СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗНОГО АНАТОКСИНА Российский патент 2010 года по МПК A61K39/00 A61P31/06 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, в частности к технологии изготовления биопрепаратов для специфической профилактики туберкулеза.

Известны способы получения анатоксинов, аллергоидов, инактивированных вирусных и бактерийных вакцин с использованием 0,8±0,2% формалина.

При этом оценка качества вакцин проводится в определении способности выработки специфических антител - защитного титра. Однако при многих инфекционных заболеваниях (бруцеллез, туберкулез, туляремия и т.д.) иммунологические показатели не отражают защитных свойств биопрепарата, т.к. в их патогенезе ведущая роль принадлежит клеточному иммунитету. В этих случаях остаются в силе кожно-аллергическая проба и фактическая защищенность против той или иной инфекции, безопасность и эффективность биопрепарата (Воробьев А.А. Микробиология и иммунология. М.: Медицина, 1999, с.255-268; Медуницин Н.В. Биологические препараты: настоящее и будущее. Научно-практический журнал «Биопрепараты», 2001, №1, с.2-3).

Несмотря на длительное использование, с 1923 г., формалина для получения инактивированных вакцин, анатоксинов, исследования по замене формалина остаются актуальными.

Это связано с тем, что формалин способен вызывать аллергические реакции, денатурацию белков, онкогенные процессы. Сведения о возможной замене формалина или его производных на этоний при изготовлении инактивированных вирусных и бактерийных вакцин и анатоксинов и тем более в отношении детоксикации и инактивации туберкулезных токсино-аллергенов отсутствуют. Поэтому необходимы исследования не только по повышению эффективности инактивированных биопрепаратов, но и в направлении их безвредности.

За прототип взят «Способ получения туберкулезного анатоксина», Евглевский Ан. А., патент РФ №2139090 от 26.01.99, включающий выращивание микобактерий туберкулеза на синтетической среде в течение 55-60 суток, стерилизацию и детоксикацию токсино-аллергенов 0,8±0,2% раствором формалина при 42-45°С в течение 12-15 суток, сорбцию на гидроксиде алюминия из расчета 1-3 мг/мл.

Недостатком указанного способа является проведение детоксикации туберкулезных токсино-аллергенов одним детоксикатором - формалином в высокой концентрации в пределах 0,8% и низкое содержание исходных токсино-аллергенов до 2 мг/мл.

Для устранения указанных недостатков предлагается использование двух детоксикаторов в два этапа - первоначально 0,2% раствора формалина вместо 0,8%, а затем 0,5% раствора этония в течение 7-9 суток при 42-45°С, сорбция на гидроксиде алюминия и увеличение вдвое концентрации инактивированных токсино-аллергенов путем декантации 50±5% надосадочной жидкости.

Целью предлагаемого изобретения является снижение токсичности и повышение активности препарата путем детоксикации туберкулезных токсино-аллергенов двумя детоксикаторами - первоначально 0,2% раствором формалина вместо 0,8%, а затем 0,5% раствором этония при 42-45°С в течение 7-9 суток для обеспечения полной и необратимой детоксикации туберкулезных экзо- и эндотоксинов, сорбцией на гидроксиде алюминия из расчета 1-3 мг/мл и увеличение вдвое концентрации инактивированных токсино-аллергенов путем декантации 50±5% надосадочной жидкости.

Поставленная цель достигается снижением концентрации канцерогенного формалина с 0,8% до 0,2% и последующим прибавлением второго детоксикатора - 0,5% этония для полной детоксикации туберкулезных токсино-аллергенов из расчета 120±20 тысяч туберкулиновых единиц (международных) в 1 мл (≈2,5±0,2 мг/мл тубпротеина) при 42-45°С в течение 7-9 суток, сорбцией на гидроксиде алюминия 1-3 мг/мл и удалением декантацией 50% надосадочной жидкости, позволяющим увеличить вдвое концентрацию инактивированных токсино-аллергенов.

Следует дополнить, что безопасность и полезность использования этония (1,2-этилен-бис-(N-диметилкарбдецилоксиметил) аммония дихлорид - бисчетвертичное аммониевое соединение) подтверждена в выпуске различных растворов, мазей, паст в гуманной медицине при различных заболеваниях кожи (раны, ожоги, радиация), трофических язвах, дерматозах, кариесе зубов, стоматите, кератитах, язвах роговицы.

В патентной и научно-технической литературе не обнаружены технические решения, аналогичные заявляемому с использованием этония, что свидетельствует о новизне предлагаемого решения.

Применение двух детоксикаторов в предложенном режиме и увеличение вдвое концентрации инактивированных токсино-аллергенов позволяет достичь положительного эффекта - снижения токсичности препарата при повышении его эффективности.

Установлена возможность полной детоксикации всего комплекса туберкулезных экзо- и эндотоксино-аллергенов с помощью двух детоксикаторов и определена их концентрация, температурный и временной режим технологического процесса, позволяющие получить эффективный и безопасный туберкулезный анатоксин.

Результаты редуцирующего действия на туберкулезные токсино-аллергены этония и протективные свойства туберкулезного анатоксина представлены в следующих примерах.

Пример 1. Способ получения туберкулезного анатоксина и его проверка на полноту детоксикации токсино-аллергенов на сенсибилизированных морских свинках.

В раствор (300 мл) растворимых туберкулезных токсино-аллергенов (2,5 мг/мл≈120000 ТЕ(МЕ)) внесен формалин до 0,2% концентрации для проведения детоксикации при 42-45°С в течение 7 суток, а затем добавлен второй детоксикатор этоний до 0,5% концентрации для заключительной детоксикации при 42^-45°С в течение 7 суток. Температурный режим 42-45°С является наиболее оптимальным. Затем проведена сорбция полученного анатоксина на гидроксиде алюминия из расчета 1-3 мг гидроксида/мл анатоксина и декантация 50±5% надосадочной жидкости для увеличения вдвое концентрации инактивированных токсино-аллергенов (до 5 мг/мл). Полученный анатоксин расфасовывают по флаконам и стерилизуют 30 минут при 1,0 атм.

Проверку туберкулезного анатоксина на остаточную аллергенную активность и токсичность провели на 9 морских свинках, сенсибилизированных внутрикожным введением суспензии вакцины БЦЖ (1 мг на голову) путем внутрикожного введения по 0,1 мл препарата в разведении 1:100 и 1:1000 в депилированные боковые поверхности.

При учете реакции через 24 и 48 часов у морских свинок не было отмечено гиперемии кожи до 6-8 мм на внутрикожное введение туберкулезного анатоксина.

В то же время на внутрикожное введение туберкулина с аллергенной активностью (1 мг/мл=50000 ТЕ) в разведении 1:1000 и 1:2000 отмечена гиперемия кожи в диаметре 14-18 мм.

Полученные результаты дают основание считать, что этоний с формалином способен ин активировать аллергенную активность молекулярного туберкулезного токсино-аллергена и детоксикацию его токсических свойств.

Пример 2. Изучение сенсибилизирующих свойств туберкулезного анатоксина после детоксикации токсино-аллергенов 0,2% раствором формалина с 0,5% этонием у коров. В исследованиях использовано 10 коров, которым двукратно подкожно с интервалом 12 суток был введен по 5,0 мл туберкулезный анатоксин. По истечении 30 суток после повторного введения туберкулезного анатоксина всех животных подвергли туберкулинизации путем внутрикожного введения туберкулина для млекопитающих - ППД серии №12 по 0,2 мл. При учете реакции через 72 часа у животных отмечено увеличение кожной складки в пределах 3-5-7 мм. Следовательно, подкожное введение туберкулезного анатоксина сопровождается аллергизацией организма, достоверно выраженными кожно-аллергическими реакциями.

Пример 3. Изучение сенсибилизирующих свойств туберкулезного анатоксина, полученного детоксикацией токсино-аллергенов 0,2% формалином с 0,5% этонием на морских свинках.

Туберкулезный анатоксин по 0,2 мл был введен двукратно подкожно 6 здоровым морским свинкам с интервалом 12 суток. По истечении 30 суток после второго введения туберкулезного анатоксина был введен туберкулин для млекопитающих с аллергенной активностью 50000 ТЕ/мл (ME) в разведении 1:1000 и 1:2000 по 0,1 мл в депилированные боковые поверхности каждой морской свинке. Учет реакции через 24 часа выявил у всех вакцинированных морских свинок кожно-аллергические реакции в виде гиперемии кожи до 8-9 мм в диаметре.

Пример 4. Изучение протективной активности туберкулезного анатоксина на морских свинках и кроликах.

В опыте использовано 6 морских свинок и 4 кролика, которым трехкратно с интервалом 10 дней был введен подкожно туберкулезный анатоксин в объеме 0,5 мл. По истечении 30 суток после 3-й вакцинации животных заразили свежевыделенными от больных туберкулезом людей лекарственно устойчивыми микобактериями туберкулеза в дозе 0,1 мг на одно животное. Наблюдение за животными проводили в течение 3-х месяцев.

При убое у кроликов и морских свинок не обнаружено поражений органов (печени, легких и лимфоузлов), за исключением одной свинки, у которой в лимфоузле от места заражения и в печени обнаружены макроскопические изменения, характерные для туберкулезных поражений. Контрольные 3 морские свинки погибли через 2-2,5 месяца после заражения микобактериями туберкулеза. Из результатов исследований следует, что туберкулезный анатоксин, полученный детоксикацией токсино-аллергенов 0,2% раствором формалина с 0,5% этонием, обеспечивает защиту от заболевания кроликов и морских свинок при массивной дозе заражения вирулентными микобактериями туберкулеза.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, в частности к получению туберкулезного анатоксина для специфической профилактики туберкулеза. Туберкулезный анатоксин получают путем детоксикации туберкулезных экзо- и эндотоксинов двумя детоксикаторами - 0,2% раствором формалина в течение 7-9 суток при 42-45°С и 0,5% раствором этония в течение 7-9 суток при 42-45°С. При этом происходит полная детоксикация токсинов и инактивация их аллергенных свойств при практически 100% расходовании формалина и этония. Затем производят сорбцию туберкулезного анатоксина на 1-3 мг/мл гидроксида алюминия и вдвое увеличивают концентрацию инактивированных токсино-аллергенов путем декантации 50±5% надосадочной жидкости. При использовании анатоксина, полученного способом по изобретению, вакцинированные животные приобретают устойчивость к заражению вирулентными микобактериями туберкулеза на фоне иммунологической перестройки организма и приобретают умеренную чувствительность к туберкулину.

Способ получения туберкулезного анатоксина, включающий детоксикацию туберкулезных экзо- и эндотоксино-аллергенов, сорбцию полученного анатоксина на гидроксиде алюминия, стерилизацию, отличающийся тем, что детоксикацию 2,5±0,2 мг/мл туберкулезных токсино-аллергенов проводят последовательно двумя детоксикаторами - 0,2%-ным раствором формалина в течение 7-9 суток при 42-45°С и 0,5%-ным раствором этония при 42-45°С в течение 7-9 суток, сорбцию анатоксина на гидроксиде алюминия проводят из расчета 1-3 мг гидроксида на 1 мл анатоксина и концентрируют адсорбированный анатоксин декантацией 50±5% надосадочной жидкости.