СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ АНАПЛАЗМОЗА МЕЛКОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2014 года по МПК A61K39/00 G01N33/53 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной протозоологии, в частности к разработке способа приготовления анаплазменного антигена для серологической диагностики у рогатого скота.

Анаплазмоз рогатого скота - кровепаразитарная, трансмиссивная, природно-очаговая болезнь, протекающая с явлением глубокой анемии аутоиммунной природы и истощения, вызываемая возбудителями: A. marginale (Theiler, 1910) и A. centrale (Theiler, 1911) - у крупного рогатого скота и A. ovis, (F. Lestoguard, 1924) - у мелкого рогатого скота. Анаплазмами являются типичные прокариоты, по структуре близкими к представителям группы пситтакоза - лимфогранулемы - трахомы (хламидии) и риккетсиям.

В СССР и в настоящий время в РФ гибель крупного рогатого скота и овец от анаплазмоза колебалась от 25% и выше. За рубежом гибель крупного рогатого скота от анаплазмоза достигает 50-80%.

Это заболевание является бичом животноводства, подрывая и парализуя работу хозяйств, т.к. поражает наиболее ценное племенное поголовье. Для ликвидации этой болезни требуется длительное время, затраты значительных средств и энергии.

Анаплазмоз овец широко распространен и встречается на всех континентах нашей планеты, за исключением Антарктиды.

Из вышеописанного видно, что проблема диагностики анаплазмоза рогатого скота является актуальной. До настоящего времени единственным способом диагностики анаплазмоза являлось микроскопическое исследование мазков крови от больных и подозреваемых в заболевании животных, процесе трудоемок и требует высокого профессионализма исследователей. Учитывая морфологические особенности и размеры анаплазм, за них можно принять включения в эритроцитах разной природы (тельца Жоли, крупную редкую базофильную зернистость) и просто артефакты - последствия неправильного приготовления мазков крови, связанные с недостадочным обезжириванием предметных стекол, фиксацией и окрашиванием мазков [1].

Известен также способ приготовления анаплазменного антигена, представляющий собой выделение из крови зараженных животных A. marginale или A. ovis, путем центрифугирования с последующей 2-3-кратной отмывкой и способом разрушением эритроцитов методом осмотического шока с применением дистиллированной воды, гипотонического раствора хлорида натрия, и 0,83%-го раствора хлорида аммония концентрированием полученного материала и титрацией его в РСК и РДСК с положительными и отрицательными сыворотками. Таким образом, получают эритроцитарный анаплазменный антиген для серологической диагностики в РСК анаплазмоза рогатого скота во всем мире [2] (Прототип).

Для приготовления анаплазменного антигена, применяемого в серологических реакциях, используют кровь от больного животного, из которой после разрушения эритроцитов выделяют чистые анаплазмы. На активность такого антигена большое влияние оказывает уровень пораженности эритроцитов крови донора анаплазмами - чем выше паразитемия, тем активнее антиген.

Обычно паразитемия у овец при анаплазмозе сравнительно невысока и в наших опытах у отдельных животных не превышала 10-15%. В связи с этим для получения большой паразитемии мы использовали, как правило, спленэктомированных животных. До сего времени не было известно когда лучше ее проводить - до заражения животных или после переболования их анаплазмозом.

В задачу наших исследований входило-разработка и внедрение способов получении высокоактивного и высокоспецифичного анаплазменного антигена для серологических реакциях РСК и РДСК для рогатого скота.

Это удалось достичь благодаря того, что спленэктомированному животному вводят заражающую дозу 14·10¹⁰ или 16·10⁷ анаплазм/животное, на 15 или 22-24, соответственно, день проводят обескровливание, кровь центрифугируют 2-3 раза при 6000 об/мин в течение часа с физиологическим раствором pH 6,8-7,2, получают осадок анаплазм с форменными элементами крови, проводят 2-3-разовую отмывку физиологическим раствором, разрушают эритроциты путем 2-3-кратного замораживания и оттаивания, концентрируют 2-3 раза центрифугированием при тех же условиях и выделяют антиген с титром 1:32-1:64.

Полученный антиген используют для титрации в РСК и РДСК с положительными и отрицательными сыворотками овец и крупного рогатого скота табл.3.

Конкретные примеры осуществления отражены в табл.1 и 2. Использовали 29 овец, у 14 из которых вначале удалили селезенку а затем заразили их анаплазмозом. У оставшихся 15 животных селезенка была удалена в различные сроки после переболевания их анаплазмозом.

Пример №1: У баранов №1 и 2 одно- и двухгодовалого возраста (помесь мериносовой породы с романовской) и 5 овец №3-7 аналогичного возраста была удалена селезенка. На второй день после спленэктомии каждому животному ввели подкожно по 40 мл цитратной крови от переболевших анаплазмозом доноров, содержащей 5·10⁷ анаплазм/животное. За животными вели ежедневные наблюдения и проводили все указанные исследования.

Спустя 25-30 дней после спленэктомии на высоте паразитемии (25-60%) животных обескровили и из их крови приготовили 7 серий анаплазменного антигена.

Активность анаплазменного антигена устанавливали в РСК и РДСК по схеме, приведенной в табл.1.

Высокая паразитемия у животных в первом примере достигнута к 25-30 дню. Как видно из таблицы от 2-х животных (№1 и №4), у которых паразитемия не превышала 25-40%, соответственно и антигены были получены слабо-активные (рабочие титры 1:4 и ниже). Все антигены, (кроме двух, которые были антикомплементарными, получены от овец (№6 и 7), у которых паразитемия развивалась медленно, и обескровлены они были в период, когда в их крови выявлены высокие титры антител - от 1:40 до 1:80.), приготовленные из инвазированной анаплазмами крови (паразитемия 50-60%), оказались активными в титре 1:8 - 1:16 (табл.1).

Пример №2: двум овцам (№8-9), 8-9-месянного возраста была удалена селезенка. На второй день после спленэктомии животным подкожно ввели по 120 мл цитратной крови, содержащей 14·10¹⁰ анаплазм/животное. На 15-й день после заражения на высоте паразитемии (80-90%) овцы были обескровлены. Антигены, приготовленные из этой крови оказались активными в титрах от 1:16 до 1:32 (табл.1).

Пример №3: пяти овцам (№10-14) 8-месячного возраста удалили селезенку, ввели подкожно цитратную кровь от носителя в количестве 120 мл, содержащую 16-10 анаплазм/животное. На 22-24 день после заражения при паразитемии 65-85% овцы были обескровлены. Все антигены, приготовленные из инвазированной анаплазмами крови, оказались активными в титрах - 1:32-1:64 (табл.1).

Таблица 1 Влияние дозы анаплазм, введенных спленэктомированным овцам, на интенсивность инвазии и титры приготовленных антигенов № животных Возраст (мес) Количество введенной крови (мл) Сроки обескровливания после спленэктомии (дней) Паразитемия при обескровливании в % Рабочие титры антигенов титрованных с положительными сыворотками КРС и овец 1-й пример (ввели 5·10⁷ анаплазм/животное) 1 13 40 26 40 1:4 1:4 2 24 40 30 60 1:16 1:16 3 16 40 25 50-60 1:8 1:8 4 18 40 28 25-30 Ниже 1:4 5 18 40 30 50 1:16 1:16 6 18 40 27 40 антикомплементарный 7 18 40 25 60 " 2-й пример (ввели 14·10¹⁰ анаплазм/животное) 8 18 120 15 80-90 1:32 1:32 9 18 120 15 80-90 1:32 1:32 3-й пример (ввели 16·10¹⁰ анаплазм/животное) 10 8 120 23 80-85 1:32 1:32 11 8 120 23 70-75 1:32 1:32 12 8 120 24 80-85 1:64 1:64 13 8 120 22 65-70 1:32 1:32 14 8 120 23 75-80 1:64 1:64

Если в 1-м примере, где заражающая доза составила 5·10⁷ анаплазм, максимальная паразитемия на уровне 25-60% была достигнута к 25-30 дню, то во 2-м и 3-м примерах, где для заражения овец применили дозу 14·10¹⁰ или 16·10⁷ анаплазм/животное, гораздо большая паразитемия (80-90%) была достигнута на 15 или 22-24 дней. Антигены с высокими титрами 1:32-1:64 получили только от тех овец, которым после спленэктомии вводили большое количество крови, содержащей не меньше 14·10¹⁰ или 16·10⁷ анаплазм/животное и обескровили при высокой паразитемии - 65-90%.

Таким образом, проведенные примеры показали, что уровень паразитемии у зараженных овец и сроки, необходимые для достижения ее максимальной величины, находятся в прямой зависимости от количество введенного крови, от содержания анаплазм в крови, от периода переболевания донора от возраста и однородного возраста подопытных овец.

В 1-ом примере, где заражающая доза составила 5-10 анаплазм, максимальная паразитемия на уровне 25-60% была достигнута к 25-30 дню, потому, что кровь для заражения взято от донора с не высокой паразитемии и давно заболевшего. Кроме того под опытные овцы имели не однородного возраста (от 18-24 месячного).

Во 2-м и 3-м примере, где для заражения овец применили дозу 14·10¹⁰ и 16·10⁷ анаплазм/животное, гораздо большая паразитемия 80-90% была достигнута на 15 или 22-24 дней быстрее - кровь для заражения взята от донора с высокой паразитемии и недавно заболевшего. Кроме того, подопытные овцы имели однородный возраст (2-й пример - 18-месячный и 3-й пример, 8-месячный).

Во второй серии примеров использовали овец-анаплазмоносителей, которых спленэктомировали в различные сроки после переболевания с целью получить у них высокую паразитемию.

Пример №4: 1-я группа. Овец №15, 18, 20 спленэктомировали через 557, 326 и 210 дней после переболевания, а овец №16, 17, 19, 21-23-спустя 120-180 дней. Так от овец 4-го примера 1-й группы, которых обескровили при высокой паразитемии 60-98%,

получили антигены в титрах - от 1:16 до 1:32 и только от одной овцы, которую спленэктомировали спустя 557 дней носительства, получили антиген с невысокими титрами - 1:8.

2-я группа. Четырех овец №24-27 спленэктомировали спустя 90 дней после переболевания. У животных первой группы (см. табл.2) максимальная паразитемия 60-98% наступило 16-26 дню после их спленэктомии. Все показатели крови за указанный период до спленэктомии, восстановились полностью и вторичная анемия наступила после того, как у животного развилась высокая паразитемия в результате удаления селезенки.

У тех анаплазмоносителей, которых спленэктомировали после 90 дней носительства (2-я группа животных), результаты оказались хуже. При получении невысокой паразитемии (35-40%) развивалась анемия (табл.2).

Таблица 2 Влияние сроков паразитоносительства, предшествовавших спленэктомии, на интенсивность инвазии и титры антигенов Возрасть (мес) Сроки спленэктомии после переболевания (дней) Сроки обескровливания после спленэктомии (дней) Паразитемия при обескровливании в % Рабочие титры антигенов титрованных с положительными сыворотками КРС и овец 27 557 20 60-70 1:8 1:8 16 175 20 90-98 1:32 1:32 16 175 18 90-98 1:32 1:32 16 326 17 95-98 1:32 1:32 14 180 16 90-95 1:32 1:32 8 210 20 65-70 1:16 1:16 14 180 26 65-70 1:16 1:16 18 150 25 65-70 1:16 1:16 18 120 20 70-75 1:32 1:32 16 90 24 35-40 1:8 1:8 16 90 17 35-40 1:8 1:8 16 90 17 35-40 1:8 1:8 16 90 20 65-70 1:16 1:16 24 180 22 70-75 1:16 1:16 24 180 22 80-85 1:64 1:64

Аналогичные результаты отмечены у животных, спленэктомированных спустя 160-180 дней после их переболевания анаплазмозом (прим.5). Однако недостаток последнего способа заключается в том, что необходимо животных сначала заразить для развития первичного заболевания, ждать, пока переболеют и только через 4-6 месяца спленэктомировать (табл.2).

Этот пример показал, что для получения высокой паразитемии 60-98% анаплазмоносителей необходимо спленэктомировать спустя 160-180 и более дней носительства.

Активность анаплазменных антигенов, полученных из крови опытных овец, показала, что она находится в прямой зависимости от паразитемии у обескровленных животных.

Таблица 3 Титры антител в лиофилизированных сыворотках овец и рогатого скота, переболевших анаплазмозом, выявляемые с гомологичных и гетерологичных антигенов анаплазм крупного помощью № Серии Титры антител в высушенных сыворотках крови овец, выявляемых с антигенами A.ovis A.marginale № Серии Титры антител в высушенных сыворотках крови крупного рогатого скота, выявляемых с антигенами A.ovis A.marginale Позитивные 1 1:80 1:80 1 1:160 1:160 2 1:80 1:80 2 1:40 1:40 3 1:80 1:80 3 1:40 1:40 4 1:160 1:160 4 1:40 1:40 5 1:40 1:40 5 1:20 1:20 6 1:160 1:160 6 1:40 1:40 Негативные 1 - - 1 - - 2 - - 2 - - 3 - - 3 - -

Таким образом, проведенные примеры показали, что уровень паразитемии у зараженных овец и сроки, необходимые для достижения ее максимальной величины, находятся в прямой зависимости от количество введенного крови, от содержания анаплазм в крови, от периода переболевания донора и от возраста подопытных овец.

Анаплазменный антиген, приготовленный предложенным способом, испытан на специфичность и чувствительность в РСК и РДСК с сыворотками крови от крупного рогатого скота и овец, зараженных анаплазмозом, бабезиозом и бруцеллезом, а также от здоровых овец и крупного рогатого скота (табл.4).

Таблица 4 Определение специфичности в РСК и РДСК с анаплазменным антигеном (A.ovis) № Сыворотки Разведение сывороток БА 1:5 1:10 1 Положит. №1 от КРС, зараженного A.marginale Полож. Полож. Отрицат. 2 Положит. №1 от овцы, зараженной A.ovis Полож. Полож. Отрицат. 3 От здорового КРС Отрицат. Отрицат. Отрицат 4 От здоровой овцы Отрицат. Отрицат. Отрицат 5 От КРС переболевшего бруцеллезом Отрицат. Отрицат. Отрицат. 6 От овцы, переболевшей бруцеллезом Отрицат. Отрицат. Отрицат 7 От овцы, переболевшей бабезиозом Отрицат. Отрицат. Отрицат

Эти сыворотки, ни в одном случае кроме сывороток от зараженных анаплазмозом животных, не реагировали с антигенами A.ovis.

Кроме того, нами установлено, что предложенный антиген с активностью 95-97% можно использовать для диагностики анаплазмозов в РСК и РДСК, РНГА и ИФА с аналогичным результатом.

Как видно из приведенных таблиц, предложенный способ позволяет получить чувствительный, и специфичный анаплазменный антиген (A.ovis).

Антиген, полученный предложенным способом, апробирован с положительным результатом в 30 областных ветеринарных лабораториях Российской Федерации с 1979-2010 гг. Главным ветеринарным управлением МСХ РФ Утверждены «Правила по племпродаже с/х животных, предусматривающие обязательное серологическое исследование на анаплазмоз крупного рогатого скота, овец и коз во избежание заноса инфекции в благополучные хозяйства с анаплазмоносителями» 1990 г.

Предложенный способ получения антигена найдет применение в вет лабораториях, занимающихся диагностикой инфекционных и протозойных болезней животных и, тем самым, позволит своевременно выявить больных животных и принять экстренные меры по ликвитации данных анаплазмоза.

Источники информации

1. Степанова Н.И. РСК при анаплазмозе крупного рогатого скота. Ветеринария, №4, 1961, 45-46.

2. Докторская диссертация «Сравнительная оценка серологических тестов (РДСК, РИГА и ИФА) для диагностики анаплазмоза рогатого скота и нутталлиоза лошадей». - Москва, 1977 г. Стр.40-41. Георгиу Христофис.

3. Кандитаская диссертация «Экспериментальный анаплазмоз овец (симптомокомплекс, иммунологические реакции)». - Москва, 1980 г. Стр.23-24. Георгиу Христофис.

Изобретение относится к области ветеринарной протозоологии и касается способа получения антигена для серологической диагностики анаплазмоза мелкого рогатого скота. Предложенный способ включает введение спленэктомированному животному заражающей дозы 14·10¹⁰ или 16·10⁷ анаплазм/животное, на 15 или 22-24 соответственно день, проведение обескровливания, центрифугирование крови 2-3 раза при 6000 об/мин в течение часа с физиологическим раствором pH 6,8-7,2, получение осадка анаплазм с форменными элементами крови, проведение 2-3 разовой отмывки физиологическим раствором, разрушение эритроцитов путем 2-3 кратного замораживания и оттаивания, концентрирование 2-3 раза центрифугированием при тех же условиях и выделение антигена с титром 1:32-1:64. Способ позволяет получить чувствительный, высокоактивный и специфичный анаплазменный антиген и найдет применение в ветеринарных лабораториях, занимающихся диагностикой инфекционных и протозойных болезней. 4 табл., 4 пр.

Способ получения анаплазменного антигена для серологической диагностики анаплазмоза мелкого рогатого скота, отличающийся тем, что спленэктомированному животному вводят заражающую дозу 14·10¹⁰ или 16·10⁷ анаплазм/животное, на 15 или 22-24, соответственно, день, проводят обескровливание, кровь центрифугируют 2-3 раза при 6000 об/мин в течение часа с физиологическим раствором pH 6,8-7,2, получают осадок анаплазм с форменными элементами крови, проводят 2-3 разовую отмывку физиологическим раствором, разрушают эритроциты путем 2-3 кратного замораживания и оттаивания, концентрируют 2-3 раза центрифугированием при тех же условиях и выделяют антиген с титром 1:32-1:64.