СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗНОГО АНАТОКСИНА Российский патент 2009 года по МПК A61K39/04 A61P31/14 A61P31/06 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к технологии изготовления биопрепаратов для специфической профилактики туберкулеза.

Известные способы получения анатоксинов, аллергоидов, инактивированных вирусных и бактерийных вакцин основаны на использовании 0,8±0,2% формалина. Указанные препараты регулируют функции организма и являются эффективными средствами профилактики и лечения болезней животных и человека.

Оценка качества вакцин проводится в определении способности выработки специфических антител - защитного титра.

Однако при многих инфекционных заболеваниях (бруцеллез, туберкулез, туляремия и т.д.) иммунологические показатели не отражают защитных свойств биопрепарата, т.к. в их патогенезе ведущая роль принадлежит клеточному иммунитету.

В этих случаях основными диагностическими тестами остаются кожно-аллергические пробы и фактическая защищенность против той или иной инфекции. При этом остаются в силе два основных показателя для вакцин - анатоксинов - безопасность и эффективность (Воробьев А.А. «Микробиология и иммунология». Москва: «Медицина», 1999, с.255-268; Медуницин Н.В. «Биологические препараты: настоящее и будущее». Научно-практический журнал «Биопрепараты», 2001, №1, с.2-3).

Несмотря на длительное использование, с 1923 г., формолвакцин - формоланатоксинов, исследования по замене формалина не прекращаются, а его замена является актуальной.

Это связано с тем, что формалин способен вызывать аллергические реакции, денатурацию белков, онкогенные процессы. Сведения о возможной успешной замене формалина или его производных на этоний при изготовлении инактивированных вирусных и бактерийных вакцин и анатоксинов и тем более в отношении детоксикации и инактивации туберкулезных токсино-аллергенов отсутствуют. Поэтому необходимы исследования не только по повышению эффективности инактивированных биопрепаратов, но и в направлении их безвредности.

Следует дополнить, что безопасность и полезность использования этония подтверждена в выпуске различных растворов, мазей, паст в гуманной медицине при различных заболеваниях кожи (раны, ожоги, радиация), трофических язвах, дерматозах, кариесе зубов, стоматите, кератитах, язвах роговицы.

Целью предлагаемого изобретения является повышение эффективности и безопасности путем замены 0,8±0,2% формалина, применяемого для детоксикации и инактивации (дезаллергизации) туберкулезных токсино-аллергенов, на более эффективный и практически безвредный, не имеющий противопоказаний детоксикатор - этоний (1,2-этилен-бис-(N-диметилкарбдецилоксиметил) аммония дихлорид - бисчетвертичное аммониевое соединение).

Поставленная цель достигается путем использования 1,0±0,2% этония, обеспечивающего стабильную и полную детоксикацию туберкулезных токсино-аллергенов из расчета 120±20 тысяч туберкулиновых единиц (международных) в 1 мл (≈2,0±0,2 мг/мл тубпротеина) при 40-45°С в течение 12-15 суток, сорбцией на гидроксиде алюминия 1-3 мг/мл и удалением декантацией 50% надосадочной жидкости.

В патентной и научно-технической литературе не обнаружены технические решения, аналогичные заявляемому с использованием этония.

Только применение 1,0±0,2% раствора этония в предложенном режиме позволяет достичь технического эффекта, т.е. полной детоксикации туберкулезных токсинов и получения эффективного анатоксина.

Нами установлена возможность полной детоксикации всего комплекса туберкулезных токсино-аллергенов с помощью этония и определена его концентрация, температурный и временной режим технологического процесса и эффективность конечного продукта, позволяющие получить эффективный и безопасный туберкулезный анатоксин.

Результаты редуцирующего действия на туберкулезные токсино-аллергены этония и протективные свойства туберкулезного анатоксина представлены в следующих примерах.

Пример 1. Способ получения туберкулезного анатоксина и его проверка на полноту детоксикации токсино-аллергенов на сенсибилизированных морских свинках.

В раствор (300 мл) растворимых туберкулезных токсино-аллергенов (2,0 мг/мл ≈120000 ТЕ(МЕ)) внесен 1,0±0,2% этоний для проведения детоксикации при 40-45°С в течение 12-15 суток. Температурный режим 40-45°С является наиболее оптимальным.

Затем проведена сорбция на гидроксиде алюминия из расчета 1-3 мг/мл и декантация 50±5% надосадочной жидкости для увеличения вдвое концентрации инактивированных токсино-аллергенов (до 5 мг/мл). Полученный анатоксин расфасовывают по флаконам и стерилизуют 30 минут при 1,0 атм.

Проверку туберкулезного анатоксина на остаточную аллергенную активность и токсичность провели на 10 морских свинках, сенсибилизированных внутрикожным введением суспензии вакцины БЦЖ (1 мг на голову) путем внутрикожного введения по 0,1 мл препарата в разведении 1:100 и 1:1000 в депилированные боковые поверхности.

При учете реакции через 24 и 48 часов у морских свинок не было отмечено гиперемии кожи до 6-8 мм на внутрикожное введение туберкулезного анатоксина.

В то же время на внутрикожное введение туберкулина с аллергенной активностью (1 мг/мл=50000 ТЕ) в разведении 1:1000 и 1:2000 отмечена гиперемия кожи в диаметре 14-18 мм.

Полученные результаты дают основание считать, что этоний способен инактивировать аллергенную активность молекулярного туберкулезного токсино-аллергена и детоксицировать его токсические свойства.

Пример 2. Для детоксикации токсино-аллергенов с аллергенной активностью 100000 ТЕ/мл во флаконы был добавлен формалин: в 10 флаконов (20 мл) в концентрации 0,8%, а в другие 10 флаконов (20 мл) внесен этоний до 1%, флаконы помещены в термостат при 45°С на 12 суток с ежедневным встряхиванием содержимого флаконов.

Последующее введение 12 сенсибилизированным вакциной БЦЖ (внутрикожно 1 мг/мл) морским свинкам туберкулезных токсино-аллергенов, подвергнутых детоксикации 0,8% формалином и 1% этонием в разведении 1:500 и 1:1000 по 0,1 мл не выявило аллергических реакций кожи у сенсибилизированных морских свинок (не было отмечено гиперемии кожи до 6-7 мм через 24 часа после внутрикожного введения обработанных детоксикаторами туберкулезных токсино-аллергенов). Образование некротических реакций не отмечено.

Полученные результаты дают основание считать, что этоний способен инактивировать аллергенную активность молекулярного туберкулезного токсино-аллергена и детоксикацию его токсических свойств.

Пример 3. Изучение сенсибилизирующих свойств туберкулезного анатоксина после детоксикации токсино-аллергенов 1% этонием у коров.

В исследованиях использовано 10 коров, которым двукратно подкожно с интервалом 12 суток был введен туберкулезный анатоксин. По истечении 30 суток после повторного введения туберкулезного анатоксина всех животных подвергли туберкулинизации путем внутрикожного введения туберкулина для млекопитающих - ППД серии 12 по 0,2 мл.

При учете реакции через 72 часа у животных отмечено увеличение кожной складки в пределах 3-5-7 мм. Следовательно, подкожное введение туберкулезного анатоксина сопровождается аллергизацией организма, достоверно выраженными кожно-аллергическими реакциями.

Пример 4. Изучение сенсибилизирующих свойств туберкулезного анатоксина, полученного детоксикацией токсино-аллергенов 1% этонием на морских свинках.

Туберкулезный анатоксин в объеме 0,2 мл был введен подкожно 6 здоровым морским свинкам с интервалом 12 суток. По истечении 30 суток после второго введения туберкулезного анатоксина был введен туберкулин для млекопитающих с аллергенной активностью 50000 ТЕ/мл (ME) в разведении 1:1000 и 1:2000 по 0,1 мл в депилированные боковые поверхности каждой морской свинке. Учет реакции через 24 часа выявил у всех вакцинированных морских свинок кожно-аллергические реакции в виде гиперимии кожи до 8-9 мм в диаметре.

Пример 5. Изучение протективной активности туберкулезного анатоксина на морских свинках и кроликах.

В опыте использовано 6 морских свинок и 4 кролика, которым трехкратно с интервалом 10 дней был введен подкожно туберкулезный анатоксин в объеме 0,5 мл. По истечении 30 суток после 3-й вакцинации животных заразили свежевыделенными от больных туберкулезом людей лекарственно устойчивыми микобактериями туберкулеза в дозе 0,1 мг на одно животное. Наблюдение за животными проводили в течение 3-х месяцев.

При убое у кроликов и морских свинок не обнаружено поражений органов (печени, легких и лимфоузлов) за исключением одной свинки, у которой в лимфоузле от места заражения и в печени обнаружены микроскопические изменения, характерные для туберкулезных поражений.

Контрольные 3 морские свинки погибли через 2-2,5 месяца после заражения микобактериями туберкулеза.

Из результатов исследований следует, что туберкулезный анатоксин, полученный детоксикацией токсино-аллергенов этонием обеспечивает защиту от заболевания кроликов и морских свинок от массивной дозы заражения вирулентными микобактериями туберкулеза.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, в частности к получению туберкулезного анатоксина для специфической профилактики туберкулеза. Туберкулезный анатоксин получают путем детоксикации 1,0±0,2% раствором этония 2,0±0,2 мг/мл растворимых токсино-аллергенов с аллергенной активностью 120000±20000 ТЕ (ME) в 1 мл. Затем производят сорбцию туберкулезного анатоксина на 1-3 мг/мл гидроксида алюминия и вдвое увеличивают концентрацию инактивированных токсино-аллергенов путем декантации 50±5% надосадочной жидкости. Преимущество изобретения заключается в снижении аллергенной активности.

Способ получения туберкулезного анатоксина, включающий детоксикацию туберкулезных токсино-аллергенов, сорбцию на гидроксиде алюминия, стерилизацию, отличающийся тем, что в качестве детоксикатора используют 1,0±0,2% этоний для детоксикации 2,0±0,2 мг/мл растворенных токсино-аллергенов с аллергенной активностью 120000±20000 ТЕ (ME) в 1 мл, а концентрацию препарата увеличивают вдвое путем декантации 50±5% надосадочной жидкости.