СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛИБАКТЕРИОЗНОЙ АНАТОКСИН-ВАКЦИНЫ Российский патент 2009 года по МПК A61K39/108 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, в частности к изготовлению биопрепаратов для специфической профилактики колибактериоза телят, поросят и птиц.

Известные способы получения формолвакцин и анатоксинов основаны на детоксикации токсинов и инактивации вирусов и бактерий 0,8±0,2% раствором формалина или его производными (Воробьев А.А. «Анатоксины». М., Медицина, 1965, с.137-355).

В основу получения колибактериозной вакцины положено выращивание эшерихий на бульоне Хоттингера, стерилизация, детоксикация токсинов 1% раствором формалина, сорбция на гидроксиде алюминия при добавлении в качестве консерванта мертиолята.

Из-за канцерогенных свойств формалина, мертиолята и неполноты детоксикации многих супертоксинов рядом исследователей в качестве детоксикаторов с определенным успехом были испытаны β-пропилактон, тирозин, перекись водорода, антибиотики, фотоокисление. Особое внимание обращено на замену гидролизатов мяса, казеина на синтетические питательные среды для выращивания микроорганизмов.

Однако, в отношении колибактериозной вакцины существенных изменений не произошло.

За прототип взят способ получения колибактериозной анатоксин-вакцины, включающий выращивание Е. coli в бульоне Хоттингера, стерилизацию и детоксикацию токсинов 1% раствором формалина, сорбцию на гидроксиде алюминия с последующим внесением консерванта - мертиолята (Осидзе Н.Д., Борисович Ю.Ф., Кирилов Л.В. Ветеринарные препараты. - М.: Колос, 1981, с.219-225).

Недостатком указанного способа является выращивание эшерихий на гидролизате Хоттингера и проведение детоксикации 0,8±0,2% раствором формалина.

Сравнительная оценка вышеуказанных детоксикаторов и испытание новых выявила эффективность ряда бисчетвертичных аммониевых соединений, в частности, этония (1,2-этилен-бис-(N-диметилкарбдецилоксиметил) аммония дихлорид). Безвредность и эффективность этония подтверждена в использовании его в гуманной медицине в качестве мазей, паст и растворов при дерматитах, трещине сосков, прямой кишки, для заживления ран, при кератитах и стоматите и пр.

Целью предлагаемого изобретения является обеспечение полной и необратимой детоксикации комплекса колибактериозных токсинов после выращивания эшерихий на синтетической среде, свободной от балластных веществ мяса, казеина, уменьшение концентрации формалина до 0,2% путем внесения второго детоксикатора этония в концентрации 0,5±0,1% для заключительной детоксикации при 40±1°С в течение 6-7 суток.

Поставленная цель достигается уменьшением концентрации канцерогенного формалина с 0,8% до 0,2% при последующем внесении 0,5±0,1% этония для полной и необратимой детоксикации всех видов токсинов, в том числе, энтеротоксинов, которые формалин не детоксицирует и, следовательно, не может превратить их в анатоксины.

При этом исходная концентрация формалина снижается до 0,05%, а этония до 0,2-0,3% из-за связывания их с белковыми молекулами токсинов и микроорганизмов.

В патентной и научно-технической литературе не обнаружены технические решения, аналогичные заявляемому с использованием этония, что свидетельствует о новизне предлагаемого решения.

Применение 0,5±0,1% раствора этония при снижении концентрации формалина с 0,8±0,2% до 0,2% в предложенном способе позволяет достичь стабильной полноты детоксикации, полимеризации всего комплекса колибактериозных токсинов и получения безвредной и эффективной колибактериозной анатоксин-вакцины.

Установленная возможность полной и необратимой детоксикации всех видов колибактериозных токсинов, в том числе, энтеротоксинов путем использования на первой стадии детоксикации 0,2% раствора формалина вместо 0,8±0,2% и во второй стадии 0,5±0,1% этония, обладающего не только детоксицирующим, но консервирующими, бактерицидными и фунгицидными свойствами, позволила предложить рациональную технологию изготовления эффективной и безвредной колибактериозной анатоксин-вакцины без ртутьсодержащего консерванта - мертиолята.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение колибактериозной анатоксин-вакцины (КАВ).

Выращенные эшерихии на синтетической среде в 2-литровых биобутылях с объемом среды, равным 1 л, в течение 3 суток с концентрацией 60±10 млрд/мл микроорганизмов подвергнуты автоклавированию при 1,0 атм в течение 30 минут. Концентрация молекулярных токсинов составляла 1,2±0,2 мг/см³.

К полученной суспензии автоклавированных эшерихий с растворимыми токсинами был внесен формалин до 0,2% концентрации для детоксикации при 40±1°С в течение 7 суток, а затем добавлен этоний до 0,5% концентрации для завершения детоксикации при 41±1°С в течение 7 суток всех видов колибактериозных токсинов, в том числе, и энтеротоксинов, которые формалин не способен детоксицировать.

После сорбции анатоксин-вакцины на гидроксиде алюминия (3 мг/см³) проведена расфасовка препарата в 20,0 и 100,0 мл флаконы и стерилизация при 1,0 атм в течение 20 минут.

Полученная анатоксин-вакцина испытана на безвредность и эффективность.

Пример 2. Испытание колибактериозной вакцины на безвредность на белых мышах и на 15-30-дневного возраста поросятах.

Изучение токсичности проводили на 8 белых мышах массой 18-20 г и 10 поросятах путем подкожного введения 0,5 см³ и 5,0 см³ биопрепарата.

При наблюдении в течение 10 суток все животные оставались клинически здоровыми, без видимых изменений на месте введения.

Пример 3.Испытание колибактериозной вакцины на активность.

В опыте использовано 16 телят, 18 голов поросят 15-30-дневного возраста и 10 белых мышей.

Вакцинацию животных проводили путем подкожного введения препарата белым мышам по 0,3 мл, телятам и поросятам по 5,0 мл с интервалом 7 суток. Контролем служили 8 белых мышей, 5 голов поросят и 5 голов телят, которые не подвергались вакцинации.

Через 15 суток после второй вакцинации животным подкожно ввели суспензию вирулентных эшерихий в дозе для белых мышей 10-20 тысяч микробных тел, а для поросят и телят 150 тысяч. Указанным количеством эшерихий проведено заражение контрольных животных.

Наблюдение за животными проводили в течение 15 суток. При этом установлено, что все контрольные 8 голов белых мышей заболели и погибли, а телята и поросята при появлении клинических признаков болезни подвергнуты лечению.

Среди вакцинированных белых мышей две мыши заболели и погибли, а остальные восемь мышей остались живыми без признаков заболевания.

Среди вакцинированных телят и поросят не отмечено признаков заболевания через 15 суток после заражения.

Пример 4. Испытание КАВ на 8 супоросных свиноматках и 10 стельных коровах.

Супоросным свиноматкам вакцину вводили подкожно за два месяца до опороса двукратно с интервалом 7 суток, а стельным коровам за 30-45 дней до отела трехкратно по 7,0 см³ с интервалом 7-9 суток. У животных не было абортов, в местах введения вакцины не отмечено некротических поражений. У народившегося молодняка (телята и поросята) не отмечено диарейных признаков.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, в частности к производству вакцин для профилактики инфекционных заболеваний. Способ включает выращивание эшерихий на питательной среде, детоксикацию экзо- и эндотоксинов в суспензии с автоклавированными эшерихиями раствором формалина, сорбцию на гидроксиде алюминия. При этом для выращивания эшерихий используют синтетическую среду. Детоксикацию токсинов проводят последовательно двумя детоксикаторами - первоначально 0,2% раствором формалина при 40±1°С в течение 6-7 суток, а затем

0,5±0,1% раствором этония при 40±1°С в течение 7-9 суток с последующей стерилизацией при 1,0 атм в течение 20 минут. Полученная анатоксин-вакцина обладает высокой активностью и используется для профилактики колибактериоза животных.

Способ получения колибактериозной вакцины, включающий выращивание эшерихий на питательной среде, детоксикацию экзо- и эндотоксинов в суспензии с автоклавированными эшерихиями раствором формалина, сорбцию на гидроксиде алюминия, отличающийся тем, что для выращивания эшерихий используют синтетическую среду, а детоксикацию токсинов проводят последовательно двумя детоксикаторами - первоначально 0,2%-ным раствором формалина при 40±1°С в течение 6-7 суток, а затем 0,5±0,1%-ным раствором этония при 40±1°С в течение 7-9 суток с последующей стерилизацией при 1,0 атм в течение 20 мин.