СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛИСАЛЬМОНЕЛЛЕЗНОЙ АНАТОКСИН-ВАКЦИНЫ Российский патент 2009 года по МПК A61K39/112 

Изобретение относится к микробиологии, иммунологии и биотехнологии, в частности к изготовлению биопрепаратов для специфической профилактики колибактериоза и сальмонеллеза.

Известные способы получения формолвакцин и анатоксинов основаны на инактивации бактерий, вирусов и детоксикации токсинов с помощью 0,8±0,2% раствора формалина или его производных (А.А.Воробьев. Современные направления в разработке новых иммунобиологических препаратов. Журнал микробиологии и иммунологиии, 1999, №5. С.16-21).

Многолетняя практика показала, что наиболее эффективны препараты, представляющие собой смесь микробных клеток и продуктов их метаболизма и деструкции, т.е. комплекс токсинов.

В основу получения колисальмонеллезной вакцины положено раздельное выращивание сальмонелл на бульоне Хоттингера, стерилизация, детоксикация токсинов 0,8±0,2% раствором формалина, сорбция на гидроксиде алюминия и внесение консерванта мертиолята.

Из-за канцерогенных свойств формалина и мертиолята, неполноты детоксикации супертоксинов с определенным успехом испытаны в качестве детоксикаторов β-пропилактон, нингидрид, тирозин, перекись водорода, антибиотики, фотоокисление и разработаны рациональные синтетические питательные среды для выращивания микроорганизмов, свободные от балластных веществ мяса, пептона, казеина и т.д.

Однако в отношении колибактериозной и сальмонеллезной вакцин существенных изменений не произошло. Кроме того, наличие мертиолята в вакцине исключает использование непарентеральных, неинъекционных методов введения препаратов через желудочно-кишечный тракт или ректально.

За прототип взят способ получения колисальмонеллезной вакцины, включающий раздельное выращивание эшерихий и сальмонелл в бульоне Хоттингера, стерилизацию и детоксикацию экзо- и эндотоксинов 0,8±0,2% раствором формалина, сорбцию на гидроксиде алюминия и внесение мертиолята (Осидзе Н.Д., Борисович Ю.Ф., Кирилов Л.В. Ветеринарные препараты. - М.: Колос, 1981, с.49-225).

Недостатком указанного способа является выращивание эшерихий и сальмонелл на гидролизате Хоттингера, проведение детоксикации экзо-и эндотоксинов одним детоксикатором - 0,8±0,2% раствором формалина и содержание консерванта - мертиолята.

Изучение ряда детоксикаторов выявило эффективность четвертичных аммониевых соединений, в частности этония (1,2-этилен-бис-(N-диметилкарбдецилоксиметил) аммония дихлорид), в отношении стафилококковых суперэнтеротоксинов. Безвредность этония подтверждается использованием в гуманной медицине в виде мазей, растворов для ускорения заживления ран, при дерматитах, кератите, стоматите.

Целью предлагаемого изобретения является получение более эффективного и безвредного препарата путем использования синтетических питательных сред для раздельного выращивания эшерихий и сальмонелл до 60-70 млрд/мл концентрации вместо мясо-пептонного бульона и обеспечение полной и необратимой детоксикации комплекса колибактериозных и сальмонеллезных токсинов с автоклавированными микроорганизмами двумя детоксикатерами: на первой стадии 0,2% раствором формалина вместо 0,8% при 40°С в течение 7 суток, а затем внесением второго детоксикатора 0,5% раствора этония для заключительной детоксикации при 41±1°С в течение 7 суток.

Поставленная цель достигается использованием синтетических питательных сред для выращивания эшерихий и сальмонелл, уменьшением концентрации формалина с 0,8% до 0,2%, изъятием ртутьсодержащего мертиолята и внесением этония до 0,5% содержания для обеспечения полной и необратимой детоксикации всех видов токсинов и получения высокоактивной и безвредной колисальмонеллезной анатоксин-вакцины.

В патентной и научно-технической литературе не обнаружены технические решения, аналогичные заявляемому, с использованием этония, что свидетельствует о новизне предлагаемого решения.

Примение синтетической питательной среды для выращивания эшерихий и сальмонелл, уменьшение концентрации формалина с 0,8% до 0,2% при внесении второго детоксикатора - 0,5% раствора этония позволяет получить безвредную и эффективную колисальмонеллезную анатоксин-вакцину, т.е. получен технический эффект.

Установленная возможность выращивания эшерихий и сальмонелл на жидкой синтетической питательной среде и полной детоксикации комплекса экзо-, эндо и суперэнтеротоксинов с помощью двух детоксикаторов: на первой стадии 0,2% раствором формалина вместо 0,8% и на второй - 0,5% раствором этония без добавления ртутьсодержащего консерванта мертиолята позволяет предложить рациональную технологию изготовления безвредного и активного биопрепарата в промышленных условиях.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение колисальмонеллезной анатоксин-вакцины.

Для раздельного выращивания эшерихий и сальмонелл в заявляемом способе использовалась синтетическая среда, содержащая в одном литре дистиллированной воды следующие ингредиенты в г/л: лимонной кислоты - 8,0; фосфорно-кислого калия 2-зам - 3,0; фосфорно-кислого натрия 2-зам - 3,0; хлористого натрия - 4,0; серно-кислого цинка - 0,1; серно-кислого железа - 0,01; серно-кислого магния - 0,5; аспарагина - 1,0; серно-кислого натрия - 1,0; глицерина - 30,0 мл, рН 7,2-7,4.

К раздельно выращенным эшерихиям и сальмонеллам на жидкой синтетической среде в 2-литровых биобутылях с объемом среды, равной 1 литру, в течение 3-х суток с концентрацией 60±10 млрд./мл после автоклавирования при 1,0 атм. в течение 30 минут для детоксикации комплекса экзо-, эндо- и суперэнтеротоксинов внесен формалин до 0,2% при 40±1°С в течение 7 суток, а затем для завершения детоксикации при 41±1°С в течение 7 суток внесен второй детоксикатор этоний до 0,5% концентрации.

После завершения процесса детоксикации колибактериозных и сальмонеллезных токсинов вместе с автоклавированными микроорганизмами провели смешивание препаратов в равных объемах и сорбцию на гидроксиде алюминия (1-3 мг/мл). Полученная анатоксин-вакцина без мертиолята расфасована по флаконам и подвергнута стерилизации при 1,0 атм. в течение 20 минут.

Пример 2. Испытание колисальмонеллезной анатоксин-вакцины на безвредность.

На 10 белых мышах и 15-30-дневного возраста поросятах (16 гол.) путем подкожного введения мышам по 0,3 мл и поросятам по 5-7 мл биопрепарата не было отмечено в течение 12 суток клинически выраженных изменений и видимых некротических поражений на месте введения.

Пример 3. Испытание колисальмонеллезной анатоксин-вакцины на супоросных свиноматках (12 гол.) и стельных коровах (14 гол.).

Супоросным свиноматкам вакцину вводили подкожно двукратно по 5,0 мл с интервалом 7 суток за два месяца до опороса, а стельным коровам за 45 дней до отела 3-кратно по 7,0 мл с интервалом 7 суток. У вакцинированных животных не отмечено абортов, в местах введения вакцины не выявлено некротических поражений, а у народившегося молодняка не было диарейных поражений.

Пример 4. Испытание колисальмонеллезной вакцины на активность.

В исследованиях использовано 12 телят, 16 голов поросят и 10 белых мышей.

Вакцинацию животных проводили двукратным подкожным введением препарата белым мышам по 0,3 мл, а телятам и поросятам по 5,0 мл с интервалом 7 суток. Контролем служили 6 белых мышей, 3 поросенка и 5 голов телят.

Через 15 суток после второй вакцинации животным подкожно ввели суспензию вирулентных эшерихий и сальмонелл: белым мышам по 25-30 тысяч микробных тел, а телятам и поросятам по 150-200 тысяч.

Указанным количеством эшерихий и сальмонелл проведено заражение контрольных животных. При наблюдении за животными в течение 17 суток у вакцинированных животных не отмечено признаков заболевания колибактериозом и сальмонеллезом, все контрольные 6 белых мышей заболели и погибли, а заболевшие телята и поросята были подвергнуты лечению.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Раздельно выращивают эшерихий и сальмонелл на синтетической питательной среде. Стерилизуют и детоксифицируют комплекс токсинов двумя детоксикаторами - первоначально 0,2% раствором формалина при 40°С в течение 7 суток, а затем 0,5% раствором этония при 41°С в течение 7 суток. Смешивают препараты в равных объемах. Затем сорбируют на 1-3 мг/мл гидроксида алюминия. Расфасовывают по флаконам и стерилизуют в течение 20 минут при 1,0 атм. Полученная анатоксин-вакцина предназначена для профилактики колибактериоза и сальмонеллеза животных.

Способ получения колисальмонеллезной анатоксин-вакцины, включающий раздельное выращивание эшерихий и сальмонелл на питательной среде, стерилизацию и детоксикацию комплекса экзо- и эндотоксинов раствором формалина, сорбцию на гидроксиде алюминия, отличающийся тем, что используют синтетическую среду для выращивания эшерихий и сальмонелл до 60±10 млрд/мл в течение 2-3 сут и проводят детоксикацию двумя детоксикаторами - первоначально 0,2%-ным раствором формалина при 40°С в течение 7 сут, а затем 0,5%-ным раствором этония при 41°С в течение 7 сут, смешивают равные объемы препаратов с сорбцией на гидроксиде алюминия, расфасовывают полученную анатоксин-вакцину по флаконам и стерилизуют в течение 20 мин при 1,0 атм.