реагировали с растворимыми антигенами A. marginale или A. ovis.

Анаплазменный антиген, приготовленный предложенным способом, сравнительно испытан на чувствительность с соматическим антигеном, изготовленным традиционным способом. Конкретные примеры осуществления антигена, полученного предложенным способом, отражены в табл.1 и 2.

Кроме того, нами установлено, что антиген с активностью 95-97%, полученный предложенным способом, можно использовать для диагностики анаплазмозов в РСК, РНГА и ИФА с аналогичным результатом.

Как видно из приведенных таблиц, предложенный способ позволяет получить чувствительный и специфичный анаплазменный антиген.

Антиген, полученный предложенным способом, апробирован с положительным результатом в 30 областных ветеринарных лабораториях Российской Федерации. Главным ветеринарным управлением МСХ РФ 4 января 1990 года были внесены дополнения в Правила по племпродаже с/х животных, предусматривающие обязательное серологическое исследование на анаплазмоз крупного рогатого скота, овец и коз во избежание заноса инфекции в благополучные хозяйства с анаплазмоносителями.

Предложенный способ получения антигена найдет применение в ветлабораториях, занимающихся диагностикой инфекционных и протозойных болезней животных, и, тем самым, позволит своевременно выявить больных животных и принять экстренные меры по ликвидации данной инфекции.

Источники информации

1. Автореферат канд. Дисс., Ефремов Н.А. «Антиген для иммуноферментного анализа при диагностике токсоплазмоза животных». Республика Казахстан, Алма-Аты, 1998 с.10-12.

2. Докторская диссертация Георгиу Христофиса «Сравнительная оценка серологических тестов (РДСК, РНГА, и ИФА) для диагностики анаплазмоза рогатого скота и нутталлиоза лошадей» Москва 1977 г. стр.7-8, 59. (Прототип).

3. Бюл. ВИЭВ, выпуск 31, Москва 1977, стр.42-43.

4. Кандидатская диссертация Гробова О.Ф. «Экспериментальные исследования по выявлению возможного круга хозяев возбудителя анаплазмоза крупного рогатого скота Anaplasma marginale Theiler 1910. (Переносчики, восприимчивые животные). М., 1963 г., С.63-65. Гробов О.Ф.

5. Труды ВИЭВ, том 57, Москва, 1983, с.78.

6. Theiler A. Anaplasma marginale Ann. Transvaal. Mus. Bd. 2, 1910.

7. Theiler A. Further investigations uin to Anaplasmosis of South African cattle, - Rep. Director of veterinary Research Union of South Atrica. 1, 1911.

8. Lestoquard F. Les piroplasmoses du mouton Algerie. Bull. Soc. Path. exot., 11, 1924.

9. Seifert H. Control of cattle losses in the moutons of north Peru - ZBI, vet. Med., 7, 1960: 991-1015.

10. Lubrini A. L'anaplasmosi bovina nel Kasal. Vetiraliana Anno XII, 1960.

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной протозоологии. Заявлен способ получения анаплазменного антигена для серологической диагностики у животных, включающий заражение возбудителем анаплазмоза рогатого скота, выделение анаплазм из крови путем центрифугирования, определение активности в РДСК, отличающийся тем, что из плазмы, полученной после центрифугирования и отделения ее из крови зараженных животных, удаляют осадок анаплазм, обрабатывают 20-25% раствором полиэтиленгликоля - 6000, взятого в равном объеме с плазмой крови; далее полученную смесь оставляют при комнатной температуре на 13-20 мин, повторно центрифугируют при 6000 об/м 16-25 мин, после чего надосадочную жидкость удаляют, а полученный осадок используют как анаплазменный экзоантиген в серологических реакциях, при этом активность его должна составлять 95-97%. Заявленное изобретение обеспечивает получение высокоактивного анаплазменного антигена. 2 табл.

Способ получения анаплазменного антигена для серологической диагностики у животных, включающий заражение возбудителем анаплазмоза рогатого скота, выделение анаплазм из крови путем центрифугирования, определение активности в РДСК, отличающийся тем, что из плазмы, полученной после центрифугирования и отделения ее из крови зараженных животных, удаляют осадок анаплазм, обрабатывают 20-25% раствора полиэтиленгликоля - 6000, взятого в равном объеме с плазмой крови, далее полученную смесь оставляют при комнатной температуре на 13-20 мин, повторно центрифугируют при 6000 об/м 16-25 мин, после чего надосадочную жидкость удаляют, а полученный осадок используют как анаплазменный экзоантиген в серологических реакциях, при этом активность его должна составлять 95-97%.