СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ЭПИЗООТИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ НА БРУЦЕЛЛЕЗ СТАД КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ИММУНИЗИРОВАННОГО ЖИВЫМИ ВАКЦИНАМИ ИЗ ДИССОЦИИРОВАННЫХ ШТАММОВ БРУЦЕЛЛ Российский патент 2014 года по МПК A61K39/10 

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к диагностике инфекционных болезней.

В настоящее время в РФ официально принята система противобруцеллезных мероприятий, включающая проведение профилактической и вынужденной иммунизации крупного рогатого скота с использованием двух живых вакцин из диссоциированных штаммов бруцелл: В.abortus 82 и В.abortus 75/79-АВ [5]. Отмечены случаи выявления в благополучных стадах крупного рогатого скота положительных серологических реакций на бруцеллез с единым бруцеллезным антигеном, изготовленным из типичных бруцелл в S-форме, при проведении плановых диагностических исследований ранее вакцинированных животных, что требует проведения дополнительных исследований сывороток крови в реакции иммунной диффузии (РИД) с О-ПС-антигеном. Положительный результат РИД с О-ПС антигеном подтверждает наличие бруцеллезной инфекции, отрицательный результат - только отсутствие инфекции.

При этом вопрос о том, являются ли выявленные положительно реагирующие в РСК и отрицательно реагирующие в РИД с О-ПС антигеном животные больными или реакции носят поствакцинальный характер, остается не решенным, что значительно снижает объективность дифференциальной эпизоотической оценки на бруцеллез стад крупного рогатого скота. Дифференцировать больных бруцеллезом животных от здоровых, иммунизированных штаммом В.abortus 82, в благополучных и неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах позволяет применение R-бруцеллезного антигена.

Есть сообщения об использовании в дифференциациальной эпизоотической оценке при исследовании сывороток крови в РСК R-антигена, изготовленного из инагглютиногенного штамма B.abortus 82 (SR-диссоциант) [6]. Недостатком этого антигена является то, что невозможно дифференцировать инфицированных животных от вакцинированных, что снижает достоверность дифференциальной оценки.

Наиболее близким аналогом является дифференциальная диагностика бруцеллеза крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82 [1], включающая исследование сыворотки крови в реакции агглютинации (РА), реакции связывания комплемента (РСК) с единым и R-антигеном ВНИИБТЖ, полученным из штамма B.abortus 16/4 [2], реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) и реакции иммунной диффузии (РИД) с О-ПС антигеном.

Следует отметить, что штамм В.abortus 16/4 является генетически не стабильным диссоциантом, а R-антиген, получаемый из него в лабораторных условиях, приходится поддерживать искусственно, и нередко он приобретает в своей антигенной структуре S-компонент, который может влиять на достоверность результатов, получаемых с дифференциальной целью [8], что значительно снижает объективность эпизоотичекой оценки на бруцеллез стад крупного рогатого скота, иммунизированного живыми вакцинами из диссоциированных штаммов бруцелл вида abortus.

Техническим результатом изобретения является повышение достоверности дифференциальной диагностики, позволяющее снизить необоснованный убой животных, и обеспечение объективности эпизоотической оценки на бруцеллез стад крупного рогатого скота, иммунизированного живыми вакцинами из диссоциированных штаммов бруцелл вида abortus.

Технический результат достигается тем, что способ дифференциальной эпизоотической оценки на бруцеллез стад крупного рогатого скота, иммунизированного живыми вакцинами из диссоциированных штаммов бруцелл, включающий исследование сыворотки крови в РА, РСК с единым бруцеллезным антигеном, РИД с О-ПС антигеном и дополнительное исследование положительно реагирующих проб в РСК с R-антигеном, отличается тем, что в качестве R-антигена используется антиген овисный.

Есть сообщения, доказывающие, что существует практически полное антигенное родство между R-формами бруцелл видов abortus, melitensis, suis и бруцеллами видов ovis и canis, в природной стабильной R-форме [4, 7].

Известен, официально утвержден «Набор специфических компонентов для диагностики болезни овец, вызываемой Brucella ovis» (изготовитель ООО НПФ «Биоцентр», г.Омск) [3], в состав которого входит антиген овисный для реакции длительного связывания комплемента РДСК, изготавливаемый из B.ovis в природной стабильной R-форме, предназначенный только для серологической диагностики болезни овец, вызываемой бруцеллами вида ovis (инфекционный эпидидимит баранов).

Способ дифференциальной эпизоотической оценки на бруцеллез стад крупного рогатого скота, иммунизированного живыми вакцинами из диссоциированных штаммов бруцелл, осуществляется следующим образом: проводят исследование сыворотки крови на бруцеллез в реакции РА, РСК с единым бруцеллезным антигеном, РИД с О-ПС антигеном, положительно реагирующие пробы дополнительно исследуют с овисным антигеном в РСК. Отрицательный результат РСК с овисным антигеном подтверждает инфицированность животных бруцеллезом, а при положительном - животное здоровое, иммунизированное живыми вакцинами из диссоциированных штаммов бруцелл.

Природная стабильность R-форм B.ovis и генетическое родство с R-формой бруцелл вида abortus гарантирует достоверность дифференциальной диагностики и обеспечивает объективность эпизоотической оценки на бруцеллез стад крупного рогатого скота, иммунизированного живыми вакцинами из диссоциированных штаммов бруцелл, что позволяет предотвратить необоснованный убой животных.

Сущность изобретения поясняется на конкретных примерах выполнения способа.

Пример 1. Определение чувствительности R-антигенов из разных штаммов бруцелл (ovis и abortus), изготовленных по аналогичной технологии, через 2 месяца после иммунизации, например, вакциной из штамма B.abortus 82.

Для сравнения чувствительности R-антигенов из разных штаммов бруцелл (ovis и abortus) изготовили R-антиген из R-штамма B.abortus по технологии, аналогичной изготовлению овисного диагностикума.

Исследовали 180 проб сывороток крови крупного рогатого скота благополучной по бруцеллезу фермы через 2 месяца после последней иммунизации вакциной из штамма B.abortus 82. Результаты исследований приведены в таблице 1.

Таблица 1 Результат исследования сыворотки крови иммунизированного крупного рогатого скота из благополучного по бруцеллезу хозяйства № п/п Хозяйство Срок после иммуниза-
ции (мес) Исследовано проб Реагировало положительно РА+РСК с единым антигеном РИД РСК с R-антигеном из В.ovis В.abortus абс. % абс. % абс. % абс. % 1 Ферма №1 2 180 59 32,8 - - 134 74,4 127 70,6

Результаты исследования сывороток крови от животных фермы №1 (180 проб сывороток):

- РА с единым бруцеллезным антигеном и РИД с О-ПС антигеном - отрицательно во всех пробах;

- РСК с единым бруцеллезным антигеном (S-антиген) - положительно (титр 1:5-1:10) в 59 пробах (32,8%);

- РСК с овисным антигеном - положительно (титр 1:5-1:80) в 134 пробах (74,4%);

- РСК с R-антигеном, изготовленным из R-штамма B.abortus - положительно в 127 пробах (70,6%).

Результаты дополнительного исследования 59 проб с положительным результатом РСК с единым бруцеллезным антигеном (S-антиген):

- РСК с овисным антигеном - положительно во всех пробах;

- РСК с R-антигеном из R-штамма B.abortus - положительно в 55 пробах.

Титры РСК с овисным антигеном (R-антиген) превышали титры РСК с единым бруцеллезным антигеном (S-антиген) в 30 пробах, а с R-антигеном из R-штамма B.abortus - в 19 пробах.

Результаты дополнительного исследования 121 пробы с отрицательным результатом РСК с единым бруцеллезным антигеном (S-антиген):

- РСК с овисным антигеном - положительно в 75 пробах (титр 1:5-1:80);

- РСК с R-антигеном из B.abortus - положительно в 69 пробах.

Таким образом, в ранние сроки (2 месяца) после иммунизации крупного рогатого скота благополучного по бруцеллезу стада вакциной из диссоциированного штамма B.abortus 82 количество выявляемых животных с положительной РСК с R-антигенами превышало таковое с S-антигеном в 2,3 раза, в 51,7% случаев титры РСК с R-антигенами превышали таковые в РСК с S-антигеном. В 56,0% случаев РСК с R-антигеном была положительной при отрицательной РСК с S-антигеном. При этом преимущества овисного антигена в дифференциальной оценке поствакцинальных реакций были в 1,1 раза выше, чем у R-антигена из B.abortus.

Таким образом применение овисного антигена позволяет повысить достоверность дифференциальной диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота в благополучных хозяйствах, предотвращая необоснованный убой животных.

Пример 2. Определение чувствительности R-антигенов из разных штаммов бруцелл (ovis и abortus), изготовленных по аналогичной технологии, через 24 месяца после иммунизации на пример вакциной из штамма B.abortus 82.

Исследовали 63 пробы сывороток крови крупного рогатого скота трех благополучных по бруцеллезу ферм через 2 года после последней иммунизации вакциной из штамма В. abortus 82 (табл.2).

Таблица 2 Результат исследования сыворотки крови крупного рогатого скота через 24 месяца после вакцинации в благополучных по бруцеллезу хозяйств № п/п Хозяйство Срок после иммуниза-
ции (мес) Исследова-
но проб Реагировало положительно РА+РСК с единым антигеном РИД РСК с R-антигеном из В.ovis В.abortus абс. % абс. % абс. % абс. % 1 Ферма №1 24 10 2 20,0 - - 9 90,0 - - 2 Ферма №2 24 9 2 22,2 - - 9 100 7 77,8 3 Ферма №3 24 44 14 31,8 - - 42 95,5 6 13,6

Результаты исследования сывороток крови от животных фермы №1 (10 проб сывороток):

- РА с единым бруцеллезным антигеном - отрицательно во всех пробах;

- РИД с О-ПС антигеном - отрицательно во всех пробах;

- РСК с единым бруцеллезным антигеном (S-антиген) - положительно в 2 пробах;

- РСК с официальным овисным антигеном (R-антиген) - положительно в 9 пробах;

- РСК с R-антигеном из R-штамма B.abortus - отрицательно во всех 10 пробах.

Результаты исследования сывороток крови от животных фермы №2 (9 проб сывороток):

- РА с единым бруцеллезным антигеном - отрицательно во всех пробах;

- РИД с О-ПС антигеном - отрицательно во всех пробах;

- РСК с единым бруцеллезным антигеном (S-антиген) - положительно в 2 пробах;

- РСК с официальным овисным антигеном (R-антиген) - положительно в 9 пробах;

- РСК с R-антигеном из R-штамма B.abortus - положительно в 7 пробах.

Результаты исследования сыворотки крови от животных фермы №3 (44 пробы сыворотки):

- РА с единым бруцеллезным антигеном - положительно в одной пробе;

- РИД с О-ПС антигеном - отрицательно во всех пробах;

- РСК с единым бруцеллезным антигеном (S-антиген) - положительно в 14 пробах;

- РСК с официальным овисным антигеном (R-антиген) - положительно в 42 пробах;

- РСК с R-антигеном из R-штамма B.abortus - положительно в 6 пробах.

Следовательно, в поздние сроки (24 месяца) после иммунизации крупного рогатого скота благополучных по бруцеллезу стад вакциной из диссоциированного штамма B.abortus 82 количество выявляемых животных с положительной РСК с R-антигенами превышало таковое с S-антигеном в среднем в 3,3 раза, а преимущества овисного антигена в дифференциальной оценке поствакцинальных реакций были в 4,6 раза выше, чем у R-антигена из B.abortus. Такой характер реакций также убедительно доказывает их вакцинную природу, повышает достоверность дифференциальной диагностики бруцеллеза животных и предотвращает необоснованный убой.

Пример 3. Определение эффективности РСК с овисным антигеном для дифференциальной эпизоотической оценки на бруцеллез стад крупного рогатого скота трех ферм с различной эпизоотической обстановкой.

Провели испытание эффективности РСК с овисным антигеном для дифференциальной эпизоотической оценки на бруцеллез стад крупного рогатого скота трех ферм с различной эпизоотической обстановкой (табл.3).

Ферма 1 - благополучная по бруцеллезу, животные иммунизированы вакциной из штамма B.abortus 82.

Результаты исследования 14 проб сывороток крови:

- РА с единым бруцеллезным антигеном - сомнительно в одной пробе, отрицательно в 13 пробах;

- РИД с О-ПС антигеном - отрицательно во всех пробах;

- РСК с единым бруцеллезным антигеном - положительно в 10 пробах;

- РСК с официальным овисным антигеном - положительно в 14 пробах. При этом титры РСК с овисным антигеном превышали титры РСК с единым бруцеллезным антигеном в 13 случаях из 14.

При бактериологическом исследовании биоматериала от реагирующих животных культуры бруцелл не выделены.

В результате исследований на ферме №1, благополучной по бруцеллезу, в инструктивные сроки после иммунизации вакциной из диссоциированного штамма B.abortus 82 при отрицательных результатах РИД с О-ПС антигеном количество выявляемых животных с положительной РСК с овисным антигеном превышало таковое с S-антигеном в 1,4 раза, полностью совпав с показаниями РСК с единым антигеном. При этом из числа отрицательно реагирующих животных в РСК с единым антигеном 28,6% реагировало в РСК с овисным антигеном.

Такой характер реакций убедительно доказывает их вакцинную природу.

Ферма 2 - неблагополучная по бруцеллезу, животные иммунизированы вакциной из штамма B.abortus 82.

Результаты исследований 107 проб сывороток крови:

- РА с единым бруцеллезным антигеном - положительно в 17 пробах;

- РИД с О-ПС антигеном - положительно в 13 пробах;

- РСК с единым бруцеллезным антигеном - положительно в 21 пробе;

- РСК с официальным овисным антигеном - положительно в 5 пробах.

При этом титры РСК с овисным антигеном были одинаковы с титрами РСК с единым бруцеллезным антигеном или ниже их.

При бактериологическом исследовании биоматериала от реагирующих животных выделены вирулентные культуры возбудителя.

В результате исследований на ферме №2, неблагополучной по бруцеллезу, в инструктивные сроки после иммунизации вакциной из диссоциированного штамма B.abortus 82 при наличии положительной РИД с О-ПС антигеном у 12,1% исследованных животных количество выявляемых животных с положительной РСК с овисным антигеном было ниже такового с единым антигеном практически в 3,4 раза. Титры РСК с овисным антигеном были одинаковыми или ниже, чем таковые в РСК с единым антигеном.

Такой характер реакций убедительно доказывает их инфекционную природу, что дополнительно было подтверждено бактериологически.

Таблица 3 Результаты исследования сывороток крови крупного рогатого скота из хозяйств с различной эпизоотической характеристикой № п/п Хозяйство Срок после иммунизации (мес) Исследовано проб Реагировало положительно с единым антигеном РИД PCK c R-антигеном (В.ovis) РА РСК абс. % абс. % абс. % абс. % 1 Ферма №1 6 14 - - 10 71,4 - - 14 100 2 Ферма №2 6 107 17 15,9 21 19,6 13 12,1 5 4,7 3 Ферма №3 без вакцинации 76 8 10,5 22 28,9 12 15,8 - -

Ферма 3 - неблагополучная по бруцеллезу, животные против бруцеллеза не иммунизированы.

Результаты исследований 76 проб сывороток крови:

- РА с единым бруцеллезным антигеном - положительно в 8 пробах, сомнительно - в 20 пробах;

- РИД с О-ПС антигеном - положительно в 12 пробах;

- РСК с единым бруцеллезным антигеном - положительно в 22 пробах, сомнительно - в 53 пробах;

- РСК с овисным антигеном - отрицательно во всех пробах.

Диагноз на бруцеллез подтвержден бактериологически (выделение вирулентного возбудителя).

В результате исследований на ферме №3, неблагополучной по бруцеллезу, где иммунизацию животных вакциной из диссоциированного штамма B.abortus 82 не проводили, при наличии положительной РИД с О-ПС антигеном у 15,8% исследованных животных в РСК с овисным антигеном были получены отрицательные результаты, что доказывает - животные не подвергались иммунизации вакцинами из диссоциированных штаммов бруцелл. Положительная РСК с единым антигеном была зарегистрирована у 28,9% исследованных животных, что убедительно доказывает их инфекционную природу и дополнительно подтверждено бактериологически. Использование овисного антигена обеспечивает объективность эпизоотической оценки на бруцеллез стад крупного рогатого скота, иммунизированного живыми вакцинами из диссоциированных штаммов бруцелл вида abortus, за счет выявления поствакцинальных реакций

По результатам опытов следует отметить, что способ дифференциальной эпизоотической оценки на бруцеллез стад крупного рогатого скота, иммунизированного живыми вакцинами из диссоциированных штаммов бруцелл с использованием овисного антигена, повышает достоверность дифференциальной диагностики и позволяет снизить необоснованный убой животных, а также обеспечить объективность эпизоотической оценки на бруцеллез стад крупного рогатого скота, иммунизированного живыми вакцинами из диссоциированных штаммов бруцелл вида abortus.

Литература

1. Дегтяренко Л.В. Дифференциальная диагностика бруцеллеза крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82. / Дегтяренко Л.В., Новицкий А.А., Разницына Г.В., Власова С.А. // Ветеринария. - 2002. - №1 - С.18-20.

2. Дегтяренко Л.В. Разработка и совершенствование средств, методов диагностики бруцеллеза животных и инфекционного эпидидимита баранов // Дегтяренко Л.В. // Автореф. дисс. док. вет. наук, Новосибирск. - 2005. - 40 с.

3. Инструкция по применению набора специфических компонентов для диагностики болезни овец, вызываемой Brucella ovis.

4. Косилов И.А., Аракелян П.К., Димов С.К. и др./ Монография: Инфекционный эпидидимит баранов. - Новосибирск. - 2005. - 27 с.

5. Наставление по диагностике бруцеллеза животных, утвержденное Министерством сельского хозяйства РФ, Москва, 2004. - 64 с.

6. Салмаков К.М. Изыскание и испытание новых вакцинных штаммов бруцелл / Салмаков К.М. // Автореф. дисс. док. вет. наук. - Казань. - 1977. - 29 с.

7. Троицкая Л.И. Антигенное родство вида овис и абортус / Троицкая Л.И., Клочков Г.С.: Сб. науч. тр. СибНИВИ. - Омск, 1976, т.27, с.24-30.

8. Шумилов К.В. Адъювант-вакцины против бруцеллеза крупного рогатого скота / Шумилов К.В., Калмыков В.В. / Тез. докл. науч.-практ. конф. Основные научные исследования по проблеме туберкулеза и бруцеллеза с.-х. животных, профилактика и организация мероприятий по ликвидации болезней в регионе Сибири. - Новосибирск. - 1995. - С.97-98.

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к диагностике инфекционных болезней. Способ предусматривает исследование сыворотки крови в реакции агглютинации, реакции связывания комплемента с единым бруцеллезным антигеном, реакции иммунной диффузии с О-ПС антигеном и дополнительное исследование положительно реагирующих проб в реакции связывания комплемента с R-антигеном. При этом в качестве R-антигена используют овисный антиген. Отрицательный результат реакции связывания комплемента с овисным антигеном подтверждает, что животное больно бруцеллезом, а положительный результат - здорово. Способ позволяет повысить достоверность дифференциальной диагностики и снизить необоснованный убой животных, а также обеспечить объективность эпизоотической оценки на бруцеллез стад крупного рогатого скота, иммунизированных живыми вакцинами из диссоциированных штаммов бруцелл вида abortus. 3 табл., 3 пр.

Способ дифференциальной эпизоотической оценки на бруцеллез стад крупного рогатого скота, иммунизированного живыми вакцинами из диссоциированных штаммов бруцелл, включающий исследование сыворотки крови в реакции агглютинации, реакции связывания комплемента с единым бруцеллезным антигеном, реакции иммунной диффузии с О-ПС антигеном и дополнительное исследование положительно реагирующих проб в реакции связывания комплемента с R-антигеном, отличающийся тем, что в качестве R-антигена используют овисный антиген, отрицательный результат реакции связывания комплемента с овисным антигеном подтверждает, что животное больно бруцеллезом, а положительный результат - здорово.