СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТАФИЛО-СТРЕПТОКОККОВОЙ АНАТОКСИН-ВАКЦИНЫ Российский патент 2009 года по МПК A61K39/116 A61K39/85 A61K39/09 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к технологии изготовления биопрепаратов для специфической профилактики и лечения болезней животных стафилококковой этиологии.

Известные способы получения инактивированных анатоксинов, анатоксин-вакцин вирусных и бактерийных вакцин, анатоксинов основаны на использовании 0,8±0,2% раствора формалина, УФ-лучей, ионизирующих излучений и пр. (Шапиро Я.С. «Микроорганизмы - вирусы, бактерии, грибы». Издательство «ЭЛБИ» - СПб, 2003 г., с.156-160).

Существующие способы получения стафилококковых и стрептококковых анатоксинов или анатоксин-вакцин предусматривают выращивание микроорганизмов на гидролизате Хоттингера, сахарном бульоне или на синтетических питательных средах, автоклавирование биомассы микроорганизмов и детоксикацию экзо- и эндотоксинов 0,8±0,2% раствором формалина.

Постинфекционный иммунитет при стафилококкозе и стрептококкозе обусловлен как гуморальными, так и клеточными факторами - антитоксинами, антимикробными антителами, против ферментов, а также Т-лимфоцитами и фагоцитами.

При этом следует учитывать, что их энтеротоксины являются суперантигенами, сильнейшими пищевыми ядами, термостабильными и обладают устойчивостью к действию формалина, т.е. не способны превращаться в анатоксины.

Термин суперантигены (САГ) используется для определения молекул, продуцируемых патогенными микроорганизмами и обладающих высоким митогенным действием на Т-клетки. Стрептококки и стафилококки синтезируют широкий спектр САГ - пирогенные (эритрогенные), экзотоксины, митогенные факторы.

Суперантигены стафилококков по структуре и биологическим свойствам близки к стрептококковым САГ- и представляют собой глобулярные белки с молекулярной массой 24-28 кД и состоят из центральной α-спирали, N-терминального и С-терминальных доменов. Установлено, что энтеротоксины стрептококков Spe A, Spe С, SSA обладают большим сходством со стафилококковым энтеротоксином SEB, образуя гомологичную белковую группу с идентичностью от 20 до 90%, а стрептококковые митогены типа Z-2 (SMEZ), Spe Y и Spe I, Spe H-N более сходны со стафилококковыми САГ.

Из 18 видов бактерий, причисленных к важнейшим патогенам человека и животных по медицинской значимости, стрептококки занимают второе место после стафилококков. Поэтому была предпринята попытка получить эффективный комплексный биопрепарат.

За прототип взят «Способ получения стафилококковой анатоксин-вакцины», Евглевский А.А., патент РФ №2229893 от 10 июня 2004 г., включающий выращивание стафилококков на синтетической среде, стерилизацию и детоксикацию токсинов 0,8%±0,2% раствором формалина.

Недостатком способа является проведение детоксикации стафилококковых экзо- и эндотоксинов с помощью 0,8±0,2% раствора формалина, который не обеспечивает детоксикацию стафилококковых суперэнтеротоксинов и, соответственно, не превращает их в анатоксины (Коротяев А.И., Бабичев С.А. «Медицинская микробиология, иммунология и вирусология». Санкт-Петербург, издательство «Специальная литература», 1998 г., с.338). Кроме того, представленный способ не обеспечивает детоксикацию стрептококковых токсинов.

Для детоксикации бактерийных токсинов и раскрытия механизма этого явления продолжается поиск новых средств и методов, обеспечивающих изготовление высокоактивных и безвредных биопрепаратов, свободных от ряда отрицательных моментов, присущих формольному анатаксинообразованию.

Новый детоксикатор должен обладать безвредностью и эффективной способностью инактивировать стафилококковые и стрептококковые суперэнтеротоксины, превращая их в активные анатоксины.

Испытание известных и новых средств для детоксикации стафило-стрептококковых суперэнтеротоксинов выявило эффективность ряда бисчетвертичных аммониевых соединений в частности этония, который был взят в качестве детоксикатора для получения стафило-стрептококковой анатоксин-вакцины.

Целью предлагаемого изобретения является повышение эффективности и безопасности анатоксин-вакцины путем снижения концентрации формалина с 0,8±0,2% до 0,2% для детоксикации стафилококковых и стрептококковых экзо- и эндотоксинов, а через 7-9 суток последующей детоксикации суперэнтеротоксинов 0,6±0,1% раствором этония в течение 7-9 суток.

Поставленная цель достигается путем отдельной детоксикации стафилококковых и стрептококковых экзо- и эндотоксинов со взвесью автоклавированных микроорганизмов с концентрацией 10±2 млрд/мл при 42-45°С в течение 7-9 суток с помощью 0,2% раствора формалина, и детоксикации суперэнтеротоксинов 0,6±0,1% раствором этония при 42-45°С в течение 7-9 суток с последующим смешиванием равных объемов стафилококковой и стрептококковой анатоксин-вакцин, сорбцией на гидроксиде алюминия и декантацией 50±5% надосадочной жидкости для профилактики и лечения дерматитов, ускоренного заживления ран, маститов, пневмонии, стафило-стрептококкозов птиц и плотоядных.

В патентной и научно-технической литературе не обнаружены технические решения, аналогичные заявляемому с этонием.

Применение 0,6±0,1% раствора этония (1,2-Этилен-бис-(N-диметилкарбдецилоксиметил) аммония дихлорид - бисчетвертичное аммониевое соединение) в сочетании с предварительной детоксикацией 0,2% раствором формалина в предложенном режиме позволяет достичь эффекта указанного в цели изобретения, т.е. детоксикации стафило-стрептококковых суперэнтеротоксинов и повышения вдвое концентрации полученного препарата.

Установлена возможность полной и необратимой детоксикации стафилококковых и стрептококковых экзо-, эндо- и суперэнтеротоксинов с помощью двух детоксикаторов - 0,2% раствора формалина и через 7-9 суток 0,6±0,1% раствора этония и отработана технологическая схема изготовления биопрепарата и лечебно-профилактическая эффективность конечного продукта.

Результаты детоксицирующего действия этония на весь комплекс стафилококковых и стрептококковых токсинов и лечебно-протективные свойства стафило-стрептококковой анатоксин-вакцины (ССтрАВ) представлены в следующих примерах.

Пример 1. Получение анатоксин-вакцины и определение концентрации стафилококков и стрептококков после их раздельного 12-15-суточного выращивания на жидкой синтетической среде в 2-литровых биобутылях с объемом среды, равным 1 литру, с последующим автоклавированием при 1,0 атм в течение 30 минут проводили по оптическому стандарту мутности ГНИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича.

Концентрация составляла 10,0±2,0 млрд/см³ микробных тел.

Детоксикацию экзо-, эндо- и суперэнтеротоксинов в суспензии микроорганизмов проводили последовательно двумя детоксикаторами - 0,2% раствором формалина в течение 7-9 суток при 42-45°С, а затем 0,6±0,1% раствором этония при 42-45°С в течение 7-9 суток. После детоксикации смешивали равные объемы стафилококковой и стрептококковой анатоксин-вакцин с сорбцией на 1-3 мг/мл гидроксида алюминия и увеличением концентрации инактивированных токсинов с микроорганизмами декантацией 50±5% надосадочной жидкости. Полученный препарат расфасовывали по флаконам и стерилизовали при 1,0 атм в течение 30-40 минут.

Пример 2. Стерильность препарата определяли согласно ГОСТ 28085.

В препаратах не отмечалось роста микрофлоры в течение 10-12 суток наблюдения при высеве в пробирке с МПА, МПБ и МПГБ.

Пример 3. Определение безвредности стафило-стрептококковой анатоксин-вакцины проводили с использованием белых мышей, морских свинок, бройлеров, телят и поросят путем подкожного введения препарата в дозе 0,5; 1,0; 5,0 и 10,0 см³ соответственно этим видам животных. В испытании использовано по пять животных каждого вида. Все животные оставались живыми и клинически здоровыми при наблюдении в течение 9 суток.

Пример 4. 0пределение специфической активности проводили с использованием 6 беспородных щенков 2-3-месячного возраста, 8 телят, 10 поросят и 10 бройлеров после двукратной вакцинации в дозе 5,0 см³ с интервалом 10-12 суток. Через 7-9 суток животным ввели подкожно суспензию вирулентных стафилококков и стрептококков в дозе 10 млрд/см³ микроорганизмов в объеме 0,3 см³.

В качестве контроля использовали по две головы указанных видов животных, не подвергавшиеся вакцинации.

Наблюдение проводили в течение 12-15 суток. При этом установлено, что все опытные животные оставались клинически здоровыми, а в контроле отмечена гибель 2-х бройлеров и гнойничковые поражения у остальных животных на месте заражения.

Пример 5. Испытание на заживление ожоговых ран.

В исследованиях использовано 8 голов поросят (3-4-месячного возраста). Ожог кожи в размере 5-7 см² проводили путем приложения 3-х слоев марли, смоченной 5% раствором фенола, в области средней трети шеи и бедра.

Лечение проводили путем 2-3-кратного ежедневного опрыскивания ожоговой поверхности кожи стафило-стрептококковой анатоксин-вакцины и марли, смоченной биопрепаратом.

В качестве контроля использовали медвежий жир с антибиотиками.

При этом отмечено, что начало грануляции пораженной поверхности кожи происходило на 2-3 дня раньше, чем в контроле, а полное заживление завершалось через 20-25 суток, у контрольных животных - к 25-27 дню.

Пример 6. Лечение коров, больных катаральным и гнойно-катаральным маститами.

В исследовании использовано 26 коров больных катаральным и 18 коров с гнойно-катаральным маститами. При бактериологическом исследовании выделены золотистый стафилококк, стрептококки, протей и кишечная палочка.

Лечение проводили путем интрацистернального введения стафило-стрептококковой анатоксин-вакцины два раза в сутки (утром и вечером) в дозе 4-5 мл в каждый сосок вымени.

Полное выздоровление коров, больных катаральным маститом, отмечено через 4-5 суток, а при лечении мастисаном-А через 7-8 суток, коров, больных гнойно-катаральным маститом, - через 7-8 суток, а при лечении мастисаном-А через 9-10 суток. Лечение проводили в осенне-зимний период.

Пример 7. Изучение лечебной эффективности при лечении телят, больных пневмонией.

Получение стафило-стрептококковой анатоксин-вакцины проводили путем отдельного выращивания в течение 12 суток стафилококков и стрептококков в 2-литровых биобутылях с объемом среды, равным 1 литру, до 12,0 млрд/см³ микробной концентрации и автоклавированию при 1,0 атм в течение 30 минут.

Детоксикацию экзо- и эндотоксинов вместе с микробной массой сначала проводили 0,2% раствором формалина при 42-45°С в течение 7-9 суток, а затем 0,6±0,1% раствором этония при 42-45°С в течение 7-9 суток. Завершение детоксикации всех видов токсинов, в т.ч. и суперэнтеротоксинов, которые формалин не инактивирует и, следовательно, не может перевести их в анатоксины. После завершения детоксикации проводили смешивание в равных объемах стафилококковой и стрептококковой анатоксин-вакцин, сорбцию на гидроксиде алюминия (1-3 мг/см³) и декантацию 50±5% надосадочной жидкости.

Приготовленная анатоксин-вакцина использована при лечении 18 телят, больных бронхопневмонией (учащенное дыхание до 60+5 дыхательных движений в минуту, повышение температуры до 41,5°С, кашель).

Из слизисто-гнойных истечений выделены стрептококки, золотистый стафилококк, протей. Лечение проводили путем ежедневного подкожного введения по 5-6 см³ анатоксин-вакцины с ингаляцией биопрепарата. В качестве контроля использовали амоксициллин для лечения 6 телят, больных бронхопневмонией.

Все телята, подвергнутые лечению стафило-стрептококковой анатоксин-вакциной выздоровели через 7-11 суток, а при лечении амоксициллином из 6 телят выздоровели 4 и двум телятам потребовалось еще введение линко-спектина.

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии. Способ включает выращивание микроорганизмов на жидкой синтетической среде до 10±2,0 млрд/см³ микробных тел, стерилизацию при 1,0 атм в течение 30-40 минут, детоксикацию экзо-, эндо- и суперэнтеротоксинов в суспензии микроорганизмов раствором формалина и стерилизацию. При этом раздельно выращивают стафилококки и стрептококки. Детоксикацию токсинов проводят двумя детоксикаторами - вначале 0,2% раствором формалина в течение 7-9 суток при 42-45°С, а затем 0,6±0,1% раствором этония при 42-45°С в течение 7-9 суток. Смешивают равные объемы стафилококковой и стрептококковой анатоксин-вакцин с сорбцией смеси на 1-3 мг/мл гидроксида алюминия и увеличивают вдвое концентрацию инактивированных токсинов с микроорганизмами декантацией 50±5% надосадочной жидкости. Полученная анатоксин-вакцина обладает высокой эффективностью, безвредна и используется для профилактики и лечения дерматитов, маститов, пневмоний, стафило-стрептококкозов птиц и плотоядных.

Способ получения стафило- стрептококковой анатоксин-вакцины, включающий выращивание микроорганизмов на жидкой синтетической среде до 10±2,0 млрд/см³ микробных тел, стерилизацию при 1,0 атм. в течение 30-40 мин, детоксикацию экзо-, эндо и суперэнтеротоксинов в суспензии микроорганизмов раствором формалина, стерилизацию, отличающийся тем, что раздельно выращивают стафилококки и стрептококки, детоксикацию токсинов проводят двумя детоксикаторами - вначале 0,2%-ным раствором формалина в течение 7-9 суток при 42-45°С, а затем 0,6±0,1%-ным раствором этония при 42-45°С в течение 7-9 суток, смешивают равные объемы стафилококковой и стрептококковой анатоксин-вакцин, с сорбцией смеси на 1-3 мг/мл гидроксида алюминия, и увеличивают вдвое концентрацию инактивированных токсинов с микроорганизмами декантацией 50±5% надосадочной жидкости.